液滴数字TRAP（ddTRAP）：端粒重复扩增实验方案在液滴数字聚合酶链式反应中的应用

摘要

我们成功将标准的端粒重复扩增方案（TRAP）检测改造为可用于微滴数字聚合酶链式反应。这种新检测方法称为ddTRAP，具有更高的灵敏度和定量能力，可更有效地检测多种人类细胞中的端粒酶活性，并进行更可靠的统计分析。

摘要

端粒重复扩增程序（TRAP）是检测特定样本中端粒酶活性最常用的实验方法。这种基于聚合酶链式反应（PCR）的方法能够对大多数细胞裂解液中的酶活性进行可靠的测定。传统的基于凝胶的TRAP方法使用荧光标记引物，限制了样本通量，且仅能检测酶活性两倍或更大的变化。而液滴数字TRAP（ddTRAP）是一种高灵敏度的方法，由传统TRAP assay改进而来，使用户能够在单次运行中对96个样本进行稳健分析，并实现对每个PCR反应中DNA（即端粒酶延伸产物）输入量的绝对定量。因此，新开发的ddTRAP assay克服了传统凝胶基TRAP assay的局限性，在实验室和临床环境中提供了更高效、更准确和更定量的端粒酶活性检测手段。

引言

端粒是位于线性染色体末端的动态DNA-蛋白质复合物。人类端粒由一系列5'-TTAGGG_n六核苷酸重复序列组成，其长度在出生时约为12–15千碱基（kb）¹。人类端粒酶是一种维持端粒结构的核糖核蛋白酶，最初在HeLa细胞裂解液（癌细胞系）中被发现²。端粒与端粒酶共同在基因组保护、基因调控以及癌细胞永生化等多种生物学过程中发挥重要作用^3,4,5,6。

人类端粒酶主要由两个关键组分构成，即端粒酶逆转录酶和端粒酶RNA（分别为hTERT和hTERC）。其中，蛋白质亚基hTERT是端粒酶中具有催化活性的逆转录酶组分。RNA模板hTERC则为端粒酶提供模板，用于延伸和/或维持端粒。大多数人类体细胞中无法检测到端粒酶活性。由于DNA聚合酶无法延伸DNA滞后链的末端，加之缺乏端粒酶，导致每次细胞分裂后端粒逐渐缩短。这些现象使得大多数体细胞的端粒持续缩短，直至达到临界长度，细胞由此进入复制性衰老状态。细胞可分裂的最大次数由其端粒长度决定，这种对持续分裂的阻断被认为可防止向肿瘤发生发展⁷

方案

1. 缓冲液的制备与保存

1. 配制 50 mL 1x 去RNase/DNase的NP-40裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，1 mM MgCl₂，1% NP-40，0.5% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]丙磺酸，10% 甘油，5 mM 2-巯基乙醇，1× 蛋白酶抑制剂混合物）₂，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），1% [体积/体积] NP-40，10% [体积/体积] 甘油，150 mM NaCl，5 mM β-巯基乙醇和0.1 mM 4-苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF））。该缓冲液可分装后于-20℃保存 °C 以备将来使用。为获得最佳的细胞裂解效果，应避免反复冻融。
2. 配制 50 mL 10 倍浓缩的无 RNase/DNase TRAP 延伸缓冲液（200 mM Tris-HCl [pH 8.0]，15 mM MgCl₂，630 mM KCl，10 mM EGTA，50 mM DTT，5% CHAPS）₂，630 mM KCl，0.5% [体积/体积] Tween 20，以及10 mM 乙二醇双(β-氨基乙基醚-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA））。该缓冲液可分装为每份1 mL，于-20℃保存。 °C 以供将来使用。

2. 细胞裂解

1. 细胞的制备

结果

使用ddTRAP，在以下细胞系组成的细胞面板中检测了端粒酶活性（图1）：非小细胞肺癌（H2882、H1299、Calu6、H920、A549 和 H2887）、小细胞肺癌（H82 和 SHP77）以及端粒酶阴性的成纤维细胞（BJ）。将一百万个细胞的沉淀用NP-40裂解缓冲液裂解后，以生物学三复孔进行端粒酶延伸反应。一个常用且强烈推荐的阴性对照是“NTC”（无模板对照）。该样本通过向端粒酶延伸反应体系中加入NP-40裂解缓冲液（2 µL），并以与其他含实际细胞裂解液的样本相同的方式处理延伸产物而获得。此样本可帮助使用者扣除背景信号（如有），从而更准确地定量端粒酶活性。尽管本图未显示，另一种阴性对照方法是在端粒酶延伸反应前将细胞裂解液在95°C加热失活5分钟。若细胞或样本量充足，建议优先采用此阴性对照方法。

通过测量液滴乳液中每个液滴的荧光强度，液滴读取仪可利用泊松分布估算输入分子的浓度（分子/微.......

讨论

端粒酶活性的测定对于众多研究领域至关重要，包括但不限于癌症、端粒生物学、衰老、再生医学以及基于结构的药物设计。即使在癌细胞中，端粒酶核糖核蛋白复合物（telomerase RNPs）的丰度也很低，这使得该酶的检测与研究具有挑战性。本文中，我们详细描述了新开发的数字液滴式TRAP（ddTRAP）检测技术的逐步操作流程，以可靠地定量细胞中的端粒酶活性。通过将传统的端粒酶延伸反应与数字液滴PCR（ddPCR）相结合，我们能够在肺癌细胞中定量检测端粒酶活性（即端粒酶延伸产物）。

ddTRAP 检测基于与 TRAP 检测相同的原理。通过在非离子型去污剂（NP-40）裂解缓冲液中裂解细胞获得细胞裂解物，以保持端粒酶活性，随后用于对“TS”底物/引物进行端粒酶延伸反应。ddTRAP 的创新之处在于 PCR 前形成微滴。将样本分割成微滴可实现对每个细胞中端粒酶活性的绝对定量。

使用数字液滴式TRAP（ddTRAP）检测了肺癌细胞系中的端粒酶活性。基于凝胶的TRAP检测方法的一个主要局限性是单次可处理的样本数量。大多数凝胶梳子最多只能容纳20个.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	无RNA酶/DNA酶
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	无RNA酶/DNA酶
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	无RNA酶/DNA酶
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% 超纯甘油	Invitrogen	15514011	无RNA酶/DNA酶
苯甲基磺酰氟	Thermo Scientific	36978	粉末
2-巯基乙醇	SIGMA-ALDRICH	516732
无核酸酶水（Nuclease Free H20）	Ambion	AM9932	无RNA酶/DNA酶
2.5 mM dNTP 混合液	Thermo Scientific	R72501	每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5 mM
2 M KCl	Ambion	AM9640G	无RNA酶/DNA酶
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	无RNA酶/DNA酶
端粒酶底物（TS）引物	Integrated DNA Technology (IDT)	定制引物（HPLC纯化）	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX（反向）引物	Integrated DNA Technology (IDT)	定制引物（HPLC纯化）	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
薄壁（250 µl）PCR级管	USA Scientific	1402-2900	条板、板、管等
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96孔板	Fisher	Eppendorf 951020362
可穿刺铝箔热封膜	Bio Rad	1814040
液滴生成器芯片（DG8）	Bio Rad	1863008
液滴生成油	Bio Rad	1863005
液滴生成器垫圈	Bio Rad	1863009
96孔热循环仪 T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR板封膜机	Bio Rad	1814000
QX200 液滴读取仪及Quantasoft软件	Bio Rad	1864001 和 1864003
ddPCR液滴读取仪用油	Bio Rad	1863004
无核酸酶滤芯吸头	Thermo Scientific		10 µl、20 µl、200 µl 和 1000 µl