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方法文章

在巨型囊泡内对单个细菌细胞进行培养

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DOI：

10.3791/59555

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2019年4月30日

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

本文内容

摘要

我们展示了在巨型囊泡（GVs）内进行细菌的单细胞培养。通过液滴转移法制备含有细菌细胞的巨型囊泡，并将其固定在玻璃基底上的支撑膜上，以便直接观察细菌的生长过程。该方法也可适用于其他类型的细胞。

摘要

我们开发了一种在巨型囊泡（GVs）内对单个细菌细胞进行培养的方法。细菌细胞培养对于理解细菌细胞在自然环境中的功能具有重要意义。随着技术的进步，现已能够在受限空间内揭示多种细菌细胞在单细胞水平上的功能。GVs是由两亲性脂质分子组成的球形微米级隔室，能够容纳包括细胞在内的多种物质。在本研究中，通过液滴转移法将单个细菌细胞封装进直径为10–30 μm的GVs中，并将含有细菌细胞的GVs固定在玻璃基底上的支撑膜上。该方法适用于实时观察GVs内单个细菌的生长过程。我们以大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）作为模型在GVs中进行培养，但该方法也可适用于其他类型的细胞。本方法可广泛应用于微生物学、生物学、生物技术和合成生物学等科研与工业领域。

引言

单细胞水平的细菌培养近年来受到越来越多的关注。在受限空间内对单个细菌细胞进行培养，有助于阐明细菌的功能，例如表型变异性1,2,3,4、细胞行为5,6,7,8,9以及抗生素耐药性10,11。得益于近年来培养技术的进步，单个细菌的培养已可在诸如微孔芯片4,7,8、凝胶液滴12,13和油包水（W/O）液滴5,11等受限空间内实现。为了进一步加深对单个细菌细胞的理解与利用，仍需在培养技术方面进行更深入的发展与优化。

模拟生物细胞膜的囊泡是由两亲性分子构成的球形结构，能够容纳多种物质。根据尺寸不同，囊泡可分为小囊泡（SVs，直径 < 100 nm）、大囊泡（LVs，<1 μm）和巨型囊泡（GVs，>1 μm）。由于SVs或LVs对生物细胞膜具有亲和性，常被用作药物载体14。GVs则已被用于构建原始细胞15或人工细胞的反应系统16。已有研究报道将生物细胞封装于GVs中17,18，因此当GVs与反应系统结合时，显示出作为细胞培养系统的潜力。

本文结合实验操作视频，介绍了如何将GVs用作新型细胞培养容器19。通过液滴转移法20制备含有细菌的GVs，随后将其固定在盖玻片上的支撑膜表面。利用该系统，我们实现了在GVs内对单个细菌的实时生长过程进行观察。

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方案

1. 通过液滴转移法制备含有细菌细胞的GVs

  1. 用氯仿/甲醇溶液（2/1，v/v）配制1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC，10 mM，1 mL）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基（聚乙二醇）-2000]（生物素-PEG-DSPE，0.1 mM，1 mL）的脂质储备液，并将储备液于-20 °C保存。
  2. 含脂质油溶液的制备
    1. 将20 μL的POPC溶液和4 μL的生物素-PEG-DSPE溶液加入玻璃试管中（图1b (i)）。
    2. 通过气流吹干有机溶剂以形成脂质膜，并将脂质膜置于干燥器中1小时，以彻底蒸发残留的有机溶剂（图1b (ii)）。
      注意：必须在通风橱中蒸发有机溶剂。
    3. 向玻璃小瓶中加入200 μL矿物油（0.84 g/mL，材料表）（图1b (iii)）。
    4. 用封口膜包裹玻璃小瓶开口，然后在超声水浴（120 W）中处理至少1小时（图1b (iii)）。POPC和生物素-PEG-DSPE的最终浓度分别为1 mM和0.002 mM。
  3. 细菌细胞的预培养
    1. 从LB平板接种E. coli至1x LB培养基（200 mL去离子水中含1 g酵母提取物、2 g胰蛋白胨和2 g氯化钠）中，于37 °C培养12–14小时（过夜）。
    2. 培养后，取20 μL培养液转移至1.98 mL新鲜1x LB培养基中，再次培养2小时。
    3. 检测预培养液（步骤1.3.2制备）在600 nm处的光密度（OD600）值。应使用OD600 = 1.0–1.5的预培养液。
  4. GVs内外水相溶液的制备
    1. 将葡萄糖溶解于1x LB培养基中，以制备GVs的外水相溶液。配制20 mL葡萄糖储备液（500 mM）。
    2. 用1x LB培养基将葡萄糖储备液稀释至200 mM（表1）。
    3. 将蔗糖溶解于1x LB培养基中，以制备GVs的内水相溶液。配制20 mL蔗糖储备液（500 mM）。
    4. 混合预培养液（OD600 = 1.0–1.5）、蔗糖溶液（500 mM）和1x LB培养基（表1）。培养液的最终OD600值应为0.01–0.015，蔗糖终浓度应为200 mM。
      注意：注意避免渗透压失衡。必须使内外水相溶液的浓度保持平衡。
  5. 含细菌细胞的水包油（W/O）液滴的制备
    1. 将2 μL的GVs内水相溶液（步骤1.4.4制备）加入含有脂质的油溶液（含POPC和生物素-PEG-DSPE的矿物油）50 μL中，置于0.6 mL带盖塑料管中（图1b (iv)）。
    2. 用手轻敲塑料管，使两相在管内乳化（图1b (v)）。
  6. 含细菌细胞的GVs的形成
    1. 在1.5 mL带盖塑料管中加入50 μL的GVs外水相溶液（步骤1.4.2制备）（图1b (vi)），然后在其表面轻轻铺加150 μL含脂质的油溶液（含POPC和生物素-PEG-DSPE的矿物油）（图1b (vii)）。将样品在室温（RT，25 °C）孵育10–15分钟。检查油相与水相界面是否平整。
    2. 用移液器将50 μL的W/O液滴溶液（步骤1.5.2制备）加至油相与水相的界面处（图1b (viii)）。
    3. 将1.5 mL带盖塑料管（来自步骤1.6.2）在台式离心机中于室温下以1,600 × g离心10分钟（图1b (ix)）。离心后，用移液器吸除上层油相，收集含有细菌细胞的GVs（图1b (x)）。

2. GV 观察系统（细菌细胞培养系统）的制备

  1. 用于构建支撑双层膜的小囊泡（SVs）的制备
    1. 将20 μL的POPC溶液和4 μL的生物素-PEG-DSPE溶液加入玻璃试管中（使用与步骤1.1中GV制备相同的脂质组成）。
    2. 通过气流蒸发有机溶剂以形成脂质膜，并将样品置于干燥器中1小时，以彻底蒸发残留的有机溶剂。
    3. 向玻璃小瓶中加入200 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GV的外水相溶液）。
    4. 用封口膜包裹玻璃小瓶开口部分，并在超声水浴（120 W）中进行超声处理至少1小时。
    5. 使用微型挤出器和孔径为100 nm的聚碳酸酯膜，通过挤出法21制备SVs。
  2. 自制样品腔室的制备
    1. 使用空心打孔器在双面密封垫（10 mm × 10 mm × 1 mm）上钻一个7 mm的孔。
    2. 将带孔的双面密封垫粘贴到盖玻片（30 mm × 40 mm，厚度0.25–0.35 mm）上。
  3. 在腔室孔洞内的盖玻片表面制备支撑双层膜
    1. 向腔室的孔洞（按步骤2.2制备）中加入30 μL SV溶液，并在室温下孵育30分钟。
    2. 用移液器吸取20 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GV的外水相溶液），轻轻冲洗孔洞两次。
  4. 将GVs固定在腔室孔洞内盖玻片上的支撑双层膜上
    1. 向孔洞中加入10 μL链霉亲和素（neutravidin）与GV外水相溶液（1 mg/mL），并在室温下孵育15分钟。
    2. 用移液器吸取20 μL含200 mM葡萄糖的1x LB培养基（GV的外水相溶液），轻轻冲洗孔洞两次。
    3. 将含有GVs的全部溶液（按步骤1.6.3制备）加入腔室孔洞中，并用盖玻片（18 mm × 18 mm，厚度0.13–0.17 mm）密封（图2b）。
  5. 观察GVs内细菌细胞的生长
    1. 设置配备40x/0.6数值孔径（NA）长工作距离物镜的倒置显微镜加热载物台系统（图2b）。
    2. 将腔室放置于显微镜加热载物台系统上（图2b），在37 °C静态条件下孵育6小时，以观察腔室内含细菌细胞的GVs。
    3. 使用科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机，每30分钟拍摄并记录一次GVs内细菌细胞生长的显微图像。

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结果

我们介绍一种利用液滴转移法生成包含单个细菌细胞的GVs的简单方法（图1）。图1a展示了包含细菌的GVs沉淀过程的示意图。通过离心，含有细菌的水/油（W/O）液滴穿过油-水（脂质单层）界面，从而形成GVs。蔗糖（内水相溶液）与葡萄糖（外水相溶液）之间的密度差异也有助于W/O液滴穿过油-水界面。由于内外水相溶液之间微小的浓度差异可能引起GVs的变形和破裂，因此有必要监测内外水相的渗透压。图1b展示了采用液滴转移法制备包含细菌细胞的GVs的流程图。按照此流程操作，可轻松获得包含单个细菌细胞的GVs。

为了观察细菌在脂质体（GV）内的生长，构建了一套用于显微观察的原创培养系统（图2）。含有细菌的脂质体被固定在盖玻片上一层经中...

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讨论

本文介绍一种在GVs内对细菌细胞进行单细胞水平培养的方法。该方法通过液滴转移法，制备包含单个细菌细胞的GVs，操作简便。与其他获得含细菌细胞GVs的方法相比，本方法具有两个优势：（i）易于实施；（ii）制备GVs仅需少量样品溶液（2 μL）。与传统的水合22和微流控方法17相比，用于制备含细菌细胞GVs的液滴转移法20更为简便。例如，传统的水合法22虽是一种简单易行的GVs制备方法，但其材料包封效率较低，且至少需要数百微升的样品量。近年来发展的纤维素纸辅助水合23和凝胶辅助水合24方法在制备GVs时，对生物分子的包封效率显著高于传统水合法22。这两种方法的包封效率与液滴转移法相当，有望实现细胞在GVs内的包封。此外，微流控方法17能够精确地将单个细胞包封于GV...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了日本文部科学省（MEXT）优秀青年研究人员领先计划（LEADER，编号16812285）、日本学术振兴会（JSPS）对M.M.的青年科学家研究资助（编号18K18157、16K21034）以及文部科学省对K.K.的资助（编号17H06417、17H06413）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨BD Biosciences211705
氯仿Wako Pure Chemicals032-21921
盖玻片（18 × 18 mm）松野玻璃工业C018181厚度 0.13–0.17 mm
盖玻片（30 × 40 mm）松野玻璃工业定制订购厚度 0.25–0.35 mm
台式离心机Hi-Tech Co.ATT101摆动转子型
双面胶带（10 × 10 × 1 mm）NitomsT4613
玻璃小瓶AS ONE6-306-01Durham发酵管
葡萄糖和光纯药工业049-31165
倒置显微镜奥林巴斯IX-73
甲醇和光纯药工业133-16771
显微镜加热台系统TOKAI HITTP-110R-100
矿物油名村テスク23334-85
微型挤出器Avanti Polar Lipids610000
中性亲和素赛默飞世尔科技31000
物镜奥林巴斯LUCPLFLN 40×/0.6 NA
聚碳酸酯膜Avanti Polar Lipids610005孔径 100 nm
sCMOS相机AndorZyla 4.2 plus
氯化钠和光纯药工业191-01665
蔗糖和光纯药工业196-00015
超声波清洗机AS ONEASU-3D
酵母提取物BD Biosciences212750
0.6 mL 带盖塑料管Watson130-806C
1.5 mL 带盖塑料管住友贝克莱特公司MS4265-M
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱Avanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotin-PEG-DSPE

参考文献

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