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从培养的贴壁细胞中提取水溶性代谢物用于毛细管电泳-质谱法进行代谢组学分析

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DOI：

10.3791/59551

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2019年6月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shonai Regional Industry Promotion Center, 2Tsuruoka Metabolomics Laboratory, National Cancer Center, 3Human Metabolome Technologies, Inc, 4Division of Translational Informatics, Exploratory Oncology Research and Clinical Trial Center, National Cancer Center

本文内容

摘要

本文的目的是描述一种从培养的贴壁细胞中提取水溶性代谢物以进行代谢组学分析（特别是毛细管电泳-质谱分析）的实验方案。

摘要

代谢组学分析是一种具有前景的组学方法，不仅可用于理解癌细胞与正常细胞之间特定的代谢调控差异，还可用于发现早期癌症检测的生物标志物以及预测癌症患者对化疗的反应。代谢组学分析中均一样本的制备仍是一个亟待解决的关键问题。本文介绍了一种简便且可靠的实验方案，用于从培养的贴壁细胞中提取水溶性代谢物，并通过毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）进行代谢组学分析。通过培养和洗涤细胞、以甲醇处理细胞、提取代谢物，并利用离心柱去除蛋白质和大分子物质，从而获得适用于CE-MS分析的细胞水溶性代谢物。以双亚胺基化合物（diamide，一种氧化试剂）处理肺癌细胞系的代表性结果表明，在氧化应激条件下细胞的代谢状态发生了明显可观察的转变。本文尤其适用于刚开始从事代谢组学研究、并希望掌握从细胞系中收获代谢物以进行CE-MS分析的学生和科研人员。

引言

奥托·瓦尔堡（Otto Warburg）观察到，癌细胞获得了一种异常能力，即在氧气充足的情况下仍能摄取葡萄糖并将其发酵生成乳酸，这一现象被称为瓦尔堡效应或有氧糖酵解1,2。人们推测，线粒体呼吸功能缺陷是癌细胞有氧糖酵解的潜在基础3。事实上，瓦尔堡效应构成了氟代脱氧葡萄糖（FDG）正电子发射断层扫描（PET）用于肿瘤成像的理论基础，该技术在临床实践中被广泛应用4,5。高水平的有氧糖酵解被认为是癌症的一个关键特征，近年来已被达恩·哈纳汉（D. Hanahan）和罗伯特·温伯格（B. Weinberg）列为著名的“癌症标志”之一6。癌基因和肿瘤抑制基因中的体细胞突变——例如 HRAS/KRAS/NRAS、EGFR、BRAF、MYC、TP53、异柠檬酸脱氢酶（IDH）以及延胡索酸水合酶（FH）——已被证实与癌细胞特定的代谢改变相关，这些改变被认为是有氧糖酵解的结果7。

代谢组学分析不仅有助于理解癌细胞中的代谢调控机制，还可用于识别早期癌症生物标志物及预测化疗反应。在对敏感或耐药的癌细胞使用抗癌化合物处理后，追踪其代谢响应有助于识别可用于预测特定抗癌疗法在癌症患者中疗效的代谢生物标志物8,9,10,11。本文采用来源于具有EGFR突变的肺腺癌细胞系，并以可诱导氧化应激的二酰胺（diamide）进行处理，作为代谢组学分析的模型。该分析方法采用毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS），其优势在于能够全面检测质量范围为m/z 50–1000的带电代谢物12,13。本文旨在为初学者提供一份详细的可视化操作流程，涵盖培养癌细胞中水溶性代谢物的制备以及后续代谢组学分析（特别是通过CE-MS）的各个步骤。

方案

1. 第1天的细胞培养

注意：每个用于代谢物提取的样品应来自一个单独的 100 mm 组织培养皿，该培养皿中的细胞应处于适度但未完全融合的状态（含有约 2–5 × 10⁶ 个细胞）。请根据检测需求计算所需培养皿的数量，并相应地进行准备。

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基培养HCC827和PC-9细胞。
  2. 吸除100 mm培养皿中的细胞培养液。
  3. 用2 mL不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个培养皿中的细胞。轻轻摇动每个培养皿，使PBS溶液完全覆盖培养皿表面。
  4. 吸除培养皿中的洗涤缓冲液。
  5. 将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液预热至37 °C，并用5 mL移液管加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻摇动每个培养皿，使胰蛋白酶完全覆盖培养皿表面。
  6. 将培养皿在37 °C孵育约5分钟。
  7. 每皿加入4 mL预热的完全生长培养基。通过反复轻柔吹打将细胞重悬于培养基中。
  8. 将每种细胞悬液转移至单独的15 mL锥形管中，在800 × g离心5分钟。
  9. 将每管细胞沉淀重悬于2 mL预热的完全生长培养基中。
  10. 使用自动细胞计数仪和0.4%台盼蓝溶液测定细胞总数及活细胞百分比。
    1. 取10 μL细胞悬液与10 μL 0.4%台盼蓝溶液混合。
    2. 通过毛细作用将10 μL样品加载至细胞计数板的计数室中。
    3. 将计数板插入自动细胞计数仪。透射光自动点亮，仪器自动对焦于细胞。
    4. 按下capture按钮以捕获图像并显示结果。
    5. 如有必要，添加更多生长培养基以达到所需细胞浓度。
  11. 每100 mm细胞培养皿接种约100万至250万个细胞。
    注意：通过毛细管电泳-质谱（CE-MS）分析测定的代谢物浓度将根据活细胞数量进行归一化处理。为进行细胞计数，每个实验组需额外准备至少一个接种的培养皿。
  12. 将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下孵育18小时。

2. 试剂的准备

  1. 将含有L-蛋氨酸砜和d-樟脑-10-磺酸的市售内标溶液用超纯水稀释1000倍。
    注意：若样本数少于80个，可直接取50 μL内标溶液1与45 mL超纯水加入50 mL容量瓶中，再用超纯水定容至50 mL。
  2. 用超纯水配制0.05 g/mL的甘露醇溶液作为洗涤缓冲液。
    注意：若样本数少于30个，可将25 g甘露醇溶解于500 mL超纯水中。每100 mm培养皿约需15 mL洗涤缓冲液，请根据样本数量准备足量的缓冲液。

3. 预清洗离心过滤装置

  1. 用移液器将 250 μL 超纯水加入每个离心过滤装置的滤杯中（参见材料表）。
    注意：每个样品需要两个过滤装置。
  2. 拧紧过滤装置的盖子，在 4 °C 条件下以 9,100 × g 离心 5 分钟。
  3. 检查每个滤液的体积——如果在首次短时间离心过程中已有大量滤液产生，则该过滤装置可能存在缺陷。此时应弃用该过滤装置，并更换新的过滤装置。
  4. 再次拧紧过滤装置的盖子，在 4 °C 条件下以 9,100 × g 离心 30 分钟。
  5. 确保所有滤杯中均无残留的超纯水；用移液器吸出每个收集管中的滤过超纯水并弃去。
    注意：切勿使用移液器试图从滤杯中移除残留水分，以免损坏滤膜。
  6. 将滤杯重新放回各自的收集管中。
    注意：应在一小时内使用离心过滤装置，因为滤膜在干燥后可能受损。

第2天的细胞培养

  1. 从培养箱中取出100 mm培养皿。
    注意：建议的细胞培养时间为18小时。
  2. 吸除每个100 mm培养皿中的细胞培养基。
  3. 向每个培养皿中加入10 mL含有适当浓度化合物或药物的细胞培养基，注意不要扰动细胞层。
    注意：为演示目的，本实验中我们向培养基中添加了10 μL溶于PBS的250 mM二酰胺（终浓度为250 μM）。
  4. 将培养皿在37 °C条件下孵育30分钟，实验组加入二酰胺，对照组加入PBS。
  5. 吸除每个100 mm培养皿中的细胞培养基。
  6. 通过沿培养皿边缘轻轻加入2 mL 5%甘露醇溶液清洗细胞，注意不要扰动细胞层，然后轻微倾斜培养皿。
    注意：PBS或生理盐水会干扰基于毛细管电泳-质谱（CE-MS）的代谢组学分析，并对检测结果产生不利影响，因此不应用作洗涤缓冲液。
  7. 吸除每个培养皿中的洗涤缓冲液，然后每个培养皿中再轻轻加入10 mL洗涤缓冲液，轻微倾斜培养皿进行第二次洗涤。
  8. 从每个培养皿的边缘彻底吸除洗涤缓冲液。
    注意：应尽可能吸除全部洗涤缓冲液，同时注意避免吸走细胞。残留的甘露醇可能干扰CE-MS分析；若细胞被吸走，将导致细胞数量减少，从而成为数据归一化过程中的误差来源。

5. 从培养细胞中提取代谢物

  1. 每个培养皿中加入 800 μL 的 99.7% 甲醇。轻轻前后摇晃每个培养皿，使其表面完全覆盖。将培养皿在室温下放置 30 秒。
  2. 将移液枪枪头浸入甲醇中，缓慢向每个培养皿中加入 550 μL 稀释后的内标溶液，并轻轻吹打数次。
  3. 轻轻前后摇晃每个培养皿，使其表面完全覆盖。
  4. 将培养皿在室温下放置 30 秒。

6. 细胞提取物的超滤

  1. 将每个培养皿中的提取液分别转移至1.5 mL离心管中。
  2. 在4 °C条件下，以2,300 × g 离心5分钟。
  3. 将每份上清液各350 μL转移至两个离心滤过装置中（每个样品使用两个滤管）。
    注意：从每个培养皿中提取的溶液共700 μL，分装至两个滤管中（每管350 μL）。
  4. 在4 °C条件下，以9,100 × g 离心约2小时，直至滤杯中无残留液体。
  5. 取下滤杯，并将收集管的管盖紧密关闭。

7. 样品蒸发

  1. 准备一台离心浓缩仪——通常由蒸发室、冷阱和真空泵组成。
  2. 将收集管放入离心浓缩仪中。
    注意：保持管盖打开状态。
  3. 在室温下通过真空条件蒸发提取的样品溶液。
    注意：通常设置转速为 1,500 rpm，压力为 1,000 Pa，完全蒸发样品通常需要约 3 小时。
  4. 确认所有收集管中均无残留液体后， tightly 盖上管盖。
  5. 将收集管储存于超低温（−80 °C）冰箱中，直至进行代谢组学分析。

8. 基于毛细管电泳-质谱法的代谢组学分析

  1. 在进行毛细管电泳-质谱（CE-MS）分析前，立即将滤液重悬于 50 μL 超纯水中。
  2. 采用先前所述方法12,13进行CE-MS分析，使用配备等度泵、CE-MS接口和CE-ESI-MS喷雾器的毛细管电泳系统和飞行时间质谱仪系统。
    注：两个系统均可由仪器厂商提供的软件控制，并通过一根熔融石英毛细管（内径 50 μm × 总长度 80 cm）连接。
    1. 设置仪器和样品瓶，使用毛细管盒准备毛细管，根据阴离子或阳离子分析模式补充鞘液和相应的电泳缓冲液，然后施加电压。
      注：仪器配置和分析条件在其他文献中有详细描述12,13。
    2. 打开软件，创建包含数据采集方法和样品信息的工作列表。
    3. 开始测试运行，检查内标物的信号强度和峰形，以及其他标准化合物的峰分辨率。
    4. 如有必要，微调分析条件。
    5. 在 50 mbar 压力下进样 3 秒，电压设为 30 kV。
      注：CE-MS可在正离子或负离子模式下进行。将质谱仪设置为扫描质量范围 m/z 50–1000。毛细管电压设为 4 kV；氮气流速（加热器温度 300°C）。正离子模式下，碎裂电压（fragmentor）、锥孔电压（skimmer）和OCT RFV电压分别设为 75、50 和 125 V。负离子模式下，碎裂电压、锥孔电压和OCT RFV电压分别设为 100、50 和 200 V。
  3. 分析质谱数据。
    1. 使用自动积分软件从质谱数据中提取峰，获得包括 m/z、峰面积和迁移时间（MT）在内的峰信息。
      注：该方法在其他文献中有详细描述14。
    2. 排除对应于同位素异构体、加合离子以及已知代谢物其他产物离子的信号峰。
    3. 根据 m/z 值和迁移时间（MT），利用HMT代谢物数据库对剩余峰进行注释。
    4. 将注释峰的峰面积归一化至内标水平和每份样品的细胞数量。
    5. 利用为每种代谢物制备的标准曲线，评估培养细胞中各代谢物的浓度（pmol/106 细胞）。
    6. 将定量得到的代谢物浓度用于后续的统计分析和生物学解释14。

结果

由于癌细胞中代谢物浓度（pmol/106 个细胞）是根据活细胞数量进行归一化的，因此应谨慎设置实验条件，以尽量减少不同条件下活细胞数量的差异。例如，二甲酰胺（diamide）处理采用了相对较高的浓度（250 μm），但处理时间较短，以确保所有细胞尽可能均等地生长，从而使得被分析的活细胞数量一致。在这些实验条件下，HCC827 和 PC-9 细胞在 3 小时内的生长情况基本相同（图 1）。与 PBS 处理（对照）细胞相比，对二甲酰胺处理细胞进行毛细管电泳质谱（CE-MS）分析发现，HCC827 和 PC-9 细胞中分别有 175 和 150 种差异代谢物。其中，在两个细胞系中，戊糖磷酸途径（PPP）和糖酵解上游的若干中间产物在二甲酰胺处理条件下显著升高，而少数三羧酸（TCA）循环中间产物在处理条件下则有所降低（图 2 和 图 3）。

磷酸戊糖途径（PPP）生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）形式的还原当量，用于维持氧化还原稳态和脂肪酸生物合成15。经二氨基苯甲酰胺（diamide）处理后，HCC827细胞中葡萄糖的氧化产物——葡萄糖酸的水平升高了12倍，PC-9细胞中升高了10倍；同样，在diamide处理后，葡萄糖-6-磷酸（G6P）——一种磷酸化的葡萄糖，也是己糖激酶催化的糖酵解第一个产物——在HCC827细胞和PC-9细胞中的水平分别增加了6.3倍和3.5倍（图4）。此外，在diamide处理后，PPP中的第一个中间产物6-磷酸葡萄糖酸（6PG）的水平与PBS对照组相比，在HCC827细胞中显著升高了89倍，在PC-9细胞中升高了231倍（图4）。相比之下，在diamide处理条件下，其他糖酵解中间产物如果糖-6-磷酸（F6P）和果糖-1,6-二磷酸（F1,6P）的水平未发生明显变化（图4）。总的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）水平在diamide处理组与PBS对照组之间几乎相等（图4），提示葡萄糖主要通过磷酸戊糖途径进行分解代谢。

HCC827 和 PC-9 细胞系在 PBS 和二乙酰处理下随时间变化的细胞计数柱状图。
图 1. 二乙酰处理后细胞数量无变化。 使用台盼蓝染色法检测细胞对 250 μm 二乙酰的生长反应。图中显示了 (A) HCC827 和 (B) PC-9 细胞在 PBS (蓝色) 或二乙酰 (红色; 250 μm) 处理 1 或 3 小时后的细胞数量。数据以均值 ± 标准差表示 (n = 6)。请点击此处查看该图的放大版本。

色谱结果、强度与时间关系图、葡萄糖酸、G6P、6PG、NADP+ 鉴定。
图2. 代谢物的代表性质谱峰。 毛细管电泳-质谱（CE-MS）分析获得的电泳图谱，分别标注为（A）葡萄糖酸、（B）葡萄糖-6-磷酸（G6P）、（C）6-磷酸葡萄糖酸（6PG）和（D）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）。每条曲线代表所用的细胞系（实线，HCC827；虚线，PC-9）和处理方式（蓝色，PBS；红色，二酰胺）。请点击此处查看该图的放大版本。

代谢通路分析；比较图；HCC827 与 PC-9 的 log(二酰胺/PBS) 数据。
图 3. 胞内代谢物的代谢组学谱图。 经二酰胺处理后，(A) HCC827 和 (B) PC-9 细胞中代谢物的变化倍数以 log2(二酰胺/PBS) 表示。总共在 HCC827 和 PC-9 细胞中分别注释出 175 和 150 种代谢物。请点击此处查看该图的放大版本。

葡萄糖代谢示意图；柱状图显示HCC827和PC-9细胞在PBS和二酰胺处理下代谢物水平。
图4. 二酰胺处理后磷酸戊糖途径（PPP）的上调。图中显示了经二酰胺处理后，参与糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）的关键代谢物的细胞内浓度（pmol/106 个细胞）。代谢物提取自经PBS（蓝色）或二酰胺（红色，250 μm）处理30分钟的HCC827和PC-9细胞。代表性代谢物包括葡萄糖酸、葡萄糖-6-磷酸（G6P）、果糖-6-磷酸（F6P）、6-磷酸葡萄糖酸（6PG）以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种广泛适用的方法，用于制备培养的癌细胞代谢物，以进行基于毛细管电泳-质谱（CE-MS）的代谢组学分析。该方案中最关键的步骤之一是癌细胞的正确处理，因为所测得的代谢物浓度需根据活细胞数量进行归一化。为了准确估算细胞数量，每个实验组至少需额外准备一个培养皿，以便在提取代谢物的同时平行计数活细胞数量。此外，各重复组培养皿以及用于计数的培养皿中应接种相同数量的细胞；未来，若采用快速且无应激（例如无需胰酶消化）的细胞计数方法，将有望使用同一培养皿同时完成活细胞计数与代谢物提取。洗涤过程中应格外小心，避免细胞从培养皿表面脱落。对于导致细胞黏附性下降的严重细胞毒性试验或其他实验，由于洗涤过程中可能存在细胞丢失，因此可能不适用于本提取方案。

在采用毛细管电泳-质谱（CE-MS）进行代谢组学分析时，从培养细胞中提取代谢物的过程中，必须使用5%甘露醇溶液作为洗涤缓冲液，因为基于盐的缓冲液（如PBS）会干扰代谢组学分析，并对检测结果产生不利影响。

可通过分别从每皿中提取代谢物，然后将样品混合，将两到三个培养皿合并为一个样品；然而，合并多个培养皿通常会增加提取代谢物溶液中残留的甘露醇含量。这还可能干扰毛细管电泳-质谱（CE-MS）的代谢组学分析。因此，不建议将多个培养皿或孔作为单个样品使用。

该基于毛细管电泳-质谱（CE-MS）的代谢组学分析方法已针对分子量在50至1000 Da之间的带电分子的全面检测而开发；因此，本方案已针对水溶性、低分子量化合物的提取进行了优化。故本方案不适用于提取疏水性代谢物（如脂质）或大分子物质（如蛋白质和核酸）。由于目前对培养细胞样本进行脂质组学或全面脂质分析的需求日益增长，亟需建立一种简便且高效的方案，以实现亲水性和疏水性代谢物的同时提取。

代谢物提取的第一步——吸除培养基并用甘露醇洗涤细胞——应尽快完成，以尽量减少细胞代谢谱的变化。用甘露醇洗涤细胞后，以甲醇处理细胞被认为可使蛋白质变性，从而阻止酶催化进一步的代谢反应。然而，即使经过甲醇处理，仍可能发生非酶促化学反应，例如氧化还原反应、某些脱羧过程以及巯基连接反应。因此，通过本方案测得的参与这些反应的代谢物浓度应谨慎解读。与基因组或转录组不同，代谢组包含化学性质极为多样的分子；因此，尚无任何单一方案能够在无损失或无干扰的情况下提取全部代谢物。对于此类高反应活性代谢物的更准确测定，应参考专门设计用于提取特定类别代谢物的方案，这类方案通常需要进行组分分离和衍生化处理。然而，本文所述方案旨在描述一种简单快速地从培养细胞样品中提取水溶性代谢物的方法，适用于毛细管电泳-质谱（CE-MS）代谢组学分析。本文未详细说明CE-MS的设置方法，因当前论文的重点不同，而详细描述CE-MS的建立步骤可能需要另撰专文阐述。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢所有山形县庄内地区产业振兴中心成员提供的帮助。本研究部分得到了山形县和鹤冈市研究基金、国立癌症研究中心研究开发基金 [资助编号 28-A-9] 以及日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 [资助编号 17K07189] 对 HM 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动细胞计数仪Thermo ScientificAMQAX1000Countess II 自动细胞计数仪
自动积分软件Agilent TechnologiesMassHunter G3335-60041版本 B.02.00
毛细管电泳系统Agilent TechnologiesAgilent 7100 毛细管电泳系统
毛细管电泳/质谱联用适配器套件Agilent TechnologiesG1603A
毛细管电泳-电喷雾-质谱喷雾器套件Agilent TechnologiesG1607A
细胞计数用计数板载玻片Thermo ScientificC10282Countess 细胞计数板载玻片
离心滤过装置，5 kDaHuman Metabolome TechnologiesULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT
锥形无菌聚丙烯离心管，15 mlThermo ScientificN339651
锥形无菌聚丙烯离心管，50 mlThermo ScientificN339653
Costar 移液管，10 mlCorning4488
Costar 移液管，5 mlCorning4487
D(-)-甘露醇Wako133-00845500 g
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Sigma-AldrichD8537-500ML
电泳缓冲液Human Metabolome TechnologiesH3301-1001用于阳离子分析
电泳缓冲液Human Metabolome TechnologiesH3302-1021用于阴离子分析
胎牛血清BiowestS1780
带滤芯吸头，1000 μlWatson124P-1000S
带滤芯吸头，20 μlWatson124P-20S
带滤芯吸头，200 μlWatson1252-703CS
熔融石英毛细管Polymicro TechnologiesTSP050375内径 50 μm × 总长度 80 cm
HCC827American Type Culture CollectionCRL-2868
内标溶液Human Metabolome TechnologiesH3304-1002
等度泵Agilent TechnologiesAgilent 1100 系列等度泵
甲醇Wako138-145211 L，LC/MS 级
微量离心管，1.5 mlWatson131-415C
操作软件Agilent TechnologiesChemStation G2201AA毛细管电泳用版本 B.03.01
PC-9RIKEN 生物资源中心RCB4455
RPMI-1640 培养基Sigma-AldrichR8758-500ML
无菌组织培养皿，100 mmCorning430167
飞行时间质谱仪Agilent TechnologiesAgilent G1969A 飞行时间液相色谱/质谱仪
台盼蓝溶液，0.4%Thermo ScientificT10282
胰蛋白酶-EDTA 溶液Sigma-AldrichT4049-100ML
超纯水MerckMilli-Q 水18.2 MΩ·cm 纯水
容量瓶，50 mlIwaki5640FK50ETE-32

参考文献

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