肿瘤微环境是癌症生长和侵袭的重要组成部分。为了模拟癌变的进展过程，需要一种具有生物学相关性的人源基质。本方案通过应用基于人源平滑肌瘤的基质，对体外三维球体侵袭实验进行了改进。此外，本方案还引入了一种基于计算机的细胞侵袭分析方法。
本文内容
摘要
摘要
基于二维细胞培养的实验方法在体外癌症研究中被广泛使用。然而，这些方法缺乏构成肿瘤微环境的多个基本要素。为了获得更可靠的体外实验结果，已开发出多种三维（3D）细胞培养实验方法。这些方法允许癌细胞与细胞外基质相互作用，从而影响细胞行为（如增殖和侵袭）以及细胞形态。此外，这种相互作用还可能诱导或抑制多种促瘤性和抗瘤性分子的表达。为提供一种适合研究癌细胞侵袭的三维体外方法，已开发出类球体侵袭实验。目前，类球体侵袭实验主要使用动物来源的基质，例如小鼠肉瘤来源基质（MSDM）和大鼠尾腱I型胶原。考虑到人类肿瘤微环境与动物来源基质之间的差异，研究人员从良性子宫平滑肌瘤组织中开发出一种人源肌瘤来源基质（HMDM）。研究表明，HMDM 比 MSDM 更有效地诱导癌细胞的迁移和侵袭。本实验方案提供了一种简单、可重复且可靠的基于人源肿瘤的三维类球体侵袭实验方法，使用 HMDM/纤维蛋白基质，并包含成像与分析的详细操作步骤。类球体在U型超低吸附培养板中的 HMDM/纤维蛋白基质内生长，并向基质中侵袭。侵袭过程每日进行成像，并利用 ilastik 和 Fiji ImageJ 软件进行测量与分析。本实验平台以人喉原发性和转移性鳞状细胞癌细胞系为例进行了验证，但该方案同样适用于其他实体瘤细胞系。
引言
传统的二维（2D）细胞培养研究为癌症研究做出了重要贡献。目前，研究人员正越来越多地转向三维（3D）细胞培养实验，以更好地模拟体内环境1。三维癌细胞培养在细胞间和细胞-基质相互作用、基因表达谱、药物敏感性以及信号通路活性等方面，更准确地反映了复杂的肿瘤微环境2,3。
在癌症研究中，已采用多种三维细胞培养模型，如肿瘤组织外植体、肿瘤芯片以及多细胞肿瘤球体3,4。目前，多细胞肿瘤球体被广泛使用，因其能够模拟人类肿瘤体内环境的多个特征1,5。当球体直径超过500 μm时，甚至会出现缺氧区域和坏死核心，从而更真实地再现体内肿瘤的实际情况2。
已开发出多种用于三维细胞培养实验的基质，包括合成材料（如聚二甲基硅氧烷）和动物来源的材料（如大鼠尾部I型胶原蛋白和小鼠肉瘤来源基质Matrigel，后者简称MSDM）3,6,7,8。迄今为止，尚无任何商业化基质来源于人类肿瘤组织，因此这些基质缺乏人类肿瘤微环境的特征，而这些特征对癌细胞侵袭过程具有重要影响8。
Myogel（人源子宫肌瘤基质，简称HMDM）是从人子宫平滑肌瘤肿瘤组织中提取的9。研究表明，HMDM的蛋白质组成与MSDM存在显著差异。事实上，HMDM中有66%的蛋白质与MSDM不同。另一方面，某些蛋白质如层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、nidogen和表皮生长因子在两种基质中均存在10。此外，小鼠与人类在酶含量上也存在差异，人类比小鼠少78种蛋白酶11。
纤维蛋白已被广泛单独使用或与其他材料组合用作支架材料12。在三维细胞培养实验中， commercially available 人纤维蛋白原和凝血酶结合形成纤维蛋白水凝胶12。
本方案描述了先前介绍的3D肿瘤球体侵袭实验7的改进方法。新方案采用人源肿瘤来源基质，取代了原先的小鼠来源肿瘤基质，并结合使用ilastik和Fiji ImageJ软件进行成像与分析。该方案可用于多种不同实体癌细胞系的球体实验，为开发新型抗癌疗法以及研究特定分子对癌细胞侵袭的影响提供了具有生物学相关性的工具。
方案
1. 多细胞肿瘤球体的生成
注意：本方案以 UT-SCC-42A 和 -42B 细胞系为例进行演示，但也可适用于其他细胞系。
- 用 6 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 UT-SCC-42A 和 -42B 细胞，加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（75 cm2 培养瓶加 3 mL），将培养瓶置于细胞培养箱中（37 °C、5% CO2、95% 湿度）孵育 2–5 分钟。
- 在显微镜下观察细胞是否已脱落。然后加入完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（DMEM + 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、250 ng/mL 两性霉素 B、0.4 μg/mL 氢化可的松和 50 μg/mL 抗坏血酸）以中和酶活性（75 cm2 培养瓶加 6 mL），并将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
注：应选择适合所研究细胞类型的细胞培养基。 - 在 200 × g 条件下离心细胞悬液 5 分钟。
- 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 2–5 mL 完全 DMEM 培养基中。
- 计数细胞，并用完全 DMEM 培养基将细胞悬液稀释至终浓度为 20,000 个细胞/mL。
注：每种细胞系的最佳细胞接种数量需单独确定。 - 将 50 μL 细胞悬液加入每个超低吸附 96 孔圆底培养板的孔中，使每孔终浓度为 1,000 个细胞。
- 将培养板转移至细胞培养箱（37 °C、5% CO2、95% 湿度）。4 天后，用倒置显微镜观察肿瘤球的形成情况，并继续进行实验。确保每孔仅形成一个肿瘤球。
注：不同细胞系形成肿瘤球所需时间可能不同。
2. 三维球体侵袭实验
注意：请配制2倍浓度的溶液，因为凝胶在加入孔板时会以1:1比例稀释。
- 将HMDM置于冰上解冻，同时将纤维蛋白原储备液在37 °C水浴中解冻。纤维蛋白原完全溶解前不要晃动，且切勿将其置于冰上，否则会发生沉淀。
- 按适当体积混合以下试剂：1 mg/mL HMDM（终浓度：0.5 mg/mL）、0.6 U/mL凝血酶（终浓度：0.3 U/mL）、66.6 mg/mL抑肽酶（终浓度：33.3 µg/mL）和1 mg/mL纤维蛋白原（终浓度：0.5 mg/mL）。
注意：在将混合液加入孔板前再加入纤维蛋白原，并迅速操作；混合液数分钟内即会形成凝胶。每次仅处理少量孔。 - 向每孔中加入50 μL凝胶。将移液枪头对准孔内壁，缓慢移液。避免产生气泡（建议使用反向移液技术），并尽量不要使类球体偏离孔中心位置。
- 将培养板放回细胞培养孵箱，使HMDM/纤维蛋白基质在30分钟内凝固，随后在凝胶上方每孔轻柔加入100 μL完全DMEM培养基。
3. 成像
- 每天使用倒置光学显微镜对类球体进行成像。或者，使用自动成像系统。
4. 使用 Ilastik 进行图像分割
- 打开 ilastik，选择像素分类工作流程（图 1A）。该功能根据用户标注对像素进行分类。将 ilastik 项目（.ilp）保存到计算机中。
- 添加用于分析的图像。点击输入数据，然后点击添加新图像，并选择图像文件（图 1B）。
- 进行特征选择时，点击特征选择并选择特征（图 1C，红色矩形）。
注意：所选特征应大致对应于将目标与背景区分开来的视觉特性，这些特征将用于训练分类器。- 通过点击复选框来选择特征。被选中的框将变为绿色（图 1C，蓝色矩形）。
注意：用户可在此处从多种不同的特征类型和尺度中进行选择。若需根据颜色或亮度区分目标，则应选择颜色/强度特征；若需根据亮度或颜色梯度区分目标，则应选择边缘特征；若图像中的目标具有特殊的纹理外观，纹理特征则尤为重要。本实验中使用的是颜色/强度（sigma 0）和边缘（sigma 6）特征。
- 通过点击复选框来选择特征。被选中的框将变为绿色（图 1C，蓝色矩形）。
- 进行训练时，点击训练，在训练部分中有两个标签：标签 1 和标签 2（图 1D，红色矩形）。如果仅有一个标签，可通过点击添加标签来新增一个标签（图 1D，蓝色矩形）。
- 使用其中一个标签标记背景（图 1D，黄色），使用另一个标签标记细胞（图 1D，蓝色）。
- 对前 10% 的图像进行软件训练。从当前视图中选择下一张图像。
- 完成第一张图像的细胞和背景标注后，点击实时更新（图 1D，紫色矩形）。
注意：对于后续图像，ilastik 将根据之前标注的图像自动执行分析。
- 训练完成后，ilastik 已分析所有图像，点击预测导出。在源中选择简单分割；不要选择概率或其他任何选项（图 1E）。
- 在预测导出部分的选择导出图像设置…中选择所需的输出文件格式（图 1E）。点击导出全部（图 1F）以导出标注结果。文件将被导出至与原始图像相同的文件夹中。
注意：本实验中使用 .h5 格式。
5. 使用 Fiji ImageJ 进行面积分析
- 设定比例尺
- 在 Fiji ImageJ 中打开带有比例尺的原始图像（图 2A）。确保该图像与待分析图像具有相同的尺寸和分辨率。使用“直线选择”工具绘制一条已知长度的线段（图 2B）。
注意：本实验方案使用 Fiji ImageJ 1.51（64 位）和 ilastik-1.3.2rc 软件执行。 - 点击 分析，然后选择 设定比例尺（图 2C）。在 已知距离 字段中输入已知距离值，设置正确的单位，然后点击 全局应用（图 2D）。
- 在 Fiji ImageJ 中打开带有比例尺的原始图像（图 2A）。确保该图像与待分析图像具有相同的尺寸和分辨率。使用“直线选择”工具绘制一条已知长度的线段（图 2B）。
- 安装宏程序
- 如果尚未安装插件 ilastik，请按以下步骤操作：点击 帮助，选择 更新…。在弹出的 ImageJ 更新器 窗口中，点击 管理更新站点。在打开的 管理更新站点 窗口中，勾选 ilastik 旁边的复选框，然后点击 关闭。接着在 ImageJ 更新器 窗口中点击 应用更改。此过程可能需要一些时间。随后将弹出 信息 窗口，显示文字 更新成功。点击 确定，并重新启动 ImageJ。
- 点击 插件，选择 宏，然后点击 安装（图 3A）。选择 counter.ijm 文件（见 补充信息），然后点击 打开。
注意：该宏程序专为测量面积而编写。每次启动软件时均需重新安装该宏。
- 面积分析
- 在所有插件安装完成后开始分析图像。点击 插件，向下滚动至 ilastik（图 3C）。选择 导入 HDF5，选择扩展名为 .h5 的文件，点击 打开，然后点击 加载并应用 LUT（图 3C,D）。
- 按下键盘上的 a 键（宏命令），面积结果将显示在 摘要 窗口中，标记为 总面积（图 3E）。
结果
在UT-SCC-42B（转移性喉鳞状细胞癌细胞系）细胞接种后第4天，向已形成的类球体中加入基质（HMDM/纤维蛋白、MSDM或胶原蛋白）（定义为第0天），随后连续监测侵袭过程3天。此处图像通过倒置显微镜每日采集（图4）。
嵌入后，HMDM/纤维蛋白基质中的细胞在一天后即开始快速侵袭，并向基质内部延伸（图4A）。MSDM中的细胞未侵入周围基质，而是形成了一种不对称结构（图4B）。另一方面，胶原基质中的细胞仅有轻微侵袭，但由于基质收缩，分析较为困难（图4C）。在部分胶原孔中，类球体甚至在三天后消失（图4C）。
图5 展示了在HMDM/纤维蛋白基质中，原发性喉鳞状细胞癌细胞系UT-SCC-42A及其相应的转移性细胞系UT-SCC-42B的细胞侵袭定量结果。通过活细胞分析系统拍摄的视频（视频1）显示了HMDM/纤维蛋白球状体中鳞状细胞癌细胞在基质内的运动过程，这些细胞首先形成细胞索，随后其他细胞随之迁移。
图1：图像分割。使用ilastik进行图像分割的选定步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：标尺设置。 使用 Fiji ImageJ 进行标尺设置的选定步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：使用 ImageJ 进行侵袭分析。 使用 Fiji ImageJ 进行图像分析的选定步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：UT-SCC-42B细胞在三种不同基质中的侵袭。 鳞状细胞癌（SCC）细胞在三维球状体中侵袭的代表性图像。细胞侵袭过程持续观察三天，每天使用倒置显微镜拍摄图像。（A）HMDM/纤维蛋白，（B）MSDM，（C）胶原蛋白。最后一列为第3天侵袭情况的放大示意图。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：HMDM/纤维蛋白中鳞状细胞癌细胞侵袭的定量分析。 使用 ilastik 和 Fiji ImageJ 软件分析了原发性喉部 UT-SCC-42A 及其对应的转移性喉部 UT-SCC-42B 鳞状细胞癌细胞系的侵袭能力。结果为三次独立实验（每组实验设三个重复）的平均值 ± 标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
视频 1： SCC 细胞在 HMDM/纤维蛋白中连续三天的运动情况。 请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）
讨论
本方法提供了一种基于三维人类肿瘤的检测体系，用于评估癌细胞在模拟人类肿瘤微环境基质中的侵袭能力。通过常规显微镜每日成像并结合图像分析软件，可便捷地测量癌细胞的侵袭行为。该方法检测的是细胞侵袭性，而不仅仅是细胞增殖。
与MSDM不同，HMDM/纤维蛋白基质无需任何温度控制。该方法操作简便，尤其无需将类球体从一个培养板转移至另一个培养板。该方法仅有一个技术上较为敏感的步骤，即向基质中添加纤维蛋白原。由于纤维蛋白原在数分钟后即开始凝胶化，因此添加纤维蛋白原时需要熟练的移液操作，并且每次仅处理少量孔。此外，若以高压方式移液，可能会扰动类球体，使其偏离U型孔的中心位置。类球体的移位可能会影响成像，最终给分析带来困难。
通过改变HMDM或纤维蛋白原的浓度，可以对该检测方法进行调整。细胞也可被固定并染色，用于后续的分子研究。尽管该方法可改进为完全自动化的形式，但也可使用普通显微镜和两种开源软件完成，无需昂贵的设备。
与传统的基于MSDM的三维实验相比，该实验能更准确地展示细胞侵袭特性。在含有基底膜的富含层粘连蛋白的基质（如MSDM）中生长的类球体，可能表现出更多的癌细胞增殖而非实际侵袭，因此对于侵袭能力较低的多种癌细胞系而言，不适合用于侵袭实验。另一种常用的基质——I型胶原蛋白，在三维培养过程中 tends to 从边缘收缩，影响类球体的定位以及孔板的成像。此外，利用模拟人类肿瘤微环境的模型（子宫肌瘤圆盘及其可溶性基质）已证明了侵袭性较强（HSC-3）与较弱（SCC-25）的舌鳞状细胞癌细胞系之间内在侵袭特性的差异10,13。
该检测方法也比使用MSDM更具伦理优势，因为HMDM来源于人子宫肌瘤肿瘤的剩余组织。目前，HMDM是唯一可获得的人类肿瘤来源的细胞外基质产品，适用于多种与癌症相关的体外检测8,10。未来，动物组织来源的基质可能被人类肿瘤来源的基质所取代，从而减少为基质生产而牺牲动物的需求。
用三维方法替代二维细胞培养实验可提供更准确的癌细胞行为信息。目前已有多种三维模型和商用基质，但遗憾的是，尚无一种适用于所有癌细胞系。研究人员应为其特定实验选择最合适的基质。实验与基质之间的最佳匹配可能具有挑战性，但可显著提高实验结果的可靠性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢本研究的资助方：Sigrid Jusélius基金会、芬兰癌症协会以及赫尔辛基大学中心医院研究基金。作者对赫尔辛基大学生物医学中心影像单位提供的技术支持表示感谢。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 两性霉素B溶液 | Merck | A2942 | |
| 牛肺抑肽酶 | Merck | A6279 | 使用前测定蛋白浓度。 |
| 抗坏血酸 | Applichem | A1052 | |
| BioLite细胞培养处理培养瓶 | Thermo Scientific | 130190 | |
| DMEM/F-12培养基 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
| DS-Fi2数码相机 | Nikon Instruments | ||
| DS-U3数码相机控制器 | Nikon Instruments | ||
| Eclipse TS100倒置显微镜 | Nikon Instruments | ||
| 胎牛血清（FBS） | Gibco by Life Technologies | 10270106 | 使用前在56 °C水浴中加热灭活30分钟。 |
| 人血浆纤维蛋白原（去除了纤溶酶原） | Merck | 341578 | 溶解度：在H2O中为25 mg/ml。溶解前将H2O和纤维蛋白原预热至37 °C。在纤维蛋白原完全溶解前不要扰动。储存于-70 °C的储备液应在保持于37 °C的水浴中解冻。 |
| Fiji ImageJ 1.51图像处理程序 | Freeware, NIH | ||
| 氢化可的松 | Merck | H0888 | |
| 用于图像分类与分割的Ilastik软件 | Freeware | ||
| IncuCyte Zoom活细胞分析系统 | Essen BioScience | ||
| Myogel | 实验室自制 | ||
| 青霉素-链霉素 | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 实验室自制 | ||
| Scepter 2.0细胞计数仪 | Merck | PHCC20040 | |
| Scepter细胞计数传感器，60 µm | Merck | PHCC60050 | |
| 人血浆凝血酶 | Merck | T6884-100UN | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.5%）10倍浓缩液，不含酚红 | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
| 超低吸附96孔板 | Corning | 7007 | |
| UT-SCC-42A和UT-SCC-42-B细胞系 | 这些细胞系由芬兰图尔库大学医院耳鼻喉头颈外科部门建立（图尔库，芬兰）。 |
参考文献
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