在巨型囊泡内对单个细菌细胞进行培养

摘要

我们展示了在巨型囊泡（GVs）内进行细菌的单细胞培养。通过液滴转移法制备含有细菌细胞的巨型囊泡，并将其固定在玻璃基底上的支撑膜上，以便直接观察细菌的生长过程。该方法也可适用于其他类型的细胞。

摘要

我们开发了一种在巨型囊泡（GVs）内对单个细菌细胞进行培养的方法。细菌细胞培养对于理解细菌细胞在自然环境中的功能具有重要意义。随着技术的进步，现已能够在受限空间内揭示多种细菌细胞在单细胞水平上的功能。GVs是由两亲性脂质分子组成的球形微米级隔室，能够容纳包括细胞在内的多种物质。在本研究中，通过液滴转移法将单个细菌细胞封装进直径为10–30 μm的GVs中，并将含有细菌细胞的GVs固定在玻璃基底上的支撑膜上。该方法适用于实时观察GVs内单个细菌的生长过程。我们以大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）作为模型在GVs中进行培养，但该方法也可适用于其他类型的细胞。本方法可广泛应用于微生物学、生物学、生物技术和合成生物学等科研与工业领域。

引言

单细胞水平的细菌培养近年来受到越来越多的关注。在受限空间内对单个细菌细胞进行培养，有助于阐明细菌的功能，例如表型变异性^1,2,3,4、细胞行为^5,6,7,8,9以及抗生素耐药性^10,11。得益于近年来培养技术的进步，单个细菌的培养已可在诸如微孔芯片^4,7,8、凝胶液滴^12,13和油包水（W/O）液滴⁵

方案

1. 通过液滴转移法制备含有细菌细胞的GVs

1. 用氯仿/甲醇溶液（2/1，v/v）配制1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC，10 mM，1 mL）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基（聚乙二醇）-2000]（生物素-PEG-DSPE，0.1 mM，1 mL）的脂质储备液，并将储备液于-20 °C保存。
2. 含脂质油溶液的制备
   1. 将20 μL的POPC溶液和4 μL的生物素-PEG-DSPE溶液加入玻璃试管中（图1b (i)）。
   2. 通过气流吹干有机溶剂以形成脂质膜，并将脂质膜置于干燥器中1小时，以彻底蒸发残留的有机溶剂（图1b (ii)）。
      注意：必须在通风橱中蒸发有机溶剂。
   3. 向玻璃小瓶中加入200 μL矿物油（0.84 g/mL，材料表）（图1b (iii)）。
   4. 用封口膜包裹玻璃小瓶开口，然后在超声水浴（120 W）中处理至少1小时（图1b (iii)）。POPC和生物素-PEG-DSPE的最终浓度分别为1 m....

结果

我们介绍一种利用液滴转移法生成包含单个细菌细胞的GVs的简单方法（图1）。图1a展示了包含细菌的GVs沉淀过程的示意图。通过离心，含有细菌的水/油（W/O）液滴穿过油-水（脂质单层）界面，从而形成GVs。蔗糖（内水相溶液）与葡萄糖（外水相溶液）之间的密度差异也有助于W/O液滴穿过油-水界面。由于内外水相溶液之间微小的浓度差异可能引起GVs的变形和破裂，因此有必要监测内外水相的渗透压。图1b展示了采用液滴转移法制备包含细菌细胞的GVs的流程图。按照此流程操作，可轻松获得包含单个细菌细胞的GVs。

为了观察细菌在脂质体（GV）内的生长，构建了一套用于显微观察的原创培养系统（图2）。含有细菌的脂质体被固定在盖玻片上一层经中.......

讨论

本文介绍一种在GVs内对细菌细胞进行单细胞水平培养的方法。该方法通过液滴转移法，制备包含单个细菌细胞的GVs，操作简便。与其他获得含细菌细胞GVs的方法相比，本方法具有两个优势：（i）易于实施；（ii）制备GVs仅需少量样品溶液（2 μL）。与传统的水合²²和微流控方法¹⁷相比，用于制备含细菌细胞GVs的液滴转移法²⁰更为简便。例如，传统的水合法²²虽是一种简单易行的GVs制备方法，但其材料包封效率较低，且至少需要数百微升的样品量。近年来发展的纤维素纸辅助水合²³和凝胶辅助水合²⁴方法在制备GVs时，对生物分子的包封效率显著高于传统水合法²²。这两种方法的包封效率与液滴转移法相当，有望实现细胞在GVs内的包封。此外，微流控方法¹⁷能够精确地将单个细胞包封于GV.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	BD Biosciences	211705
氯仿	Wako Pure Chemicals	032-21921
盖玻片（18 × 18 mm）	松野玻璃工业	C018181	厚度 0.13–0.17 mm
盖玻片（30 × 40 mm）	松野玻璃工业	定制订购	厚度 0.25–0.35 mm
台式离心机	Hi-Tech Co.	ATT101	摆动转子型
双面胶带（10 × 10 × 1 mm）	Nitoms	T4613
玻璃小瓶	AS ONE	6-306-01	Durham发酵管
葡萄糖	和光纯药工业	049-31165
倒置显微镜	奥林巴斯	IX-73
甲醇	和光纯药工业	133-16771
显微镜加热台系统	TOKAI HIT	TP-110R-100
矿物油	名村テスク	23334-85
微型挤出器	Avanti Polar Lipids	610000
中性亲和素	赛默飞世尔科技	31000
物镜	奥林巴斯	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
聚碳酸酯膜	Avanti Polar Lipids	610005	孔径 100 nm
sCMOS相机	Andor	Zyla 4.2 plus
氯化钠	和光纯药工业	191-01665
蔗糖	和光纯药工业	196-00015
超声波清洗机	AS ONE	ASU-3D
酵母提取物	BD Biosciences	212750
0.6 mL 带盖塑料管	Watson	130-806C
1.5 mL 带盖塑料管	住友贝克莱特公司	MS4265-M
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids	850457P	POPC
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129P	Biotin-PEG-DSPE