从小鼠肝外胆管生成类器官

摘要

本方案描述了小鼠肝外胆管三维类器官系统的构建方法。这些胆管类器官可在体外培养中维持生长，用于研究胆管上皮细胞的生物学特性。胆管类器官表达胆管前体细胞和成熟胆管细胞的标志物，并由具有极性的上皮细胞组成。

摘要

影响肝外胆管（EHBDs）的胆管疾病包括胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎和胆管癌，目前尚无有效的治疗手段。用于研究肝外胆管的工具极为有限。我们的目的是建立一种器官特异性强、用途广泛、来源于成体干细胞的临床前胆管细胞模型，该模型可轻松地从野生型和基因工程小鼠中获得。因此，我们报道了一种新型的从成年小鼠肝外胆管建立肝外胆管类器官（EHBDO）培养体系的技术。该模型成本低廉、易于分析，并具有多种下游应用价值。具体而言，本文描述了小鼠肝外胆管的分离与单细胞解离、类器官培养的起始、扩增以及长期维持与保存的方法。本论文还介绍了对EHBDO进行免疫组织化学、荧光显微镜观察，以及通过实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测mRNA丰度的处理流程。除可生成肝外胆管特异性的类器官外，该模型还具有多项显著优势：使用L-WRN细胞的条件培养基显著降低了模型成本；利用小鼠肝外胆管可提供几乎无限的培养组织来源，而不同于人类组织。所获得的小鼠EHBDO包含一群纯度较高的上皮细胞，表达内胚层前体细胞及分化胆管细胞的标志物。培养的类器官在多次传代过程中保持形态均一，并可在液氮中长期冻存后成功复苏。该模型可用于研究胆管前体细胞的增殖，可进行药理学干预，并可由基因工程小鼠构建。未来的研究需进一步优化培养条件，以提高接种效率、评估细胞功能成熟度并引导细胞定向分化。同时，建立共培养模型以及使用更具生物学中性的细胞外基质也是值得追求的方向。

引言

胆管病变是一类无法治愈的慢性进行性疾病，影响位于肝内和肝外胆管（EHBDs）的胆管细胞¹。某些胆管病变，如原发性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道闭锁和胆总管囊肿，主要累及肝外胆管。由于缺乏足够的临床前模型，胆管病变的治疗开发受到限制。此外，以往关于胆管病变的研究通常将肝脏、肝内胆管和肝外胆管合并分析。然而，肝内和肝外胆管具有不同的胚胎起源，因此应被视为不同的分子病理实体。肝内胆管起源于肝内导管板和肝憩室的头端部分，而肝外胆管则起源于肝憩室的尾端部分²。在成体稳态维持中，它们也依赖不同的前体细胞区室，包括肝内胆管中的赫林管（canals of Hering）和肝外胆管中的胆管周围腺体（peribiliary glands）^2,3。动物模型在临床前研究中的应用受到成本限制，并且出于伦理考虑应尽量减少使用。因此，亟需建立简化、可重复、高效且经济的体外模型。

以往大多数关于胆管疾病的研究所采用的是正常小鼠或大鼠的癌症模型，或来源于肝内及肝外胆管的胆管癌细胞系^4,5,6,

方案

本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 小鼠EHBD分离所需仪器与材料的准备

1. 在50 mL锥形管中配制接种培养基和洗涤缓冲液（材料表），并在使用前置于4 °C或冰上保存。
2. 设置手术台（图1B），准备灭菌的手术器械（图1C）。
3. 将无菌的24孔板放入37 °C细胞培养箱中预热。
4. 将基底膜基质分装液置于冰上，仅在完全液化后使用。

2. EHBD 分离与胆道类器官培养

1. 小鼠EHBD单细胞悬液的分离与制备
   1. 根据机构指南实施安乐死处理一只成年小鼠（年龄大于2个月）。将小鼠仰卧位固定，沿腹中线切开腹腔，并将肝脏向上推至膈肌处。
   2. 用止血钳轻轻牵拉近端十二指肠，辨认位于肝门下方的总胆管。使用手术刀片将EHBD从周围组织中分离。用镊子夹住总胆管近端，从其与十二指肠连接处近端开始向远端解剖，随后将胆管近端从肝脏分离（图1D）。立即把分离出的EHBD（

结果

本方案描述了源自成体干细胞、具有组织特异性的成年小鼠EHBD类器官的构建方法。类器官培养后，自EHBD分离之日起1天内即可观察到囊状结构的形成。培养过程中通常不会出现成纤维细胞污染。无论是从新生小鼠还是成年小鼠（年龄大于2个月）中分离，EHBDO的接种效率均约为2%图2B）。源自成年小鼠的EHBD类器官在第2代传代时铺板效率提高至11%，并保持稳定（图2B）。大多数类器官在所有传代过程中均表现出囊性形态，仅偶见“不规则”类器官（图2C-）。类器官在培养5-7天后达到生长高峰，随后开始积聚管腔内碎片并逐渐退化（图 2A因此，为了维持类器官培养，应每隔7-10天传代一次（图2A)。一旦建立并适当处理，类器官可在培养中几乎无限期地维持（已观察到长达1.......

讨论

本研究描述了小鼠肝外胆管（EHBD）胆管上皮细胞的类器官三维模型的构建方法。构建EHBDO培养物的关键步骤包括精细的EHBD解剖以避免胰腺细胞污染、维持无菌条件以防止细菌和真菌污染，以及离心后小心操作以避免细胞材料丢失。必须严格遵守所述的温度条件。该技术存在一些局限性。成年小鼠的EHBD体积较小（直径约1 mm；图1E），分离时需要较高的操作技巧。可使用解剖显微镜辅助解剖过程。

本实验方案中使用的基底膜基质是一种含有已知和未知生长因子的生物基质¹⁹，其浓度可能因批次不同而存在差异。我们建议，在进行技术重复实验时，应使用相同批次和/或同一份基底膜基质，以避免实验变异性。同时，我们建议定期检测L-WRN细胞培养物是否支原体污染，并检测条件培养基中的WNT活性¹¹。本研究所使用的实验室分别采用了支原体检测试剂盒和WNT活性检测试剂。值得注意的是，EHBDOs培养基中含有少量胎牛血清（0.5%；材料表）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-WRN 细胞培养基
Advanced DMEM/F12		Life Technologies	12634-010
胎牛血清（FBS）	1%	Life Technologies	10437-028
青霉素-链霉素	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
洗涤缓冲液
磷酸盐缓冲液（PBS）	50 mL	Life Technologies	10010-023
青霉素-链霉素	125 U/mL	Life Technologies	15140-122
两性霉素B	6.25 µg/mL	Life Technologies	15290-018
类器官培养基
L-WRN 条件培养基	1:1	ATCC	CRL-3276
Advanced DMEM/F12	1:1	Life Technologies	12634-010
青霉素-链霉素	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
N-谷氨酰胺	10 µl/mL	Life Technologies	35050-061
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）	10 mM	Life Technologies	15630-080
B27	10 µl/mL	Gibco	17504-044
N2	10 µl/mL	Gibco	17502-048
类器官接种培养基
类器官培养基
表皮生长因子（EGF）	50 ng/mL	Invitrogen	PMG8041
成纤维细胞生长因子-10（FGF10）	100 ng/mL	PeproTech	100-26
一抗
抗细胞角蛋白19（CK19）抗体，兔源	1:250	Abcam	ab53119
性别决定区Y框蛋白9（SOX9）抗体，兔源	1:200	Santa Cruz	sc-20095
胰十二指肠同源盒1（PDX1）抗体，兔源	1:2000	DSRB	F109-D12
E-钙黏蛋白抗体，山羊源	1:500	Santa Cruz	sc-31020
乙酰化α-微管蛋白抗体，小鼠源	1:500	Sigma-Aldrich	T6793
二抗
488标记的驴抗兔IgG	1:1000	Invitrogen	A-21206
594标记的驴抗山羊IgG	1:1000	Invitrogen	A-11058
568标记的山羊抗小鼠IgG2b	1:500	Invitrogen	A-21144
TopFlash Wnt 报告基因检测
TopFlash HEK293 细胞系		ATCC	CRL-1573
荧光素酶检测试剂盒		Biotium	30003-2
0.05% 胰蛋白酶-EDTA		Life Technologies	25300054
0.4% 台盼蓝溶液		Life Technologies	15250061
其他材料与试剂
基底膜基质，无酚Matrigel		CORNING	356237
解离缓冲液，Accutase		Gibco	A1110501
细胞冻存液，Recovery		Life Technologies	12648010
细胞筛（70 µm，无菌）		Fisherbrand	22363548
硫氰酸胍-苯酚法RNA提取试剂，TRIzol		Invitrogen	15596026
组织处理凝胶，HistoGel		Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012
通用支原体检测试剂盒		ATCC	30-1012K
1.5 mL 微量离心管		Fisherbrand	05-408-129
24孔板		USA Scientific	CC7682-7524
50 mL 锥形离心管		Fisher scientific	14-432-22
荧光显微镜		Nikon	Eclipse E800
倒置显微镜		Biotium	30003-2
解剖托盘		Fisherbrand	13-814-61