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方法文章

利用声波纳米点样技术进行高通量DNA质粒多重化与转染

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DOI：

10.3791/59570

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2019年8月8日

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

本文内容

摘要

本方案描述了使用声波液滴喷射技术在384孔板中对哺乳动物细胞进行高通量质粒转染的方法。耗时且易出错的DNA分配与多重化操作，以及转染试剂的分配，均由软件驱动并通过纳升级分液设备完成。随后将细胞接种至这些预先加样好的孔中。

摘要

细胞转染是许多生物学研究中不可或缺的技术，其实现需要精确控制多个参数以确保准确性和成功率。传统方法通常通量较低，且耗时较长、易出错，尤其是在多重转染多种质粒时更为明显。我们开发了一种简便、快速且准确的方法，利用声波液滴喷射（ADE）技术在384孔板中进行细胞转染。本研究所使用的纳米移液装置 基于该技术，能够以高速度将纳升级体积的液体从源板精确转移至目标板。该系统可根据预设的电子表格，自动分配并多重组合DNA和转染试剂。本文提供了一种基于ADE技术的高通量质粒转染优化方案，可实现高达90%的转染效率，并在共转染实验中接近100%的共转染率。我们在前期工作的基础上进一步开发了一个用户友好的基于电子表格的宏程序，能够管理包含多达1,536种不同质粒的文库中每孔最多四种质粒的组合，同时配套开发了基于平板电脑的移液指南应用程序。该宏程序可自动生成源板所需的模板，并输出适用于纳米移液仪和平板应用程序的即用型文件。四步转染流程包括：i）使用常规液体处理设备加入稀释液，ii）质粒的分配与多重组合，iii）由纳米移液仪加入转染试剂，iv）将细胞接种至预先加样好的孔中。这种基于软件控制的ADE质粒多重转染方法，使即使非本领域的专业人员也能快速、安全地完成可靠的细胞转染。该方法有助于快速确定特定细胞类型的最优转染条件，并可推广应用于更大规模或手动操作的实验体系。本方案适用于非混合筛选策略中的多种应用，例如人类ORFeome蛋白（基因组中所有开放阅读框[ORFs]的集合）表达或基于CRISPR-Cas9的基因功能验证。

引言

本文详细介绍了一种基于声波液体纳米分配仪在384孔板中对哺乳动物细胞进行高通量DNA质粒多重共转染的方法，即使非本领域的专业人员也能顺利操作。该方法为近期发表的新技术1，可在1小时内于单次实验中完成多达384个独立的质粒DNA多重组合与转染条件。单转染或共转染实验均取得成功，在转染细胞群体中实现了接近100%的共转染效率。本方案显著简化了转染流程，因为大多数繁琐、耗时且易出错的步骤现已由软件自动控制（整体流程概览见图1）。为进一步提升操作便捷性、避免整个过程中的人为错误，并帮助非专业人员也能实现高效转染，我们还开发了专用辅助工具。所述方案包含一个我们自主开发的“用户友好型”宏电子表格，可用于管理384个独立转染条件，并支持每孔最多同时转染四种质粒。该宏程序可根据输入的实验设计，自动生成源板模板，用于从起始质粒储备液中加载所需体积的DNA，同时生成驱动纳米分配仪软件运行所需的文件。由于在384孔源板中手动加样DNA过程繁琐且容易出错，我们还开发了一款专用的平板应用程序，可在用户按照模板添加DNA溶液时提供操作引导。

实验设计流程图：生成筛选列表、制备微孔板、转染步骤。
图 1：实验工作流程。 自动化高通量反向转染实验方案的示意图（从实验设计到定制生物学检测）。手动操作步骤以手形符号标示，各步骤所需的大致时间标注在红色方框内。 请点击此处查看该图的放大版本。

许多基于细胞的实验都始于质粒DNA转染，尽管已有并仍在不断开发多种专用试剂以提高转染效率和/或简化操作流程，但仍有许多问题有待解决2,3,4。质粒DNA细胞转染涉及多个步骤才能实现高效转染，例如初始复合物的摄取、内涵体逃逸以及向细胞核的胞质运输5,6。除了氯化钙沉淀法或电穿孔、显微注射等依赖专用设备的物理方法7之外，现代化学方法主要致力于在降低细胞毒性的前提下增强DNA向细胞内的递送效率8,9。使用可形成类脂质体复合物的脂质或阳离子聚合物，以及近年来发展的非脂质体聚合物化学系统，使转染操作更简便且效率更高10。尽管已有上述进展，细胞转染仍需具备特定操作技能才能准确完成，因为大多数物理或化学转染方案均要求科研人员手动配制每一种DNA转染反应条件，从而限制了通量。为克服这一问题，已开发出使用化学转染试剂的反向转染方案11,12,13，使用户能够更快地测试或组合多种质粒。在这些方案中，核酸与转染试剂形成的复合物在细胞接种之前即已预先形成。然而，这些反向转染方案仍受限于DNA溶液的手动操作以及各个独立条件的组合过程。尽管可在96孔板中进行此类操作，但DNA的配制与分装过程繁琐，且极易出错。当需要多种质粒以不同剂量相互多重组合时，细胞转染的难度进一步加大，耗时更长，人为误差几乎不可避免。若将反向转染方法扩展至384孔板格式，即使仅涉及少量多重DNA转染条件，也会因以下原因而成为几乎无法实现的挑战：i）每个孔中需处理的DNA用量、转染试剂或反应混合物体积均低于1 µL；ii）为384个独立条件进行质粒的多重组合变得极为复杂；iii）向384个孔逐一递送试剂的过程极其耗时；iv）极易出错。事实上，由于已分装的液体体积过小，无法通过肉眼区分空孔与已加样孔，因此很难确保将正确的溶液加入目标孔中；v）最后，由于完成所有必要分装步骤所需时间较长，混合物在加细胞前极易因蒸发而干涸。综上所述，建立高通量质粒DNA转染实验的主要限制因素在于实验的微型化，这要求进行低体积的多重操作与管理，而此类操作已无法通过人工完成，同时传统蠕动泵式液体处理系统也难以可靠实现。

为了证明此类检测方法在实现自动化和高通量方面的难度，迄今为止仅有少数关于转染自动化的尝试被报道：一种是使用商用液体处理设备和磷酸钙沉淀法在96孔板中进行操作14；另一种是近期采用脂质复合物试剂和微流控芯片实现280个独立转染反应的方法15，但该方法需要在此领域具备专门的技术能力。另一种方法是声泳技术，可通过液体悬浮实现流体操控与混合，并已被用于24至96孔板格式的DNA转染16。尽管该方法可行，但通量极低，因为在接种前，每个检测点的细胞与DNA转染混合物混合后均需60秒的孵育时间，这意味着完成一块完整的96孔板至少需要96分钟。此外，该方案距离被广大生物学家普遍应用仍有较大差距，因为该研究使用的是实验室自行设计和制造的装置，目前尚未在市场上销售。相比之下，近年来出现了一种易于使用的、由软件驱动的基于声波的液体分配技术，即纳升级液体分配设备。该设备利用聚焦的声波能量，可精确控制将2.5 nL至500 nL的小体积液体从源板转移至目标板17。这种被称为声波液滴喷射（ADE）的技术具有多种优势：完全自动化、无接触、无需移液头、准确、精确、高度可重复，并具有高通量特性18。该技术最初主要用于递送二甲基亚砜（DMSO）溶液，随后其参数已优化，可适用于水相缓冲液的分配19。因此，声波纳米分配器似乎适用于反向细胞转染方案，并有望克服上述大多数手动操作的局限性。由于此前尚未有使用该技术进行质粒转染的报道，我们近期评估了基于声波的液体分配系统在实施反向细胞转染中的适用性。

利用纳米分配器的高通量和操作简便性，我们通过交叉测试多个可能影响DNA转染效果的参数，优化了针对HeLa细胞的反向转染方案，这些参数包括总DNA用量、起始质粒DNA浓度、稀释液体积、转染试剂以及铺板细胞数量，所有测试均在单个384孔板上完成。该优化方案克服了上述传统细胞转染方法中的手动操作局限性，相较于其他自动化转染尝试具有多项优势。首先，该方案实现了微型化，从而显著降低了转染试剂和质粒DNA制备的成本。其次，其通量更高且重复性更好（即使对初学者而言），可在不到1小时内完成整块384孔板的转染操作。最后，该方案由软件驱动，可精确控制分配的DNA量，并实现多种质粒的同时转染。事实上，借助纳米分配器的软件（材料表），用户可制定研究计划，精确控制从指定的源孔板向目标孔板分配的液体体积。

本文所述方案主要适用于具备纳米分配仪并希望开展高通量转染实验的研究人员，同时也适用于希望利用该方案在高通量条件下快速优化特定细胞类型转染参数的研究者。事实上，我们已证实，通过该纳米级方案确定的优化参数可直接应用于更大规模或手动操作的转染实验。此外，由于本方案所使用的转染试剂根据生产商说明可适用于DNA或siRNA转染，因此该方案也适用于希望开展基因过表达或基因沉默阵列研究的研究人员。用于转染实验的DNA预填充目的板在使用前可保存长达7天而不损失转染效率，这是该方案在上述应用中的另一优势。

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方案

1. 预先准备

  1. 蠕动泵液体处理程序的准备
    注意：在本方案的稀释剂和细胞分配步骤中，必须准备专用程序，需考虑分配头相对于所用板的高度以及步骤目的。
    1. 对于1 µL稀释剂分配步骤，安装1 µL加样带，并按照步骤1.1.1.1和1.1.1.2所述设置准备程序。
      1. 将流速参数调整为高，以获得最佳通量，因为此步骤不会对生物材料造成损伤。将分配高度调整为9.6 mm（根据所用细胞培养板，补充图1），以确保1 µL液滴在分配过程中接触孔底。
        注意：此步骤至关重要，可避免液滴在分配头滞留直至积聚到足够体积才滴落。
      2. 将板面 clearance 高度调整为14.4 mm，以便在每行分配后分配头可在板上方自由移动。目视检查蠕动泵液体处理头高度设置是否正确：确保分配过程中无液滴滞留在分配尖端，并确认分配头足够高，可在每行分配后顺利移动。
        注意：避免液滴滞留是关键参数，否则会影响分配体积的准确性。
    2. 对于40 µL细胞悬液的分配，安装10 µL加样带，并按照步骤1.1.2.1–1.1.2.2所述设置准备程序。
      1. 将流速参数调整为低，以低速分配细胞，避免剪切应力和细胞对孔底的高冲击造成潜在细胞损伤。将分配高度调整为11.43 mm（根据所用细胞培养板，补充图1），该高度应足够高以降低分配过程中细胞对孔底的冲击，但又足够低以避免液滴在分配头滞留。将板面 clearance 高度调整为16 mm，以便在每行分配后分配头可在板上方自由移动。
      2. 目视检查蠕动泵液体处理头高度设置是否正确：确保分配过程中无液滴滞留在分配尖端，并确认分配头足够高以在每行分配后顺利移动。
        注意：避免液滴滞留是关键参数，否则会导致分配的细胞数量不可靠。
  2. 质粒DNA制备（经典小量提取方案）
    1. 将转化后的DH5α菌株在LB培养基中培养，添加125 µg/mL氨苄青霉素选择性抗生素（材料表），于37 °C、200 rpm轻柔振荡条件下在旋转摇床（材料表）上过夜培养。
    2. 收集2 mL培养物，以6,000 x g离心5分钟沉淀细胞，弃去上清液。
    3. 用250 µL含RNase A的重悬缓冲液（材料表）重悬细胞沉淀。加入250 µL裂解缓冲液，按制造商说明在室温下孵育5分钟。
    4. 加入300 µL中和缓冲液（材料表）终止裂解反应，并短暂涡旋混匀。将离心管以11,000 x g离心5分钟。
    5. 将新的质粒小提柱（材料表）放入2 mL收集管中，将上清液倾入柱中，以11,000 x g离心1分钟。
    6. 弃去穿流液，将小提柱放回收集管中。
    7. 根据制造商说明，用500 µL可选洗涤缓冲液（材料表）洗涤质粒小提柱，并以11,000 x g离心1分钟。
    8. 弃去穿流液，将质粒小提柱放回收集管中。
    9. 加入700 µL含乙醇的洗涤缓冲液（材料表），根据制造商说明以11,000 x g离心1分钟。
    10. 弃去穿流液，将质粒小提柱及其收集管再以11,000 x g离心2分钟，以干燥硅胶膜。
    11. 将干燥的质粒小提柱放入新的1.5 mL离心管中，加入30 µL预热至60 °C的去离子水，室温孵育2分钟，然后以11,000 x g离心1分钟。
    12. 弃去质粒小提柱，保留含有纯化质粒DNA的洗脱液。
    13. 使用微量分光光度计（材料表）测定洗脱DNA的浓度。
      1. 打开分光光度计，选择DNA测定模式。
      2. 抬起分光光度计的采样臂，用移液器将1 µL水加至测量基座上，进行空白校准。
      3. 放下采样臂，开始空白测量，并等待完成。
      4. 抬起采样臂，擦拭上下基座上的样品。
      5. 将1 µL DNA溶液加至下基座上进行测量。
      6. 放下采样臂，开始DNA浓度测定，并等待完成。
      7. 抬起采样臂，擦拭上下基座上的样品。
      8. 如需进一步测定DNA浓度，重复步骤1.2.13.5–1.2.13.7。
    14. 完成测量后，将DNA溶液于4 °C保存，直至使用。

2. 实验设计及生成用于驱动基于 ADE 的分配操作的拣选列表

注意：已开发出一种专用的“用户友好型”电子表格宏，用于管理DNA用量，并在384孔板中混合最多四种质粒。根据输入的实验设计，该宏将生成必要的文件，以通过纳米分配器驱动基于ADE的DNA转染实验。为生成这些文件，需在模板表中填写若干字段，如图2所示。

384孔转染模板，Excel示意图，移液指南，DNA转移，体积计算步骤
图2：使用电子表格宏生成用于驱动 ADE 分配的拣选列表。需要填写多个参数，即 (1) 转染试剂（TR）及在源板中需使用的最小/最大体积，（2) 源板中待分装的初始质粒浓度，以及 (3整个384孔板的设计，包括每个孔中预期的质粒数量和多重组合。4) 生成选择列表 激活后可验证各个字段，待正确填写完毕，系统将自动生成用于DNA和TR加样以及所需源板模板的下拉列表。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 在粉色字段中输入纳米分配仪的实验方案参数。将转染试剂（TR）混合物体积设置为 500 nL。将源板孔中的最小体积设置为 4 µL。将源板孔中的最大体积设置为 11.25 µL。
    注意：此处使用的纳米分配仪在一次声波液滴喷射（ADE）运行中最多只能转移 500 nL。这些粉色字段已预填推荐值，但可根据用户需求进行修改。
  2. 在对应底层 DNA 的蓝色字段中输入起始 DNA 浓度为 100 ng/µL。
    注意：该数值为先前确定的最佳浓度，但也可根据不同的用户需求进行调整。
  3. 在灰色/绿色字段中输入所需的 DNA 量。输入 384 孔中的 DNA 量和质粒名称，若多个孔使用相同的质粒，请确保拼写一致。
  4. 生成源板设计、取样清单文件和移液指南文件。点击 生成取样清单，以允许宏程序根据相应工作表中收集的数据生成 DNA-Picklist.csv、T.R.-Picklist.csv 和 384-Wells-Pipetting-Guide.csv 文件。如有提示，请修正填充为橙色的单元格数值，因其表示存在错误或纳米分配仪无法处理的体积。
  5. 从 源板 工作表打印模板。模板中标明了质粒名称以及需填入孔中的最小体积。同样，下一步需填入后续孔中的转染试剂混合物体积以 TR 标示，并以绿色高亮显示。

3. 使用384孔板移液向导应用程序制备DNA来源板

  1. 使用蒸馏水将步骤 1.2.14 中保存的 DNA 质粒稀释至 100 ng/µL。
  2. 根据板的尺寸校准 384 孔网格：在平板电脑上打开 384 孔移液指南应用程序（图 3）。将源板放置在下屏的网格上，在左上角的校准菜单中，点击 + 或 -（或使用红色光标）以放大或缩小网格和孔的尺寸，使绿色孔与板的四个角孔对齐。

384孔板移液指南；基于平板电脑的设置；逐步移液流程；实验室自动化。
图3：384孔板移液指南应用程序的使用。（1）将384孔网格校准至孔板尺寸；（2）使用双面胶将通用3D打印孔板适配器固定到平板电脑上；（3）将孔板放置在适配器上；（4）移动网格位置，使其与安装好的孔板居中对齐；（5）锁定校准步骤；（6）打开“384孔移液指南.csv”文件；（7）根据文件列表，应用程序将依次显示预期的源板名称、试剂（DNA或转染试剂）、浓度以及需加入目标孔中的体积，并逐个高亮提示操作孔位；（8）左右箭头按钮可帮助用户按照移液指南，依据电子表格宏中定义的源板模板，便捷地完成试剂添加。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用双面胶带将3D打印的板适配器固定在屏幕上，以避免在分配过程中源板发生移动。如有需要，可使用旋转箭头以及上/下/右/左按钮移动已校准的网格，将屏幕上的网格与板的位置对齐。当网格和孔径尺寸已正确校准并定位后，勾选锁定校准框。
  2. 点击文件，打开384孔移液指南.csv文件。根据屏幕提示，手动将指定浓度和指定体积的质粒加入对应目标板中白色高亮显示的孔内。使用–或+箭头在DNA分配流程中向前或向后切换。当到达第一个需要加载的转染试剂溶液时，停止分配。
  3. DNA分配完成后，从适配器上取下源板。若需填充多个源板，则将新的源板放置于适配器上，并继续按照分配说明操作。DNA分配结束后，对装有DNA的源板进行离心（1,500 × g，2分钟），以确保液体表面平整，并去除可能引起基于非接触式移液（ADE）转移误差的气泡。

4. 基于蠕动泵液体处理系统的终板1 µL稀释液分配

注意：步骤 4.1-4.5 需在生物安全柜中进行。

  1. 使用喷雾消毒剂（材料表）喷洒1 µL加样头以进行消毒，并使消毒液进入吸头架内。用吸水纸吸去残留的消毒剂。将1 µL加样头安装到蠕动液体处理装置上。打开设备，确保加样头类型设置正确（1 µL），以及板格式设置正确（384孔）。
  2. 对管路的整个内腔进行消毒：将管路整理器（同时固定八根管路）插入无菌容器中，并加入5 mL 70%乙醇。利用蠕动液体处理装置的预冲洗功能，先将乙醇泵入管路中冲洗，然后依次在同一个容器中加入5 mL蒸馏水和5 mL无血清培养基（添加了100 U/mL青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基[DMEM]；材料表）进行冲洗。通过肉眼观察每根管路的液体流动情况，确保无任何管路堵塞。
  3. 用无血清培养基对管路进行预冲洗：在新的无菌容器中加入10 mL预热的无血清培养基，并将管路整理器浸入其中。按下蠕动液体处理装置的预冲洗按钮，持续约10秒。再次通过肉眼观察所有管路的液体流动，确认无堵塞。
  4. 向孔板中每孔加入1 µL稀释液。将一个无菌的384孔培养板（目标板）放置在蠕动液体处理装置的板架上，并取下盖子。
  5. 运行预校准程序，向384孔板的每个孔中分配1 µL液体。分配时间约为8秒。然后重新盖上384孔板的盖子。
    注意：也可在生物安全柜中使用多通道微量移液器手动完成此步骤。

5. 手动分配体积控制的调查性能

注意：详见图4。

  1. 运行纳米分配仪程序，进入诊断选项卡，勾选源板 Out 复选框，将源板放置在板架上，然后勾选 In 以载入板子。当系统提示时，选择 384LDV_AQ_B2 以将纳米分配仪设置为水相缓冲液分配模式，然后点击 Ok。
  2. 在 杂项 菜单中选择 Survey，然后点击 Launch。选择需要分析的预填充孔，然后点击 Go 按钮。验证测量体积是否与预期值一致，并确保没有孔的加载体积超过 12 µL，以避免转移失败。

数据分析软件界面；逐步流程图；控制设置和参数输入。
图4：定义扫描软件参数。（1）启动纳升级分配仪程序。（2）打开诊断选项卡。（3）通过先勾选源板的出，然后勾选入，插入源板。（4）在提示时，从菜单中定义源板类型。（5）在杂项框中，从下拉菜单中选择扫描。（6）单击启动以运行扫描程序。（7）选择需要测量的预填充孔。（8）单击“运行”开始分析。（9）扫描完成后，测得的体积将写入相应选定的孔中。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 由 ADE 驱动的 DNA 分配至目标板

  1. 运行拣选列表软件，将384孔源板和目的板类型分别设置为384_LDV和Greiner 384PS_781096（图5）。通过选择将设备设置为水相缓冲液分配模式 384LDV_AQ_B2, 取消勾选“optimize transfer throughput”。

数据分析工作流程、微孔板数据导出的软件设置界面、用户界面指南。
图5：基于加样列表的分配性能。（1）启动纳米分配仪软件。在“协议”选项卡中，选择（2）样本板格式、（3）目标板类型，并（4）取消勾选“优化转移通量”。（5）选择加样列表选项卡。（6）点击导入，并选择正确的 *.csv 文件（DNA-加样列表 或 T.R.-加样列表）。（7）选择文件后，点击导入。（8）点击播放并保存该协议。（9）通过点击模拟执行一次分配模拟，或（10）通过点击运行启动已编程的分配操作。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 选择“Pick List”选项卡，点击 Import，选择 DNA-Picklist.csv 文件。点击 Play 并保存程序。点击 Simulate 以模拟已编程的分配过程，确保挑取列表与预期实验设计一致。完成后，点击 Close。
  2. 点击 Play，然后点击 Run，以启动分配程序：当提示时，将所需的源板（手动加入DNA溶液）和目标板（含稀释液）插入纳米分配仪中。
    注意：分配时间约为 5–20 分钟，适用于完整的 384 孔板，具体时间取决于所选体积及实验设计中分配操作的总数。
  3. 或者，可在此暂停程序，因为含稀释液和DNA的板可在干燥或冷冻条件下保存最多7天。对于干燥保存，将板在室温下置于实验台上自然干燥，然后以相同方式储存。在进行转染步骤（第7节）前，将冷冻保存的板解冻并离心（1,500 × g，2 分钟）。
     

7. 由 ADE 驱动的转染试剂分配

  1. 在生物安全柜中，用无血清培养基将脂质-多聚体复合物转染试剂现配稀释至1x终浓度。涡旋混匀后，立即根据宏程序设计的预定义源板，按照步骤3.4中所述的预校准384孔移液引导程序，分配该转染试剂混合液。
    注意：试剂加入源板后，切勿进行离心，因离心后未观察到转染效果。
  2. 运行纳米分配仪程序，按照第5节所述执行“扫描”操作，以控制所有手动添加的液体体积 TR 避免因体积超过而造成分液错误的源板孔 12 µL.
  3. 点击 重置 清除挑取列表软件中DNA挑取列表的样本列表，并确认设备参数仍设置为水相缓冲液以及步骤6.1中所用的源板和目的板类型。
  4. 点击 导入 并选择 TR-Picklist.csv 文件。点击 播放 并根据提示保存方案；（此步骤可选但强烈推荐）点击以模拟 programmed 转染试剂混合物的分配过程，确保分配设计正确无误。 模拟 按钮。完成后，点击 关闭.
  5. 点击 播放，以及 然后 运行 单击按钮以启动分配程序：按要求将源板（含TR混合液）和目标板（含稀释液和DNA）放入纳米分配仪中。
    注意：当向完整的384孔板中每孔分配500 nL TR混合液时，分配时间少于20分钟。
  6. 按照制造商方案，在将TR加入DNA后，室温孵育15–30分钟。

8. 基于蠕动泵液体处理系统的细胞分配

  1. 准备蠕动泵液体处理仪用于细胞分配。用 Aniospray Surf 29 消毒剂喷洒 10 µL 加样头进行消毒，并用纸巾吸去残留液体。将加样头安装到蠕动泵液体处理仪上，将加样头类型设置更改为 10 µL，并确保板格式设置为 384 孔。
  2. 按照步骤 4.2 中所述方法对 10 µL 加样头管路进行消毒。将管路整理器浸入无菌容器中，依次用 5 mL 70% 乙醇冲洗管路，再用 5 mL 蒸馏水冲洗，最后用 5 mL 无血清培养基冲洗，所有液体均加入同一容器中，直至每根管路排空为止。
  3. 准备待分配的细胞悬液。从一个融合的 HeLa 细胞 B10 培养皿中，用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，然后在 37 °C 下用胰蛋白酶/EDTA 消化 5 分钟使细胞解离。
  4. 在显微镜下确认细胞是否已解离，随后向培养皿中加入 10 mL 完全培养基（DMEM 添加 10% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素-链霉素；参见材料表）以终止胰蛋白酶/EDTA 的作用。将细胞收集至 50 mL 离心管中，并使用 Malassez 血球计数板或自动细胞计数器在显微镜下进行细胞计数。
  5. 用完全培养基制备至少 25 mL 浓度为 37,500 个细胞/mL 的 HeLa 细胞悬液（即每 40 µL 含 1,500 个细胞），以满足整块 384 孔板的上样和每孔 40 µL 的分配需求。
  6. 进行细胞分配时，将制备好的细胞悬液加入一个新的无菌容器中，并持续搅拌以防止细胞沉降，从而避免分配时细胞密度不均。将管路整理器插入该溶液中，按下预润按钮，直到细胞悬液开始从分配头流出。通过肉眼观察各喷嘴的液体流动情况，确保无任何喷嘴堵塞，并确认每根管路均已充满细胞悬液。
  7. 将含有 DNA 和 TR 的 384 孔目标板放置于蠕动泵液体处理仪的板架上，并取下盖子。运行预校准程序，向整块 384 孔板每孔分配 40 µL 细胞悬液（即每孔 1,500 个细胞）。分配时间约为 8 秒。分配完成后盖上 384 孔板盖。
    注意：也可使用多通道移液器手动分配 40 µL 细胞悬液。

9. 定制化生物学实验（细胞转染效率监测）

注意：根据实验设置和实验目的，采用所需的发光、荧光、高内涵筛选以及逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）方法。在本实验方案部分，通过自动荧光显微镜和图像分析来评估细胞转染效率。

  1. 将培养板置于37 °C、5% CO2、水饱和气氛条件下孵育，直至蛋白充分表达。
    注意：此处采用48小时孵育时间，以HeLa细胞监测转染效率，并使用表达tdTomato和mVenus的质粒。
  2. 转染后48小时，通过倒置培养板去除培养基，使用蠕动泵液体处理仪（10 µL卡盒）向每孔加入30 µL 10%福尔马林，在室温下孵育15分钟。
  3. 通过倒置培养板去除福尔马林；随后，将细胞在室温下用0.1 ng/mL Hoechst溶于1×PBS缓冲液中孵育15分钟。
  4. 用pH调至8.0的1×PBS缓冲液清洗细胞3次，每次15分钟，每孔80 µL，以恢复因福尔马林溶液孵育步骤中pH 6.9导致的荧光信号损失。
  5. 使用自动荧光显微镜，依次以10倍物镜和相应的发射滤光片组（分别为4′,6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]、dsRed和异硫氰酸荧光素[FITC]）采集两个或三个荧光通道（Hoechst、tdTomato和mVenus）的图像。
  6. 为评估转染效率，使用图像分析软件，基于细胞核染色的脚本分析方法确定转染效率。

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结果

为了确定ADE技术是否可用于自动化反向转染方案，我们使用表达红色荧光蛋白tdTomato的质粒，通过荧光显微镜监测细胞转染效率。首先旨在确定最佳转染参数，我们交叉测试了不同的稀释液体积和总DNA用量。使用稀释液体积的目的是使点加后的DNA液滴能够在孔内充分铺展，从而避免初步实验中观察到的转染不均一现象（即仅在孔中心区域发生转染）。如图6A所示，使用脂质多聚复合物试剂20对HeLa细胞进行转染是成功的。有趣的是，当使用1 µL稀释液体积时，5至30 ng范围内的DNA用量表现出相同的转染效率，细胞转染率高达90%；而当DNA用量更高（如50 ng和100 ng）时，则观察到转染效率急剧下降。我们尝试了从15 nL到4 µL的不同稀释液体积，结果表明1 µL为最佳条件，此处以30 ng DNA的实验结果为例，显著地证明了这一点。

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讨论

建立和优化针对特定细胞系的准确高通量转染方法需要科研人员遵循本节所述的一些关键参数。我们强烈建议在整个实验方案中首先采用推荐值，因为这些针对HeLa细胞优化的条件也被证实对HEK细胞具有高效性。然而，由于最佳参数可能因细胞系和转染试剂的不同而异，因此可通过以下方式确定最优条件： 通过改变细胞数量、稀释液体积、总DNA量以及转染试剂的种类、浓度甚至使用体积，对本方案在HeLa细胞中的优化过程进行了调整1.

本文介绍的整体实验方案经过开发和进一步优化，即使在该领域缺乏经验的新手也能顺利完成细胞转染。为实现这一目标，我们开发了若干关键工具，以尽可能简化操作流程并避免人为错误：一个用户友好的电子表格宏，用于便捷地设计实验；以及一款平板应用程序，可引导用户正确地填充源板（或多块源板）。

因此，为确保该方案的可靠性，只需控制以下几个关键步骤：i）合理的实验设计；ii）使用传统的蠕动泵液体处理仪进行准确的蠕动泵分配；iii）基于声波的DNA和转染试剂的精确分配；iv）在转染试剂分配前...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者披露了以下机构对本研究、文章撰写和/或发表提供的财务支持：法国国家健康与医学研究院（Inserm）、里尔大学（Lille University）、里尔巴斯德研究所（Lille Pasteur Institute）、北部大区议会（Conseil Régional du Nord）、药物跨学科研究平台（PRIM-HCV1 和 2, Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament）、法国国家科研署（Agence Nationale de la Recherche, ANR-10-EQPX-04-01）、欧洲区域发展基金（Feder, 12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed）以及欧洲共同体（ERC-STG INTRACELLTB n° 260901）。作者谨向 S. Moureu 博士、B. Villemagne 博士、R. Ferru-Clément 博士和 H. Groult 博士致谢，感谢他们对稿件提出的审阅意见与修改建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
384LDV 微孔板LabcyteLP-0200
384 孔微孔板 μClear 黑色Greiner781906
氨苄青霉素SigmaA9393-5G用于转化含氨苄青霉素表达载体的细菌的筛选抗生素
安卓平板电脑SamsungGalaxy Note 8在手动分配源板时用于引导用户操作
Aniospray Surf 29Anios2421073用于清洁 MicroFlo 加样头的消毒剂
Columbus 软件Perkin Elmer图像分析软件
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，含 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific10566032细胞培养基
Echo Cherry Pick 1.5.3 软件Labcyte通过 *.csv 文件驱动 Echo550 设备实现基于声波移液（ADE）的分配；纳米加样器软件
Echo550Labcyte基于声波移液（ADE）的加样设备
胎牛血清Thermo Fisher Scientific16000044添加至细胞培养基中
中性缓冲福尔马林溶液，10%Sigma-AldrichHT501128-4L用于固定细胞
HeLa 细胞ATCCHeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物Thermo Fisher ScientificH3570水溶液，10 mg/mL
INCell 分析仪 6000GE Healthcare29043323自动化激光共聚焦成像平台
LB 培养基Thermoischer Scientific
LB 肉汤基础（Lennox L 肉汤基础）®，粉末		12780052用于细菌生长的培养基
裂解缓冲液（A2） Macherey-Nagel740912.1来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒
MicroFlo 10µL 加样卡Biotek Instruments Inc7170013与 Microflo 分液器配合使用
MicroFlo 1μL 加样卡Biotek Instruments Inc7170012与 Microflo 分液器配合使用
MicroFlo 分液器Biotek Instruments Inc7171000基于蠕动泵的液体处理设备
微量分光光度计DenovixDS-11 分光光度计用于测定样品的 DNA 浓度
mVenus 质粒mVenus cDNA 通过酶切（Age1/BsrG1 位点）和连接克隆至 tdTomato-N1 质粒中载体类型：哺乳动物表达载体，融合蛋白：mVenus
中和缓冲液（A3） Macherey-Nagel740913.1来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒
NucleoSpin 质粒提取试剂盒Macherey-Nagel740588.50用于从细菌培养物中制备质粒
优化型改良伊格尔培养基（Opti-MEM）Thermo Fisher Scientific31985070
可选洗涤缓冲液 洗涤缓冲液（A4）Macherey-Nagel740914.1来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒
轨道摇床 大容量恒温摇床444-7084用于在温和振荡及 37°C 条件下培养细菌
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific1514012210,000 U/mL
磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific10010001
质粒小提柱Macherey-Nagel740499.250硅胶膜小提柱，用于从细菌培养物中制备质粒
重悬缓冲液（A1） Macherey-Nagel740911.1来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒
RNase AMacherey-Nagel740505来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒的酶，用于从细菌培养物中制备质粒
tdTomato-N1 质粒Addgene质粒 #54642载体类型：哺乳动物表达载体，融合蛋白：tdTomato 
TransIT-X2 动态递送系统Mirus BioMIR 6000
洗涤缓冲液（AW）Macherey-Nagel740916.1来自 NucleoSpin 质粒提取试剂盒，用于从细菌培养物中制备质粒
3D 打印机CrealityCR10S用于打印微孔板适配器
Blender 软件  https://www.blender.org/
在 GNU 通用公共许可证（GPL）下的免费软件。		版本 2.79b用于设计微孔板适配器

参考文献

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