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X射线衍射技术用于完整小鼠骨骼肌以研究肌肉疾病的结构基础

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DOI：

10.3791/59559

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2019年7月18日

 , 
1BioCAT, Dept. of Biological Sciences, Illinois Institute of Technology

本文内容

摘要

我们介绍了使用完整小鼠骨骼肌进行小角X射线衍射实验的详细方案。随着用于人类疾病研究的转基因小鼠模型日益普及，该实验平台可作为解析遗传性肌肉疾病结构基础的有效测试系统

摘要

转基因小鼠模型一直是研究基因型与表型关系的重要工具，包括骨骼肌相关人类疾病的研究。研究表明，小鼠骨骼肌在第三代同步辐射光束线上能够产生高质量的X射线衍射图谱，这为通过确定遗传改变的结构后果，将基因型水平的变化与健康和疾病中的功能表型联系起来提供了机会。本文提供了详细的实验样本制备、X射线图谱采集以及从X射线图谱中提取相关结构参数的实验方案，可为希望自行开展此类实验的研究人员提供指导。

引言

同步辐射小角X射线衍射是研究在生理条件下主动收缩的肌肉样品纳米尺度结构的首选方法。重要的是，可同步获取来自活体或去膜肌肉样品的结构信息以及肌肉力量和长度变化等生理数据。近年来，人们越来越关注将该技术应用于研究由肌节蛋白点突变引起的遗传性肌肉疾病的结构基础。肌肉生物物理学领域研究人员已积极构建了多种转基因小鼠模型，以模拟这些人类疾病状态，为结构研究提供了理想的实验平台。我们课题组1,2,3及其它研究团队4,5的最新研究表明，从小鼠趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌获得的X射线衍射图样能够提供与传统模式生物（如蛙和兔的腰大肌骨骼肌）同样全面的衍射信息。小鼠骨骼肌样品的优势在于解剖简便，并易于开展基本的细胞膜完整、整块肌肉水平的生理实验。解剖后肌肉的尺寸具有足够的质量，因而在第三代X射线光束线上，仅需极短的X射线曝光时间（约每帧毫秒级）即可获得高度精细的肌肉衍射图样。

肌肉X射线衍射图样包括赤道反射、子午线反射以及层线反射。赤道强度比（1,1与1,0赤道反射的强度之比，I11/I10）与附着的横桥数量密切相关，而横桥数量与小鼠骨骼肌产生的力成正比2。子午线反射反映了粗肌丝和细肌丝内部的周期性结构，可用于估算肌丝的可延展性1,3,6,7。不在子午线和赤道上的衍射特征称为层线，它们来源于粗肌丝主干表面近似螺旋排列的肌球蛋白头以及近似螺旋排列的细肌丝。肌球蛋白层线的强度与不同条件下肌球蛋白头有序程度密切相关2,8。所有这些信息可用于在健康和疾病状态下原位研究肌节蛋白的行为。

同步辐射X射线衍射技术在肌肉研究中的应用传统上由高度专业化的专家团队完成，但随着技术进步以及新型数据处理工具的出现，这种情况已不再必然。位于阿贡国家实验室先进光子源的BioCAT 18ID光束线配备了专职技术人员和支持设施，可协助该领域的新手开展肌肉X射线衍射实验。许多用户选择与BioCAT工作人员正式合作，但越来越多的用户发现他们能够独立完成实验和数据分析，从而减轻了光束线工作人员的负担。本文的主要目标是提供培训，使潜在的实验人员能够获得所需信息，以便在BioCAT光束线或其他全球范围内具备高通量条件的光束线上，针对小鼠骨骼肌系统开展实验的设计与实施。

方案

所有动物实验方案均经伊利诺伊理工学院机构动物护理和使用委员会（Protocol 2015-001，批准日期：2015年11月3日）批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH） "实验动物护理和使用的指南"9.

1. 实验前准备

  1. 每次实验当天新鲜配制 500 mL 的任氏液（含：145 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.0 mM MgSO4、1.0 mM CaCl2、10.0 mM HEPES、11 mM 葡萄糖，pH 7.4）。
  2. 将 200 mL 任氏液装入喷雾瓶中，置于 4 °C 冰箱中保存。取一个直径为 10 cm 的培养皿，加入任氏液，并通过将氧气钢瓶的导管连接至水族箱用气石，通入 100% 氧气进行灌流。该培养皿（"解剖皿"）预先涂覆有弹性体化合物，以便在解剖过程中插入固定针。
  3. 制备金属固定钩。将两段直径为 0.5 mm 的不锈钢丝剪成适当长度，并将两端弯曲成钩状。准备好所有解剖工具，包括剪刀、打结镊子和显微剪刀，以便随时使用。
    注意：钩部长度应约为 3 mm。较长的金属丝（末端为钩）总长度应约为 5 cm ，较短的金属丝（末端也为钩）总长度应约为 1 cm ，以适配 BioCAT 使用的定制腔室，并确保换能器臂具有足够的活动范围。 
  4. 连接并开启所有设备。包括组合式电机/力换能器、电机/力换能器控制器、高功率双相电流刺激器，以及由计算机控制的数据采集/控制系统。
    1. 开启数据采集系统，并在实验开始前对其进行校准10。简要步骤如下：在力换能器上逐级施加一组已知质量的砝码，其范围达到力换能器所测最大力的 50%，记录输出电压的变化以校准力信号；通过向杠杆臂施加一组已知的输出电压，测量臂长的变化，以校准长度信号。
    2. 将样品架上的温控模块管道连接至制冷循环水浴，并设定水浴温度，使腔室内的温度维持在 10 °C 至 40 °C 之间。该温度需预先通过实验确定：将循环水浴设定在不同温度下，使用热电偶测量腔室内的实际温度，从而建立对应关系。

2. 肌肉组织制备

  1. 处死小鼠
    1. 通过吸入二氧化碳处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
    2. 用冷的任氏液喷洒后肢皮肤，以防止毛发飘入组织样本中。使用精细解剖剪在大腿周围剪开皮肤，并用#5镊子迅速向下拉除皮肤，以暴露肌肉。
    3. 截下后肢并转移至盛有充氧任氏液的解剖皿中，随后置于双目解剖显微镜下。
  2. 制备比目鱼肌
    1. 将后肢固定在解剖皿中，使腓肠肌朝上。剪断腓肠肌/比目鱼肌肌群的远端肌腱，并使用精细剪刀沿腓肠肌两侧剪除筋膜，轻柔缓慢地抬起肌肉。在松解比目鱼肌近端肌腱后，将腓肠肌/比目鱼肌肌群从肢体上分离。
    2. 将包含腓肠肌及远端肌腱的肌群固定在解剖皿中。通过比目鱼肌的近端肌腱轻轻提起该肌肉，并将其从腓肠肌上分离，尽可能保留比目鱼肌远端肌腱的完整性。
  3. 制备趾长伸肌（EDL肌）
    1. 将后肢固定在解剖皿中，使胫前肌朝上。沿胫前肌（TA肌）切开筋膜，并用镊子将其清除。识别并剪断TA肌的远端肌腱。抬起TA肌，并小心将其切除，避免牵拉到EDL肌。
    2. 切开膝关节外侧，暴露两条肌腱。剪断近端肌腱，尽可能保留肌腱与肌肉的连接，然后通过轻拉肌腱提起EDL肌（内侧肌肉）。当远端肌腱暴露后，将其剪断。
  4. 安装肌肉
    1. 通过肌腱将肌肉固定在解剖皿中，并尽可能修剪掉多余的脂肪、筋膜和肌腱组织。将一端肌腱插入预先打好的结中，并使用持针钳将缝线扎紧。在金属钩周围打第二个结固定。
    2. 对另一端肌腱上的长钩重复相同操作。确保缝线不接触肌肉本体，否则会损伤标本。
    3. 将短钩连接至实验腔室底部，长钩连接至双模力传感器/电机。用100%氧气持续通入实验腔室中的溶液。
  5. 优化刺激参数与肌肉长度
    1. 通过调节连接传感器/电机的微操纵器拉伸肌肉，在确定最佳刺激参数前，使基础张力维持在15至20 mN之间。将刺激电压设为40 V，系统性地增加刺激电流，直至抽搐力不再增加。在此最高电流基础上再增加约50%，以确保达到超最大激活。
    2. 通过逐步增加肌肉长度并对肌肉施加单次抽搐刺激，寻找产生最大抽搐力的肌肉长度，即定义为最适长度L0，直至主动张力（峰值力减去基础张力）不再上升为止。
    3. 进行一次短暂的强直收缩（持续1秒的激活），以测试安装效果，必要时将肌肉重新拉伸至最佳基础张力。使用数显卡尺记录肌肉长度（单位：mm）。

3. X射线衍射

注意：以下描述适用于在美国阿贡国家实验室先进光子源（Advanced Photon Source）BioCAT 18ID 光束线上的小角X射线衍射仪上进行的X射线衍射实验，但类似方法也可应用于其他光束线，例如欧洲同步辐射装置（ESRF，法国）的 ID 02 光束线和日本 SPring8 的 BL40XU 光束线。18ID 光束线以固定的X射线束能量 12 keV（波长 0.1033 nm）运行，全束入射通量约为每秒 1013 个光子。

  1. 选择样品到探测器的距离（相机长度）。在检测2.7 nm肌动蛋白及高阶肌球蛋白衍射（如2.8 nm子午线衍射）的实验中，使用1.8 m的相机长度。在其他实验中，若主要关注子午线和层线上的精细结构，则使用4–6 m的相机长度。
  2. 优化样品在光束中的位置
    1. 使用一张X射线敏感纸确定光束位置，该纸在X射线照射下会产生一个深色斑点（"烧灼点"）。然后使用视频十字线发生器，在视频图像上创建与烧灼点对齐的十字线，或直接用记号笔在视频屏幕上做标记。
    2. 使用BioCAT提供的样品定位器图形用户界面，将肌肉样品移动至光束中心位置。通过移动样品台使样品室以约10–20 mm/s的速度振荡，以便在曝光期间将X射线剂量分散到肌肉的不同区域。观察样品运动过程，避免经过大面积筋膜区域（含胶原蛋白，会污染衍射图谱），并确保样品在整个运动路径中始终处于光照范围内。
      注意：第3.3和3.4节中使用光束线提供的图形用户界面进行设置和操作的具体步骤，取决于具体光束线和探测器配置。请咨询光束线工作人员以了解如何执行这些操作。
  3. 为处于特定静态状态（静息状态或等长收缩期间）的肌肉设置CCD（电荷耦合器件）探测器以获取高分辨率图谱
    1. 在控制软件的图形用户界面中设置曝光时间和曝光周期。在采集曝光图像前，先获取一幅暗背景图像，并每隔2小时或在更改曝光时间后重复此步骤，以校正探测器读出电子元件可能发生的漂移。
    2. 将X射线光束衰减至所需曝光强度，然后采集图像。该探测器无法连续采集图像序列，且每次读出单幅图像需要数秒时间。
  4. 为时间分辨实验设置像素阵列探测器
    1. 在图形用户界面中设置图像数量、曝光时间和曝光周期。此处使用的像素阵列探测器每次读出至少需要1 ms。光子计数探测器的最大帧频为500 Hz。使用光子计数探测器的输出信号控制X射线快门。
    2. 将光束衰减至所需强度。启动探测器并等待数据采集系统的触发信号。通过同时触发机械和X射线数据采集实现同步。在整个实验过程中，以1 ms曝光时间和2 ms曝光周期连续采集X射线图谱。
      注意：具体的曝光时间和曝光周期应根据所需信息内容及样品在光束中可维持的寿命逐案确定。应适当衰减光束，确保所用X射线强度不超过在选定曝光周期内获得可分析数据所需的最低水平。

4. 实验后肌肉处理

  1. 每次力学和X射线实验后回收并称量肌肉。利用测得的肌肉长度和肌肉质量，假设肌肉密度为1.06 g/mL11，计算肌肉的横截面积12。
  2. 将肌肉拉伸至实验所需长度，并用10%甲醛固定10分钟。将固定后的肌肉从整个肌肉横截面的不同位置分离出一系列肌纤维束3。
  3. 使用视频肌节长度测量系统测定肌节长度。

结果

等长强直收缩。 可在同步采集X射线图样的同时，进行任何类型的经典肌肉力学实验，例如等长或等张收缩。图1A展示了力学与X射线实验的装置示意图。图1B显示了一次等长强直收缩的典型张力记录。肌肉在静息状态下维持0.5秒后被激活1秒。机械信号记录在刺激结束后持续1秒。在整个实验过程中，X射线图样以每毫秒曝光、500 Hz的频率连续采集。

X射线衍射图谱。 肌肉的X射线衍射图谱可提供来自肌节内部结构的纳米级分辨率信息。肌肉X射线衍射图谱由赤道线和子午线划分出的四个等效象限组成。赤道衍射信号来源于肌节内肌丝在纤维轴垂直方向上的排列结构，而子午线衍射信号则反映沿肌肉轴向的肌丝结构信息。不在赤道线或子午线上的其余衍射点称为层线。层线（例如 图2A 中标注的 MLL4 和 ALL6 特征）来源于含肌球蛋白的粗肌丝和含肌动蛋白的细肌丝内部分子亚单位的近似螺旋排列。在静息肌肉的衍射图谱中，基于肌球蛋白的层线信号强且尖锐（图2A），而在收缩肌肉的图谱中，基于肌动蛋白的层线更为明显（图2B）。通过从收缩状态的图谱中减去静息状态的图谱所获得的差值图谱（图2C），有助于揭示健康与病变肌肉在产生力量过程中发生的结构变化。通过追踪肌肉收缩过程中毫秒时间尺度上的这些结构变化，X射线衍射图谱能够揭示丰富的结构信息（图2D）。

使用 MuscleX 进行数据分析。以下是利用 MuscleX 软件包中的“equator”程序进行赤道反射分析的示例（图3）。MuscleX 是由 BioCAT 开发的一款开源分析软件包13。赤道反射强度比（I1,1/I1,0）是静息状态下肌球蛋白与肌动蛋白之间接近程度的指标（图3A），而在收缩状态的小鼠骨骼肌中，该比值与附着的横桥数量密切相关（图3B）2。静息肌肉中的 I1,1/I1,0 强度比约为 0.47，而收缩肌肉中约为 1.2。两个 1,0 反射峰之间的距离（2*S1,0）与肌丝间距离成反比。MuscleX 的详细文档和用户手册可在线获取13。

带有力传感器的肌肉收缩装置；收缩各阶段的张力随时间变化图。
图 1：力学与X射线实验装置及实验方案。（A）肌肉一端固定在实验腔室内的钩子上，另一端连接至双模式电机/力传感器。肌肉被夹在两片聚酰亚胺（Kapton）薄膜窗口之间，以允许X射线穿过。实验过程中，腔室内充满持续通入100%氧气的任氏液（Ringer’s solution）。（B）肌肉在强直收缩期间进行X射线实验的力学实验方案。请点击此处查看该图的放大版本。

X射线衍射图谱、蛋白质结构分析、图A-D、纳米尺度测量、散射结果。
图 2：EDL肌肉的X射线衍射图谱。 来自静息状态（A）和收缩状态（B）的EDL肌肉X射线衍射图谱。（C）静息与收缩状态图谱之间的差值图谱。蓝色区域表示在静息图谱中强度较高，而黄色区域表示在收缩图谱中强度较高。（D）EDL肌肉在1 ms曝光时间下获得的X射线衍射图谱。MLL1 = 肌球蛋白一级层线；MLL4 = 肌球蛋白四级层线；ALL1 = 肌动蛋白一级层线；ALL6 = 肌动蛋白六级层线；ALL7 = 肌动蛋白七级层线；Tm = 原肌球蛋白反射（由白色框标示）；M3 = 三级赤道反射；M6 = 六级赤道反射。 请点击此处查看该图的放大版本。

光谱分析示意图，包含光学激发和强度比。
图 3：使用 MuscleX 对赤道图样进行数据分析。 对扣除背景后的赤道强度比分布（面积）以及前五阶峰（绿色线条）进行拟合，以计算每个峰的强度。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们课题组近期发表的研究表明，小鼠骨骼肌的X射线衍射图谱可用于揭示健康与疾病状态下肌肉的肌节结构信息1,2,3，尤其是在各类肌病的基因修饰小鼠模型日益可得的背景下。结合单根肌纤维或小束肌纤维的高分辨率力学研究与X射线衍射技术，需由专业人员完成。然而，若仅需获取较为基础的力学信息，则可通过完整肌肉制备方法，从简单的样品中获得详细的X射线衍射图谱。

干净利落的解剖是成功进行机械与X射线联合实验的关键。在解剖过程中，必须避免牵拉目标肌肉以及与比目鱼肌或趾长伸肌相关的其他肌肉，因为这可能导致肌肉部分撕裂，从而降低收缩力，还可能破坏肌肉内部结构，影响X射线衍射图样的质量。由于所有物质都会对X射线产生散射，因此在执行以下实验步骤时，必须彻底清除多余的脂肪、筋膜中的胶原组织以及任何毛发或游离的组织碎片。为了减少肌肉标本的额外顺应性，应将肌腱牢固地绑在钩子上，绑扎位置应尽可能靠近肌肉本体，但不得损伤肌肉组织。

不同的X射线曝光时间可以从同一块肌肉中提供不同类型的信息。在18ID线站使用全束流时，1毫秒的曝光即可获得可分析的赤道衍射图谱（见图2D）。要获得可分析的第一肌球蛋白层线反射，通常需要10毫秒的总曝光时间。为了收集更高阶的子午线反射，例如M15（2.8 nm肌球蛋白子午线反射）和2.7 nm肌动蛋白子午线反射，通常至少需要1秒的总曝光时间，但为了实现高精度测量，建议总曝光时间超过2秒。

为实验选择最合适的X射线探测器至关重要。若需获取最精细的X射线图样，可使用定制的CCD探测器，例如BioCAT所配备的探测器，其像素约为40 µm，磷光体中的点扩散函数约为65 µm，能够提供高动态范围和良好空间分辨率的图样，但每次只能采集一帧图像。对于时间分辨实验，BioCAT的光子计数像素阵列探测器可实现每秒500帧的X射线图样采集。然而，该探测器的像素尺寸为172 µm，无法为子午线内层区域的精细研究提供足够的空间分辨率，但适用于大多数其他用途。BioCAT已获得一种高分辨率光子计数探测器，其在最高帧率9,000 Hz下可实现75 µm的实际分辨率。预计未来几年内，此类探测器将逐步取代当前用于肌肉研究的探测器。

在第三代同步辐射光源的极高X射线通量下，辐射损伤是一个严重的问题。通常建议衰减入射光束，使其强度不超过观察所需衍射特征所需的最低水平。通过延长衰减后光束的曝光时间，可以达到相同的总X射线曝光量。光子计数像素阵列探测器的一个优势在于，多个单独的帧可以无噪声 penalty 地进行累加。即便如此，仍可能发生辐射损伤。辐射损伤的迹象包括肌肉收缩最大张力下降、层线反射弥散，甚至肌肉颜色改变。

完整小鼠骨骼肌制备方法的一个局限性是在实验过程中难以获取完整肌肉的肌节长度。由于肌肉过厚，无法使用视频显微镜或激光衍射法进行测量。尽管随着未来技术的发展，或许有可能直接从衍射图样中估算肌节长度14，但在近期唯一可行的方法仍是在实验结束后按本文所述方式进行测量。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究使用了先进光子源的资源，先进光子源是美国能源部（DOE）科学办公室下属用户设施，由阿贡国家实验室根据合同号 DE-AC02-06CH11357 为能源部科学办公室运行。本项目获得了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所授予的 P41 GM103622 拨款支持。Pilatus 3 1M 探测器的使用由 NIGMS 提供的 1S10OD018090-01 拨款资助。本内容仅由作者负责，不一定反映国立普通医学科学研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#5 镊子WPI500342
4/0 外科缝合线Braintree SciSUT-S 108
水族箱用气石uxcell宠物店常见的普通气石即可
CaCl2Sigma-AldrichC5670
CCD 检测器Rayonix IncMAR 165 CCD
数据采集系统Aurora Scientific Inc610A
弹性体化合物Dow CorningSylgard 184
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
HEPESSigma-AldrichH3375
高分辨率光子计数检测器Dectris IncEIGER X 500K
高功率双相电流刺激器Aurora Scientific Inc701
虹膜剪WPI501263-G
KClSigma-AldrichP9541
MgSO4Sigma-AldrichM7506
微型剪刀WPI503365
电机/力传感器Aurora Scientific Inc300C-LR
NaClSigma-AldrichS9888
培养皿Sigma-AldrichCLS430167
光子计数检测器Dectris IncPilatus 3 1M
不锈钢丝McMaster-carr8908K21
缝合打结镊WPI504498
视频肌节长度测量系统Aurora Scientific Inc900B

参考文献

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