方法文章

使用声学纳米分配技术实现高通量DNA质粒多路复用和转染

DOI：

10.3791/59570

⸱

2019年8月8日

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议使用声滴喷射技术描述了384孔板中哺乳动物细胞的高通量质粒转染。耗时、易出错的 DNA 点胶和复用,以及转染试剂点胶,由软件驱动,由纳米点胶设备执行。然后,这些细胞被播种在这些预填充的井中。

摘要

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细胞转染是许多生物学研究不可或缺的,需要控制许多参数,以实现准确和成功。通常在低吞吐量下执行,而且既耗时又容易出错,在多路复用多个质粒时更是如此。我们开发了一种简单、快速、准确的方法,利用声滴喷射 (ADE) 技术在 384 孔板布局中执行细胞转染。本研究中使用的纳米分配器装置基于该技术,允许从源井板高速向目标井板精确输送纳米体积。它可以根据预先设计的电子表格分配和复用DNA和转染试剂。在这里,我们提出了一个基于ADE的高通量质粒转染的最佳方案,这使得在共转染实验中达到高达90%的效率和近100%的共转染成为可能。我们扩展了初始工作,提出了一个基于用户友好的基于电子表格的宏,能够管理多达四个质粒/孔从包含多达1,536个不同的质粒的库,以及一个基于平板电脑的移液指南应用程序。宏设计了源板的必要模板,并为纳米分配器和基于平板电脑的应用生成即用型文件。四步转染协议涉及 i) 使用经典液体处理机的稀释剂,ii) 质粒分布和多路复用,iii) 纳米分配器的转染试剂点,以及 iv) 预填充孔上的细胞电镀。所述基于软件的ADE质粒多路复用和转染控制,即使是该领域的非专家也能快速、安全地执行可靠的细胞转染。此方法能够快速识别给定单元类型的最佳设置,并可转用到更大规模和手动的方法。该协议简化了非池化筛选策略中的人类ORFeome蛋白(基因组中开放阅读框架[ORF])表达或基于CRISPR-Cas9的基因功能验证等应用。

引言

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这里介绍的方法详细介绍了如何在384孔板中使用声基液体纳米分配器在高通量的哺乳动物细胞中执行DNA质粒多路复用和转染,即使是对于该领域的非专家也是如此。最近公布的方法1允许在一个实验中执行多达384个独立的质粒DNA复用和转染条件,在不到1小时。转染细胞群中的共转染。此协议使转染更容易,因为大多数繁琐、耗时且容易出错的步骤现在都是软件驱动的(有关概述,请参阅图1)。已作出进一步努力,开发专用工具,以提高易用性,同时避免整个过程中的人为错误,并促进成功的转染,即使是外地的非专家。所述协议包括一个"用户友好"的宏电子表格,我们开发了该电子表格,以便管理 384 个独立的转染条件,每个孔中最多具有四个质粒的多路复用可能性。宏自动生成源板的模板,以从起始库存解决方案加载预期的 DNA 质粒体积,并在已输入的实验设计后启动纳米分配器软件所需的文件。由于在384孔源盘中手动分配DNA是繁琐且容易出错的,我们还开发了一个基于平板电脑的专用应用程序,在根据模板分配DNA溶液的同时指导用户。

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方案

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1. 提前准备

  1. 准备蠕动液体处理程序
    注:对于协议的稀释剂和单元分配步骤,必须准备专用程序,同时考虑到使用板的点胶头高度和步骤意图。
    1. 对于 1 μL 稀释剂点胶步骤,安装 1 μL 盒式磁带,并准备步骤 1.1.1.1 和 1.1.1.2 中所述的设置程序。
      1. 将流速参数调整为"高",以获得最佳吞吐量,因为此步骤中预计不会造成生物材料损坏。将分配高度调整到 9.6 mm(根据所使用的细胞培养板,补充图1),以便在分配期间使 1 μL 跌落接触井底。
        注: 此步骤对于避免在分配头上保留液滴,直到达到足够的体积才能下降至关重要。
      2. 将板的透明高度调整到 14.4 mm,以便在每行分配后,分配头在板上自由位移。目视控制蠕动液体处理程序头高度的正确设置:在点胶时确保点胶头上不留任何掉落液滴,并验证头部是否足够高,以便在分配每行后能够位移头部。
        注意:避免跌落保留是一个关键参数,因为它会影响豁免体积的准确性。
    2. 要分配 40 μL 电池悬架,请安装 10 μL 盒式磁带,并准备步骤 1.1.2.1-1.1.2.2 中所述的设置程序。
      1. 将流速参数调整为"低",以以低速分配细胞,以避免剪切应力和对井底的高冲击对细胞造成潜在损害。将分配高度调整到 11.43 m....

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结果

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f 为了确定ADE技术是否可用于自动反向转染协议,我们使用红色荧光tdTomato表达质粒,通过荧光显微镜监测细胞转染效率。首先,为了确定最佳转染参数,对不同的稀释量和总DNA进行了交叉测试。稀释体积用于允许DNA液滴,一旦分配,蔓延到整个井,以规避在初步实验中观察到的不均匀转染(即,仅在井的中心)。如图6A所示,使用脂聚聚物试剂20转染HeLa细胞是成功的。有趣的是,通过使用1μL稀释量,从5到30 ng的DNA量表现出相同的效率和高达90%的细胞转染,而较高的量,如50和100纳克,观察到突然减少。我们尝试了从15 nL到4 μL的各种稀释量,并确定1μL是最好的条件,这里使用30 ng的DNA显著例证。

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讨论

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为给定细胞系建立和优化精确的高通量转染方法需要科学家遵循本节中描述的一些关键参数。我们强烈鼓励从整个协议中的建议值开始,因为这些针对 HeLa 细胞优化的设置也证明对 HEK 细胞有效。然而,由于最佳参数可能取决于细胞系和转染试剂,因此可以通过改变细胞数量、稀释体积、总DNA量和转染试剂的性质、浓度,甚至体积来定义最佳条件。在HeLa细胞1优化该协议期间。

这里介绍的整体协议已经开发并进一步优化,允许细胞转染,甚至由新手在现场。为了实现这一目标,开发了使协议尽可能简单和避免人为错误的关键工具:一个用户友好的电子表格宏,用于轻松设计实验和平板电脑应用程序,以指导用户正确填充源板。

因此,为了确保协议的可靠性,只需控制几个关键步骤:(i) 适当的实验设计;(二) 适当的实验设计;ii) 从经典蠕动液体处理器的适当蠕动分配;iii) 适当的DNA和转染试剂基于声学的配药;iv) 避免在转染试剂分配之前使源板离心,因为这似乎会损害转染。遵循这几个建议将确保细胞的有效转染。

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者披露了对本文的研究、作者和/或出版物的下列财政支持:因塞姆、里尔大学、里尔巴斯德研究所、北方理事会以及PRIM-HCV1和2(Recherche)(联邦国际医药协会、国家重建局(ANR-10-EQPX-04-01)、Feder(12001407(D-AL)和欧洲共同体(ERC-STG INTRACELLTB n=260901)。作者要感谢S.Mouru博士、B.Villemagne博士、R.Ferru-Clément博士和H.Groult博士对手稿的批判性回顾和更正。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
384LDV 微孔板LabcyteLP-0200
384 孔微孔板 μ透明黑色Greiner781906
氨苍西林SigmaA9393-5G用氨蚜素表达载体转化的细菌的选择抗生素
三星Galaxy Note 8用于指导用户，而源板手动分配
Aniospray Surf 29Anios2421073消毒剂清洁 MicroFlo 头
Columbus软件Perkin Elmer图像分析软件
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）、高葡萄糖、GlutaMAX 补充剂、丙酮酸Thermo Fisher Scientific10566032细胞培养基
Echo Cherry Pick 1.5.3 软件Labcyte软件，可通过 Echo550 设备从 *.csv 文件中进行基于 ADE 的分液;纳米分液器软件
Echo550Labcyte基于 ADE 的分配器
胎牛血清Thermo Fisher Scientific16000044添加到细胞培养基
福尔马林溶液中，中性缓冲，10%Sigma-AldrichHT501128-4L以固定细胞
HeLa 细胞ATCCHeLa （ATCC®CCL-2™）
Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合Thermo Fisher ScientificH357010 mg/mL 水溶液
INCell 分析仪 6000GE Healthcare29043323基于激光的自动化共聚焦成像平台
LB 培养基Thermoischer Scientific
LB 肉汤基础（Lennox L 肉汤基础）®，用于		细菌生长
的粉末12780052培养基裂解缓冲液 （A2） 来自 NucleoSpin 质粒试剂盒的Macherey-Nagel740912.1
MicroFlo 10µ 制备质粒;L盒BiotekInstruments Inc7170013与Microflo分配器MicroFlo
1&mu一起使用;L 盒Biotek Instruments Inc7170012与 Microflo 分液器配合使用
MicroFlo 分液器Biotek Instruments Inc7171000基于蠕动泵的液体处理装置
超微量分光光度计DenovixDS-11 分光光度计测量样品的 DNA 浓度
mVenus 质粒通过酶限制性消化和连接在 tdTomato-N1 质粒的 Age1/BsrG1 位点克隆 mVenus cDNA载体类型：哺乳动物表达，融合蛋白：mVenus
Macherey-Nagel740913.1来自 NucleoSpin 质粒试剂盒的缓冲液，用于从细菌培养物中制备质
Macherey-Nagel740588.50用于从细菌培养物中制备质
最佳修饰的 Eagle 培养基 （Opti-MEM） 培养基Thermo Fisher Scientific
可选洗涤缓冲液洗涤缓冲液 （A4）Macherey-Nagel740914.1来自 NucleoSpin 质粒试剂盒的缓冲液，用于从细菌培养
轨道摇床制备质粒 孵育式大容量摇床444-7084用于在温和搅拌和 37>C
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific1514012210,000 U/mL
磷酸盐缓冲盐水Thermo Fisher Scientific10010001
质粒微型柱Macherey-Nagel740499.250硅胶膜微型柱，用于从细菌培养物制备质
重悬缓冲液 （A1） 来自 NucleoSpin 质粒试剂盒的Macherey-Nagel740911.1
RNAse A来自 NucleoSpin 质粒试剂盒的 Macherey-Nagel 740505酶，用于从细菌培养物制备质
粒 tdTomato-N1 质粒Addgene质粒 #54642载体类型：哺乳动物表达，融合蛋白：tdTomato 
TransIT-X2 动态递送系统Mirus BioMIR 6000
洗涤缓冲液 （AW）Macherey-Nagel740916.1来自 NucleoSpin 质粒试剂盒的缓冲液，用于从细菌培养物
3D 打印机CrealityCR10S用于打印板适配器
Blender 软件  https://www.blender.org/
GNU 通用公共许可证 （GPL） 下的自由软件。		2.79b 版用于设计印版适配器
物 缓冲液，用于从细菌培养物中和缓冲液 （A3） 粒 粒 31985070 粒 缓冲液，用于从细菌培养物制备质粒

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific.

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标签

ADE 384

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