本方案描述了使用声波液滴喷射技术在384孔板中对哺乳动物细胞进行高通量质粒转染的方法。耗时且易出错的DNA分配与多重化操作，以及转染试剂的分配，均由软件驱动并通过纳升级分液设备完成。随后将细胞接种至这些预先加样好的孔中。
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本文内容
摘要
摘要
细胞转染是许多生物学研究中不可或缺的技术，其实现需要精确控制多个参数以确保准确性和成功率。传统方法通常通量较低，且耗时较长、易出错，尤其是在多重转染多种质粒时更为明显。我们开发了一种简便、快速且准确的方法，利用声波液滴喷射（ADE）技术在384孔板中进行细胞转染。本研究所使用的纳米移液装置 基于该技术，能够以高速度将纳升级体积的液体从源板精确转移至目标板。该系统可根据预设的电子表格，自动分配并多重组合DNA和转染试剂。本文提供了一种基于ADE技术的高通量质粒转染优化方案，可实现高达90%的转染效率，并在共转染实验中接近100%的共转染率。我们在前期工作的基础上进一步开发了一个用户友好的基于电子表格的宏程序，能够管理包含多达1,536种不同质粒的文库中每孔最多四种质粒的组合，同时配套开发了基于平板电脑的移液指南应用程序。该宏程序可自动生成源板所需的模板，并输出适用于纳米移液仪和平板应用程序的即用型文件。四步转染流程包括：i）使用常规液体处理设备加入稀释液，ii）质粒的分配与多重组合，iii）由纳米移液仪加入转染试剂，iv）将细胞接种至预先加样好的孔中。这种基于软件控制的ADE质粒多重转染方法，使即使非本领域的专业人员也能快速、安全地完成可靠的细胞转染。该方法有助于快速确定特定细胞类型的最优转染条件，并可推广应用于更大规模或手动操作的实验体系。本方案适用于非混合筛选策略中的多种应用，例如人类ORFeome蛋白（基因组中所有开放阅读框[ORFs]的集合）表达或基于CRISPR-Cas9的基因功能验证。
引言
本文详细介绍了一种基于声波液体纳米分配仪在384孔板中对哺乳动物细胞进行高通量DNA质粒多重共转染的方法，即使非本领域的专业人员也能顺利操作。该方法为近期发表的新技术1，可在1小时内于单次实验中完成多达384个独立的质粒DNA多重组合与转染条件。单转染或共转染实验均取得成功，在转染细胞群体中实现了接近100%的共转染效率。本方案显著简化了转染流程，因为大多数繁琐、耗时且易出错的步骤现已由软件自动控制（整体流程概览见图1）。为进一步提升操作便捷性、避免整个过程中的人为错误，并帮助非专业人员也能实现高效转染，我们还开发了专用辅助工具。所述方案包含一个我们自主开发的“用户友好型”宏电子表格，可用于管理384个独立转染条件，并支持每孔最多同时转染四种质粒。该宏程序可根据输入的实验设计，自动生成源板模板，用于从起始质粒储备液中加载所需体积的DNA，同时生成驱动纳米分配仪软件运行所需的文件。由于在384孔源板中手动加样DNA过程繁琐且容易出错，我们还开发了一款专用的平板应用程序，可在用户按照模板添加DNA溶液时提供操作引导。
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方案
1. 预先准备
- 蠕动泵液体处理程序的准备
注意：在本方案的稀释剂和细胞分配步骤中，必须准备专用程序，需考虑分配头相对于所用板的高度以及步骤目的。- 对于1 µL稀释剂分配步骤，安装1 µL加样带，并按照步骤1.1.1.1和1.1.1.2所述设置准备程序。
- 将流速参数调整为高，以获得最佳通量，因为此步骤不会对生物材料造成损伤。将分配高度调整为9.6 mm（根据所用细胞培养板，补充图1），以确保1 µL液滴在分配过程中接触孔底。
注意：此步骤至关重要，可避免液滴在分配头滞留直至积聚到足够体积才滴落。 - 将板面 clearance 高度调整为14.4 mm，以便在每行分配后分配头可在板上方自由移动。目视检查蠕动泵液体处理头高度设置是否正确：确保分配过程中无液滴滞留在分配尖端，并确认分配头足够高，可在每行分配后顺利移动。
注意：避免液滴滞留是关键参数，否则会影响分配体积的准确性。
- 将流速参数调整为高，以获得最佳通量，因为此步骤不会对生物材料造成损伤。将分配高度调整为9.6 mm（根据所用细胞培养板，补充图1），以确保1 µL液滴在分配过程中接触孔底。
- 对于40 µL细胞悬液的分配，安装10 µL加样带，并按照步骤1.1.2.1–1.1.2.2所述设置准备程序。
- 将流速参数调整为低，以低速分配细胞，避免剪切应力和细胞对孔底的高冲击造成潜在细胞损伤。将分配高度调整为1....
- 对于1 µL稀释剂分配步骤，安装1 µL加样带，并按照步骤1.1.1.1和1.1.1.2所述设置准备程序。
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结果
为了确定ADE技术是否可用于自动化反向转染方案，我们使用表达红色荧光蛋白tdTomato的质粒，通过荧光显微镜监测细胞转染效率。首先旨在确定最佳转染参数，我们交叉测试了不同的稀释液体积和总DNA用量。使用稀释液体积的目的是使点加后的DNA液滴能够在孔内充分铺展，从而避免初步实验中观察到的转染不均一现象（即仅在孔中心区域发生转染）。如图6A所示，使用脂质多聚复合物试剂20对HeLa细胞进行转染是成功的。有趣的是，当使用1 µL稀释液体积时，5至30 ng范围内的DNA用量表现出相同的转染效率，细胞转染率高达90%；而当DNA用量更高（如50 ng和100 ng）时，则观察到转染效率急剧下降。我们尝试了从15 nL到4 µL的不同稀释液体积，结果表明1 µL为最佳条件，此处以30 ng DNA的实验结果为例，显著地证明了这一点。
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讨论
建立和优化针对特定细胞系的准确高通量转染方法需要科研人员遵循本节所述的一些关键参数。我们强烈建议在整个实验方案中首先采用推荐值，因为这些针对HeLa细胞优化的条件也被证实对HEK细胞具有高效性。然而，由于最佳参数可能因细胞系和转染试剂的不同而异，因此可通过以下方式确定最优条件： 通过改变细胞数量、稀释液体积、总DNA量以及转染试剂的种类、浓度甚至使用体积，对本方案在HeLa细胞中的优化过程进行了调整1.
本文介绍的整体实验方案经过开发和进一步优化，即使在该领域缺乏经验的新手也能顺利完成细胞转染。为实现这一目标，我们开发了若干关键工具，以尽可能简化操作流程并避免人为错误：一个用户友好的电子表格宏，用于便捷地设计实验；以及一款平板应用程序，可引导用户正确地填充源板（或多块源板）。
因此，为确保该方案的可靠性，只需控制以下几个关键步骤：i）合理的实验设计；ii）使用传统的蠕动泵液体处理仪进行准确的蠕动泵分配；iii）基于声波的DNA和转染试剂的精确分配；iv）在转染试剂分配前.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者披露了以下机构对本研究、文章撰写和/或发表提供的财务支持：法国国家健康与医学研究院（Inserm）、里尔大学（Lille University）、里尔巴斯德研究所（Lille Pasteur Institute）、北部大区议会（Conseil Régional du Nord）、药物跨学科研究平台（PRIM-HCV1 和 2, Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament）、法国国家科研署（Agence Nationale de la Recherche, ANR-10-EQPX-04-01）、欧洲区域发展基金（Feder, 12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed）以及欧洲共同体（ERC-STG INTRACELLTB n° 260901）。作者谨向 S. Moureu 博士、B. Villemagne 博士、R. Ferru-Clément 博士和 H. Groult 博士致谢，感谢他们对稿件提出的审阅意见与修改建议。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 384LDV 微孔板 | Labcyte | LP-0200 | |
| 384 孔微孔板 μClear 黑色 | Greiner | 781906 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma | A9393-5G | 用于转化含氨苄青霉素表达载体的细菌的筛选抗生素 |
| 安卓平板电脑 | Samsung | Galaxy Note 8 | 在手动分配源板时用于引导用户操作 |
| Aniospray Surf 29 | Anios | 2421073 | 用于清洁 MicroFlo 加样头的消毒剂 |
| Columbus 软件 | Perkin Elmer | 图像分析软件 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，含 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸钠 | Thermo Fisher Scientific | 10566032 | 细胞培养基 |
| Echo Cherry Pick 1.5.3 软件 | Labcyte | 通过 *.csv 文件驱动 Echo550 设备实现基于声波移液（ADE）的分配；纳米加样器软件 | |
| Echo550 | Labcyte | 基于声波移液（ADE）的加样设备 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 添加至细胞培养基中 |
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | 用于固定细胞 |
| HeLa 细胞 | ATCC | HeLa (ATCC® CCL-2™) | |
| Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | 水溶液，10 mg/mL |
| INCell 分析仪 6000 | GE Healthcare | 29043323 | 自动化激光共聚焦成像平台 |
| LB 培养基 | Thermoischer Scientific LB 肉汤基础（Lennox L 肉汤基础）®，粉末 | 12780052 | 用于细菌生长的培养基 |
| 裂解缓冲液（A2） | Macherey-Nagel | 740912.1 | 来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒 |
| MicroFlo 10µL 加样卡 | Biotek Instruments Inc | 7170013 | 与 Microflo 分液器配合使用 |
| MicroFlo 1μL 加样卡 | Biotek Instruments Inc | 7170012 | 与 Microflo 分液器配合使用 |
| MicroFlo 分液器 | Biotek Instruments Inc | 7171000 | 基于蠕动泵的液体处理设备 |
| 微量分光光度计 | Denovix | DS-11 分光光度计 | 用于测定样品的 DNA 浓度 |
| mVenus 质粒 | mVenus cDNA 通过酶切（Age1/BsrG1 位点）和连接克隆至 tdTomato-N1 质粒中 | 载体类型：哺乳动物表达载体，融合蛋白：mVenus | |
| 中和缓冲液（A3） | Macherey-Nagel | 740913.1 | 来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒 |
| NucleoSpin 质粒提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740588.50 | 用于从细菌培养物中制备质粒 |
| 优化型改良伊格尔培养基（Opti-MEM） | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 可选洗涤缓冲液 洗涤缓冲液（A4） | Macherey-Nagel | 740914.1 | 来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒 |
| 轨道摇床 | 大容量恒温摇床 | 444-7084 | 用于在温和振荡及 37°C 条件下培养细菌 |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 10010001 | |
| 质粒小提柱 | Macherey-Nagel | 740499.250 | 硅胶膜小提柱，用于从细菌培养物中制备质粒 |
| 重悬缓冲液（A1） | Macherey-Nagel | 740911.1 | 来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒 |
| RNase A | Macherey-Nagel | 740505 | 来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒的酶，用于从细菌培养物中制备质粒 |
| tdTomato-N1 质粒 | Addgene | 质粒 #54642 | 载体类型：哺乳动物表达载体，融合蛋白：tdTomato |
| TransIT-X2 动态递送系统 | Mirus Bio | MIR 6000 | |
| 洗涤缓冲液（AW） | Macherey-Nagel | 740916.1 | 来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒 |
| 3D 打印机 | Creality | CR10S | 用于打印微孔板适配器 |
| Blender 软件 | https://www.blender.org/ 在 GNU 通用公共许可证（GPL）下的免费软件。 | 版本 2.79b | 用于设计微孔板适配器 |
参考文献
- Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
- Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
- Thermo Fisher Scientific.
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重印与许可
