我们成功将标准的端粒重复扩增方案（TRAP）检测改造为可用于微滴数字聚合酶链式反应。这种新检测方法称为ddTRAP，具有更高的灵敏度和定量能力，可更有效地检测多种人类细胞中的端粒酶活性，并进行更可靠的统计分析。
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摘要
摘要
端粒重复扩增程序（TRAP）是检测特定样本中端粒酶活性最常用的实验方法。这种基于聚合酶链式反应（PCR）的方法能够对大多数细胞裂解液中的酶活性进行可靠的测定。传统的基于凝胶的TRAP方法使用荧光标记引物，限制了样本通量，且仅能检测酶活性两倍或更大的变化。而液滴数字TRAP（ddTRAP）是一种高灵敏度的方法，由传统TRAP assay改进而来，使用户能够在单次运行中对96个样本进行稳健分析，并实现对每个PCR反应中DNA（即端粒酶延伸产物）输入量的绝对定量。因此，新开发的ddTRAP assay克服了传统凝胶基TRAP assay的局限性，在实验室和临床环境中提供了更高效、更准确和更定量的端粒酶活性检测手段。
引言
端粒是位于线性染色体末端的动态DNA-蛋白质复合物。人类端粒由一系列5'-TTAGGGn六核苷酸重复序列组成，其长度在出生时约为12–15千碱基（kb）1。人类端粒酶是一种维持端粒结构的核糖核蛋白酶，最初在HeLa细胞裂解液（癌细胞系）中被发现2。端粒与端粒酶共同在基因组保护、基因调控以及癌细胞永生化等多种生物学过程中发挥重要作用3,4,5,6。
人类端粒酶主要由两个关键组分构成，即端粒酶逆转录酶和端粒酶RNA（分别为hTERT和hTERC）。其中，蛋白质亚基hTERT是端粒酶中具有催化活性的逆转录酶组分。RNA模板hTERC则为端粒酶提供模板，用于延伸和/或维持端粒。大多数人类体细胞中无法检测到端粒酶活性。由于DNA聚合酶无法延伸DNA滞后链的末端，加之缺乏端粒酶，导致每次细胞分裂后端粒逐渐缩短。这些现象使得大多数体细胞的端粒持续缩短，直至达到临界长度，细胞由此进入复制性衰老状态。细胞可分裂的最大次数由其端粒长度决定，这种对持续分裂的阻断被认为可防止向肿瘤发生发展7。癌细胞能够克服端粒诱导的复制性衰老，通过利用端粒酶维持其端粒长度而持续增殖。大约90%的癌症会激活端粒酶，因此端粒酶活性在癌症的检测与治疗中具有至关重要的意义。
20世纪90年代TRAP检测技术的发展对于鉴定端粒酶所必需的组分，以及在多种正常和癌变细胞与组织中测量端粒酶活性起到了关键作用。最初的基于凝胶的PCR检测方法采用放射性标记的DNA底物来检测端粒酶活性。2006年，该检测被改进为使用荧光标记底物的非放射性形式8,9。通过使用荧光标记的底物，用户可通过将凝胶暴露于适当的激发波长下，观察到端粒酶延伸产物在凝胶上呈现的条带。TRAP检测具有较高的灵敏度，并可在粗制细胞裂解液中检测端粒酶活性，因此成为目前应用最广泛的端粒酶活性检测方法。然而，TRAP检测也存在局限性。该方法依赖凝胶电泳，使得在中高通量研究中难以完成必要的重复实验，因而很少能实现适当的统计学分析。此外，由于无法可靠检测样品间小于两倍的端粒酶活性差异，基于凝胶的检测方法难以进行准确的定量分析。克服上述两项局限性，对于将TRAP等酶活性检测技术应用于临床或工业环境——例如在患者样本分析或药物设计研究中检测端粒酶活性——至关重要。
数字PCR最初于1999年开发，旨在将PCR的指数级模拟特性转化为线性数字化检测方法10。微滴数字PCR（ddPCR）是原始数字PCR技术的最新发展。随着先进微流控技术和水包油乳液化学的进步，能够稳定生成大小均一的微滴，从而实现了ddPCR。与基于凝胶的方法甚至定量PCR（qPCR）不同，ddPCR可对输入材料进行绝对定量。ddPCR的关键在于通过将样品分割成微滴，生成约20,000个独立的反应。在终点PCR完成后，微滴读取仪以类似流式细胞仪的方式逐个扫描每个微滴，计数、测量大小，并记录每个微滴中荧光的有无（即每个微滴中是否存在PCR扩增子）。随后，利用泊松分布，根据阳性微滴数与总微滴数的比例估算输入分子的数量。该数值代表了每个PCR反应中输入分子数量的估计值。此外，ddPCR在96孔板上进行并完成分析，使用户能够同时运行多个样本，并进行生物学重复和技术重复，以实现适当的统计分析。因此，我们将ddPCR强大的定量能力与中等通量特性相结合，并与TRAP检测技术整合，开发出ddTRAP检测方法11。该检测方法旨在帮助用户研究并稳健地定量来自生物样本的端粒酶绝对活性11,12。ddTRAP的高灵敏度使其能够从数量有限且珍贵的样本中定量端粒酶活性，包括单细胞水平的测量。此外，用户还可利用该方法以绝对定量方式研究端粒酶调控和/或药物处理的影响，检测小于两倍的变化（约50%的差异）。ddTRAP是TRAP检测技术顺应现代实验室实验和临床环境中数字化与高通量需求的自然演进。
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方案
1. 缓冲液的制备与保存
- 配制 50 mL 1x 去RNase/DNase的NP-40裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，1 mM MgCl₂，1% NP-40，0.5% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]丙磺酸，10% 甘油，5 mM 2-巯基乙醇，1× 蛋白酶抑制剂混合物）2，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），1% [体积/体积] NP-40，10% [体积/体积] 甘油，150 mM NaCl，5 mM β-巯基乙醇和0.1 mM 4-苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF））。该缓冲液可分装后于-20℃保存 °C 以备将来使用。为获得最佳的细胞裂解效果，应避免反复冻融。
- 配制 50 mL 10 倍浓缩的无 RNase/DNase TRAP 延伸缓冲液（200 mM Tris-HCl [pH 8.0]，15 mM MgCl₂，630 mM KCl，10 mM EGTA，50 mM DTT，5% CHAPS）2，630 mM KCl，0.5% [体积/体积] Tween 20，以及10 mM 乙二醇双(β-氨基乙基醚-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA））。该缓冲液可分装为每份1 mL，于-20℃保存。 °C 以供将来使用。
2. 细胞裂解
- 细胞的制备
- 解冻一份冷冻的NP-40裂解缓冲液。解冻后，将裂解缓冲液置于冰上。向NP-40裂解缓冲液中加入苯甲基磺酰氟（PMSF蛋白酶抑制剂），使其终浓度达到0.2 mM。
注意：应在裂解细胞前立即进行此步骤。 - 从收集的细胞沉淀中去除多余的液体，以确保细胞沉淀干燥。注意，无论是 freshly collected 还是 previously frozen (-80 °C 或在液氮中速冻2），不得含有先前离心步骤中残留的任何溶液，因为这些溶液可能会干扰后续实验操作。
- 培养、收集并冻存端粒酶阳性与端粒酶阴性细胞系（BJ成纤维细胞、IMR-90或U2OS），用作阳性和阴性对照。每次进行实验时均应使用新鲜的对照裂解物，以确保实验的可重复性。
注意：建议在冷冻前大量培养端粒酶阴性细胞并进行分装，以消除细胞系长期培养过程中可能引入的组织培养相关干扰因素，从而确保阴性对照样本结果的可重复性。 - 将细胞沉淀置于冰上。如果细胞 previously 经冷冻，请在冰上短暂解冻。
注意：ddTRAP 实验中典型的细胞沉淀量为 500,000 至 1,000,000 个细胞。必要时也可使用较小的细胞沉淀，但必须/最好已知细胞数量。ddTRAP 也可根据蛋白投入量进行，通过 BCA 蛋白测定法确定投入量（通常为 1 µg).
- 解冻一份冷冻的NP-40裂解缓冲液。解冻后，将裂解缓冲液置于冰上。向NP-40裂解缓冲液中加入苯甲基磺酰氟（PMSF蛋白酶抑制剂），使其终浓度达到0.2 mM。
- 细胞裂解
- 在NP-40裂解缓冲液中裂解细胞，保持每微升25,000个细胞的等效浓度µ微升缓冲液中。例如，将含有1,000,000个细胞的沉淀物溶于40 µNP-40裂解缓冲液L。轻柔吹打裂解液上下混合，以充分裂解细胞。尽量避免产生气泡。
- 将细胞置于冰上裂解30分钟。为防止细胞碎片聚集成团，需轻轻涡旋混匀裂解液，每隔10分钟操作一次，以保持裂解液的均匀混合状态。
- 稀释细胞裂解物（25,000 个细胞/μL）µL) 用NP-40裂解缓冲液按1:20稀释，使新的细胞当量为1,250个细胞/μLµ例如，稀释 5 µL 细胞裂解液加入 95 µL 裂解缓冲液
3. 端粒酶延伸反应
- 准备端粒酶延伸反应的预混液（每反应体系）（表1）。
注意：建议在细胞裂解过程中配制延伸反应预混液，并将其置于冰上保存。- 将48 µL延伸反应预混液移入每个PCR管中。
- 向延伸反应体系中加入2 µL稀释后的裂解液（1,250个细胞/µL）。此时总体积应为50 µL，最终细胞浓度相当于50个细胞/µL。
- 进行端粒酶延伸反应（表2）。
- 延伸产物可在4 °C保存3–5天；但建议在24小时内使用，以获得最佳效果。
4. 微滴数字PCR设置
- 准备ddTRAP的主混合液（每反应体系，见表3）。
注意：试剂恢复至室温后，请勿将其或主混合液置于冰上。将混合液置于冰上可能会增加黏度，导致液滴形成不良。ddPCR超级混合液中的DNA聚合酶为热启动型，可在室温下保持稳定。ddPCR超级混合液在从-20 °C初次解冻后可保存于4 °C。- 向每个PCR管中加入19.8 µL ddPCR主混合液。
- 向每管中加入2.2 µL延伸反应产物。注意此时总体积应为22 µL。
注意：进行ddTRAP检测所需的样品总量为20 µL（相当于100个细胞）。额外体积是为了防止移液误差或样品损失。
- 设置液滴生成卡盒。
注意：卡盒包含三个标有标签的不同列孔。- 将根据步骤4.1.2制备的20 µL反应液加入卡盒的样品孔（中间孔）中。移液时避免产生气泡。
注意：若出现气泡，可轻轻敲击卡盒侧面，使气泡上升至溶液表面。 - 向油孔（左侧孔）中加入70 µL液滴生成油。
注意：为避免污染，务必使用独立的移液器和吸头进行ddPCR液滴生成步骤。加样顺序至关重要：必须先加入样品再加入油，因为油密度较大，若先加油会填充微流控腔室，导致液滴生成不佳。最少可运行8个样品。卡盒的所有孔都必须加样，任何空孔都会导致液滴生成仪停止生成液滴。若样品数量不足以填满卡盒中的全部8个孔，可在剩余孔中加入20 µL ddTRAP主混合液（步骤4.1）。 - 通过将垫圈固定在卡盒两端，确保其位置正确。
注意：若未安装垫圈或安装不当，将导致仪器无法生成液滴。 - 将装载并组装好的卡盒放入液滴生成仪中。
注意：卡盒通过仪器内的磁铁识别，当卡盒放置正确时，仪器会提示用户。
- 将根据步骤4.1.2制备的20 µL反应液加入卡盒的样品孔（中间孔）中。移液时避免产生气泡。
- 待液滴生成完成且程序结束（约60–90秒）后，取出卡盒。
- 小心地从卡盒上取下垫圈。使用多通道移液器将新生成的液滴（右侧孔）转移至96孔PCR板中。
注意：新生成的液滴乳液体积约为40–43 µL。 - 当所有样品均加入96孔板后，立即使用铝箔PCR板封膜进行热封，以防止PCR过程中发生蒸发。
- 小心地从卡盒上取下垫圈。使用多通道移液器将新生成的液滴（右侧孔）转移至96孔PCR板中。
- 将96孔板放入热循环仪，并执行以下PCR反应（见表4）。
注意：各温度步骤之间的升温速率必须设置为2.5 °C/s，以确保反应体系充分受热。
5. 端粒酶延伸产物的检测
- 将96孔板放入液滴读取仪中。
注意：确保正确放置孔板，使A1样本与支架上的位置对应。- 打开液滴读取仪配套的软件。双击第一个孔A1，打开样本/孔编辑界面。
- 点击Experiment，然后从下拉菜单中选择ABS。
注意：Experiment用于定义所使用的检测类型（即绝对定量或基因拷贝数检测）。ABS代表绝对定量。 - 选择QX200 ddPCR Evagreen Supermix，以确保读取仪采用正确的检测方法。点击孔编辑界面右下角的Apply，将用户定义的设置保存至所有高亮显示的孔中。
注意：SUPERMIX用于定义读取仪将识别的PCR混合液类型及检测化学体系。 - 在软件的孔编辑界面中点击TARGET，以定义样本。
- 通过点击TARGET下拉菜单并选择unknown、reference或NTC（无模板对照），来定义样本的TYPE。
注意：Unknown指实验样本，reference可为已知端粒酶活性的对照样本，而NTC是判断检测有效性（如污染和背景信号）的关键对照。 - 在Sample Name部分为所有样本命名，并点击Apply，以确保高亮孔被正确编辑。
- 点击Run以运行/读取孔板。当系统提示时，在RUN OPTIONS界面中选择Columns或Rows，以告知仪器应按何种方向读取孔板。
6. 数据分析
- 通过单击各个孔来确定每个样本的“已接受液滴”数量。双击各个孔或列/行标题以查看和分析样本数据。
注意：判断是否继续分析某个样本的最重要标准是“已接受液滴”的数量。对于 ddTRAP，若样本的已接受液滴数达到 10,000 或以上，则可用于进一步分析。系统可向用户提供多种格式的数据，包括 .csv 表格、.jpg 图像、直方图等。目前已有多种资源可用于深入分析 ddPCR 数据，包括 ddTRAP11,13。这些资源提供了分析 ddTRAP 数据的指南，涵盖阈值设定11,13、选择用于进一步分析的样本11,13、识别假阳性与假阴性结果13以及常规故障排查13等内容。 - 高亮显示代表样本重复孔及无模板对照（NTC）样本的孔。将样本与 NTC 或阴性对照组（如步骤 2.1.2 中列出的 BJ 细胞）进行比较分析。
- 通过点击屏幕左下角的“设置阈值”图标，手动为样本设置阈值。可为单个孔设置阈值，也可同时为多个孔设置阈值（推荐做法）。
注意：若在 NTC 中检测到背景信号，可将其从所有其他样本中扣除，以“归一化”信号，确保仅分析真实的阳性信号。在 NP-40 裂解缓冲体系中，NTC 的典型值范围为 0.2–1 分子/µL。其他缓冲体系及组分需另行测试（例如 CHAPS 缓冲液）。
- 通过点击屏幕左下角的“设置阈值”图标，手动为样本设置阈值。可为单个孔设置阈值，也可同时为多个孔设置阈值（推荐做法）。
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结果
使用ddTRAP，在以下细胞系组成的细胞面板中检测了端粒酶活性（图1）：非小细胞肺癌（H2882、H1299、Calu6、H920、A549 和 H2887）、小细胞肺癌（H82 和 SHP77）以及端粒酶阴性的成纤维细胞（BJ）。将一百万个细胞的沉淀用NP-40裂解缓冲液裂解后，以生物学三复孔进行端粒酶延伸反应。一个常用且强烈推荐的阴性对照是“NTC”（无模板对照）。该样本通过向端粒酶延伸反应体系中加入NP-40裂解缓冲液（2 µL），并以与其他含实际细胞裂解液的样本相同的方式处理延伸产物而获得。此样本可帮助使用者扣除背景信号（如有），从而更准确地定量端粒酶活性。尽管本图未显示，另一种阴性对照方法是在端粒酶延伸反应前将细胞裂解液在95°C加热失活5分钟。若细胞或样本量充足，建议优先采用此阴性对照方法。
通过测量液滴乳液中每个液滴的荧光强度，液滴读取仪可利用泊松分布估算输入分子的浓度（分子/微...
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讨论
端粒酶活性的测定对于众多研究领域至关重要，包括但不限于癌症、端粒生物学、衰老、再生医学以及基于结构的药物设计。即使在癌细胞中，端粒酶核糖核蛋白复合物（telomerase RNPs）的丰度也很低，这使得该酶的检测与研究具有挑战性。本文中，我们详细描述了新开发的数字液滴式TRAP（ddTRAP）检测技术的逐步操作流程，以可靠地定量细胞中的端粒酶活性。通过将传统的端粒酶延伸反应与数字液滴PCR（ddPCR）相结合，我们能够在肺癌细胞中定量检测端粒酶活性（即端粒酶延伸产物）。
ddTRAP 检测基于与 TRAP 检测相同的原理。通过在非离子型去污剂（NP-40）裂解缓冲液中裂解细胞获得细胞裂解物，以保持端粒酶活性，随后用于对“TS”底物/引物进行端粒酶延伸反应。ddTRAP 的创新之处在于 PCR 前形成微滴。将样本分割成微滴可实现对每个细胞中端粒酶活性的绝对定量。
使用数字液滴式TRAP（ddTRAP）检测了肺癌细胞系中的端粒酶活性。基于凝胶的TRAP检测方法的一个主要局限性是单次可处理的样本数量。大多数凝胶梳子最多只能容纳20个...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）（NCI-R00-CA197672-01A1）提供的经费支持。小细胞肺癌细胞系（SHP77 和 H82）由德克萨斯大学西南医学中心的 John Minna 博士和 Adi Gazdar 博士慷慨惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | 无RNA酶/DNA酶 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | 无RNA酶/DNA酶 |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | 无RNA酶/DNA酶 |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% 超纯甘油 | Invitrogen | 15514011 | 无RNA酶/DNA酶 |
| 苯甲基磺酰氟 | Thermo Scientific | 36978 | 粉末 |
| 2-巯基乙醇 | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| 无核酸酶水（Nuclease Free H20） | Ambion | AM9932 | 无RNA酶/DNA酶 |
| 2.5 mM dNTP 混合液 | Thermo Scientific | R72501 | 每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5 mM |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | 无RNA酶/DNA酶 |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | 无RNA酶/DNA酶 |
| 端粒酶底物（TS）引物 | Integrated DNA Technology (IDT) | 定制引物（HPLC纯化） | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX（反向）引物 | Integrated DNA Technology (IDT) | 定制引物（HPLC纯化） | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| 薄壁（250 µl）PCR级管 | USA Scientific | 1402-2900 | 条板、板、管等 |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96孔板 | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| 可穿刺铝箔热封膜 | Bio Rad | 1814040 | |
| 液滴生成器芯片（DG8） | Bio Rad | 1863008 | |
| 液滴生成油 | Bio Rad | 1863005 | |
| 液滴生成器垫圈 | Bio Rad | 1863009 | |
| 96孔热循环仪 T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR板封膜机 | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 液滴读取仪及Quantasoft软件 | Bio Rad | 1864001 和 1864003 | |
| ddPCR液滴读取仪用油 | Bio Rad | 1863004 | |
| 无核酸酶滤芯吸头 | Thermo Scientific | 10 µl、20 µl、200 µl 和 1000 µl |
参考文献
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