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天然脂蛋白颗粒中microRNA的富集及其绝对/相对microRNA含量与细胞间转移速率的测定

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DOI：

10.3791/59573

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2019年5月9日

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1Center for Pathobiochemistry and Genetics, Institute of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University Vienna, 2School of Medical Engineering and Applied Social Sciences, University of Applied Sciences Upper Austria

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于定量实时聚合酶链式反应的方法，用于测定脂蛋白颗粒中内源性微小RNA的含量（绝对/相对含量）。此外，还展示了提高微小RNA水平的方法，以及测定细胞对脂蛋白颗粒摄取速率的方法。

摘要

脂蛋白颗粒主要在血液中运输脂质和胆固醇。此外，它们还含有少量非编码微小RNA（miRNA）。通常情况下，miRNA通过与信使RNA（mRNA）相互作用来改变蛋白质的表达谱。因此，了解脂蛋白颗粒中miRNA的相对含量和绝对含量，对于评估细胞摄取颗粒后的生物学效应至关重要。本文介绍了一种基于定量实时聚合酶链式反应（qPCR）的实验方案，用于测定脂蛋白颗粒中miRNA的绝对含量——以天然状态及miRNA富集的脂蛋白颗粒为例进行说明。相对miRNA含量则通过多孔微流控阵列芯片进行定量。此外，该方案还可使科研人员估算细胞内的miRNA水平，从而推断脂蛋白颗粒的摄取速率。当使用人工加载miRNA的高密度脂蛋白（HDL）颗粒时，可观察到细胞内miRNA水平显著升高；而由于天然HDL颗粒的miRNA含量较低，其与细胞共孵育后并未引起显著变化。相比之下，无论低密度脂蛋白（LDL）颗粒本身是否含有天然miRNA或经人工加载miRNA，其细胞摄取过程均未改变细胞内miRNA水平。

引言

脂蛋白颗粒由单层两亲性脂质和胆固醇组成，包裹着胆固醇酯和甘油三酯脂肪的核心。整个颗粒由嵌入膜中的载脂蛋白稳定，这些载脂蛋白决定了颗粒的生物学功能。根据其密度依次增加、相应粒径逐渐减小的特性，可将脂蛋白颗粒区分为极低密度脂蛋白（VLDL）、中等密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）颗粒。尽管脂蛋白的主要功能是在血液中运输水不溶性成分，但已有研究表明，HDL颗粒能够携带非编码的miRNA1,2。微小RNA（micro-RNA，miRNA）是一类短链RNA（通常约二十多个核苷酸），可在细胞内降解互补的mRNA链，从而改变特定蛋白质的表达谱3,4,5,6。此外，在多种疾病中已发现miRNA表达谱的改变，因此其表达谱可作为疾病诊断与预后的生物标志物。通过脂蛋白颗粒在细胞间进行miRNA的胞外运输，可能构成细胞间mRNA水平调控的另一种机制。为了定量评估其生物学效应，需要了解脂蛋白颗粒中miRNA的绝对含量与相对含量。

定量实时PCR是一种适合且相对快速获取该信息的方法。因此，可计算出相对定量（RQ）值，并可估算不同样本及脂蛋白组分之间的相对差异。多孔微流控阵列芯片是一种快速且易于使用的方法，用于测定样本中miRNA的相对存在量（相当于RQ值）。多孔微流控阵列芯片包含96或384个独立反应腔室，这些腔室集成于微流控装置中，用于分别进行qPCR反应。每个腔室均含有针对单个miRNA所需的水解探针和特异性qPCR引物。其优点包括由于标准化带来的较短操作时间、简单的操作流程以及减少的移液步骤。此外，所需样本体积也被最小化。与相对定量不同，绝对miRNA含量的测定需要将qPCR样本结果与已知绝对数量miRNA链的标准曲线进行比较。需要注意的是，由于其miRNA含量相对较低，常规甚至单分子敏感成像技术均不可行——为研究细胞与脂蛋白颗粒的相互作用及miRNA转移，必须对脂蛋白颗粒进行人工miRNA富集。在此方面，对HDL颗粒进行去脂化处理，随后进行再脂化7，可实现miRNA链的掺入和富集。由于apoB-100蛋白具有强疏水性，而该蛋白是LDL颗粒的主要组成成分，因此类似地对LDL颗粒进行miRNA富集不可行。然而，通过添加能够穿透脂质膜的极性溶剂二甲基亚砜（DMSO），也可实现LDL颗粒的人工miRNA加载。

高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种强大的生物样品表征工具，具有亚纳米级的空间分辨率和亚秒级的时间分辨率8。因此，该技术非常适合用于修饰脂蛋白颗粒的质量控制，因为天然/重组/标记的脂蛋白颗粒可在接近生理的环境中进行成像。

本文逐步介绍了一种基于qPCR的实验方案，用于测定脂蛋白颗粒和细胞样品中miRNA的绝对/相对含量，从而可估算细胞对脂蛋白颗粒的摄取速率。此外，还展示了一种使miRNA在脂蛋白颗粒中富集的方法。该方法可适用于对脂蛋白内容物的一般性操控，因而证明了脂蛋白颗粒作为药物递送靶标的可行性。

方案

血液捐献已获得维也纳医科大学伦理委员会批准（EK-Nr. 511/2007，EK-Nr. 1414/2016）。命名法遵循《定量实时PCR实验发表的最低信息标准》（MIQE）9 指南。

1. 人血液中脂蛋白颗粒的分离

  1. 将超速离心机预冷至 4 °C。在健康志愿者禁食过夜后采集血液。
    注意：通常需要三位献血者，每人捐献 80 mL，并使用含乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂的采血管。
  2. 在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 20 分钟，收集血浆（上层相）；避免剪切力。测定总体积 V，必要时用磷酸盐缓冲液（PBS）调节至离心管体积的整数倍。测量 1 mL 的质量 3 次，计算平均密度 ρ。
  3. 使用以下公式10计算用于调节密度的溴化钾（KBr）所需量（对于以克/毫升为单位的目标密度，使用 A = 1.019；对于 KBr 的比容，使用 静力平衡，ΣFx=0 公式，教学图示，物理概念，平衡分析。= 0.364 mL/g）。将 KBr 加入血浆中，轻轻搅拌以避免剪切力，直至 KBr 完全溶解。
    密度测定公式；展示数学关系的方程；教学工具。
  4. 按照步骤 1.2 所述方法测定密度，必要时通过添加更多 KBr 进行再次调节。将适合超速离心的离心管装满血浆并密封。避免任何气泡，否则管子可能会塌陷。根据制造商说明将离心管放入转子中，并在 4 °C 下以 214,000 × g 离心 20 小时。
  5. 根据制造商说明打开离心管，弃去含有极低密度脂蛋白（VLDL）和中间密度脂蛋白（IDL）的上层相。测定总体积 V，必要时用 PBS 调节至离心管体积的整数倍。
  6. 测定底部组分的密度 ρ。计算用于调节密度所需的 KBr 量（使用 A = 1.063）。轻轻搅拌以避免剪切力，直至 KBr 完全溶解。重复步骤 1.4。
  7. 移除并收集含有低密度脂蛋白（LDL）颗粒的上层相。将 LDL 颗粒溶液在惰性气体氛围下于 4 °C 保存。测定总体积 V，必要时用 PBS 调节至离心管体积的整数倍。按照步骤 1.2 所述方法测定底部组分的密度 ρ。
  8. 计算用于调节密度所需的 KBr 量（使用 A = 1.220），并加入其中。轻轻搅拌以避免剪切力，直至 KBr 完全溶解。重复步骤 1.4。
  9. 移除并收集含有高密度脂蛋白（HDL）颗粒的上层相。测定其总体积 V，必要时用 PBS 调节至离心管体积的整数倍。测定密度 ρ。建议对上层相在 4 °C 下以 214,000 × g 再次离心 20 小时，以去除白蛋白。如有需要，重复步骤 1.8。移除并收集含有 HDL 颗粒的上层相。
  10. 准备至少 20 L 透析缓冲液（0.9% NaCl，0.1% EDTA [pH 7.4]），并预冷至 4 °C。预润湿透析袋（截留分子量：12–14 kDa），并根据制造商说明加入 LDL 和 HDL 颗粒溶液。在 4 °C 下用 5 L 透析缓冲液进行透析，并在 1、2 和 4 小时后更换缓冲液。
  11. 24 小时后，从透析袋中回收脂蛋白颗粒溶液，并使用 Bradford 法11或其他适当方法测定蛋白浓度。将 HDL 和 LDL 颗粒溶液在惰性气体氛围下于 4 °C 保存。

2. 合成 miRNA 分装

注意：操作RNA寡核苷酸时，须在无RNase的环境中进行。仅使用新鲜的一次性塑料耗材，并始终佩戴手套，且应频繁更换手套。仅使用无核酸酶的溶液。操作时应始终置于冰上进行。

  1. 将生产商提供的管状样品在最大离心力下离心，使冻干的合成miRNA沉淀成团。加入适量的10 mM 三(羟甲基)氨基甲烷（TRIS）缓冲液（pH 7.5），使miRNA的终浓度为10 µM（储存浓度）。
  2. 轻柔吹打混匀数次以重悬。将溶液分装至无菌管中，每管100 µL。若不立即使用，请于-20 °C保存。避免反复冻融。

3. 高密度脂蛋白颗粒的重建

  1. 去脂化
    1. 配制缓冲液 A（150 mM NaCl，0.01% EDTA，10 mM Tris/HCl [pH 8.0]）。将离心机预冷至 -10 °C。将 100 mL 乙醇：乙醚（3:2）混合液在 -20 °C 预冷。
      注意：乙醚极易燃且对皮肤有害，操作时需佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中进行。
    2. 将相当于 5 mg HDL 颗粒的体积与 50 mL 预冷的乙醇：乙醚（3:2）混合液混合，在 -20 °C 下孵育 2 小时。在 -10 °C 下以 2,500 × g 离心 10 分钟。
    3. 弃去上清液，通过涡旋将沉淀物重悬于 50 mL 预冷的乙醇：乙醚混合液中，再次在 -20 °C 下孵育 2 小时。再次在 -10 °C 下以 2,500 × g 离心 10 分钟。
      注意：如需分析 HDL 颗粒脂质组分中的 miRNA 含量，可将上清液冻干保存。
    4. 在 N2 气流下干燥沉淀物，并将其重悬于 250 µL 缓冲液 A 中（见步骤 3.1.1）。使用 Bradford 蛋白测定法或其他适当方法测定蛋白浓度，并稀释至最终浓度为 1 mg 蛋白/250 µL 缓冲液 A。
      注意：本步骤可暂停。将溶液在 4 °C 下、惰性气体氛围中保存过夜。
  2. 再构建
    1. 使用氯仿：甲醇（2:1）混合液配制磷脂酰胆碱（PC）储备液，浓度为 5.6 mg PC/mL。同样地，配制胆固醇油酸酯（5 mg CO/mL）和胆固醇（5 mg C/mL）的储备液。将所有溶液在 -20 °C 下保存。
    2. 在洁净的玻璃试管中，加入 500 µL PC、100 µL CO 和 13.5 µL C。这些体积对应于大约 100 PC : 22 CO : 4.8 C 的摩尔比。在旋转试管的同时，用 N2 气流吹干，形成均匀的表面层。
      注意：本步骤可暂停。将玻璃小瓶（如需要，可批量储存）在惰性气体氛围中于 -20 °C 保存。
    3. 在缓冲液 A 中新鲜配制 30 mM 的精胺溶液。取一份合成 miRNA（见步骤 2.2）的等分试样（100 µL，10 µM）与 100 µL 精胺溶液混合，在 30 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：在阴性对照实验中，用等体积的缓冲液 A 替代 miRNA 和/或精胺溶液。
    4. 将一份 PC/CO/C 混合母液溶解于步骤 3.2.3 所得混合液中。
    5. 在缓冲液 A 中配制 30 mg/mL 的脱氧胆酸钠溶液，并向步骤 3.2.4 的溶液中加入 50 µL。在 4 °C 下搅拌 2 小时。
    6. 加入 250 µL 步骤 3.1.4 所得的去脂化 HDL 溶液。该体积对应于大约 100 PC : 22 CO : 4.8 C : 1 去脂化 HDL 蛋白的摩尔比。在 4 °C 下搅拌过夜。
  3. 透析
    1. 将至少 15 L 的 PBS 在 4 °C 下预冷。将 50 g 吸附珠加入 800 mL 双蒸水（ddH2O）中，搅拌 1 分钟。静置 15 分钟，倾去上清液，并用 PBS 重复该操作一次。
    2. 将透析夹（分子量截断值：20 kDa）或合适的透析管预先润湿，并根据制造商说明，使用注射器将步骤 3.2.6 的溶液加入其中。
    3. 将步骤 3.3.1 所得的吸附珠加入 3 L PBS 中，在 4 °C 下进行透析。1 小时和 2 小时后更换缓冲液和吸附珠。
    4. 24 小时后，回收再构建的 HDL（rHDL）颗粒溶液，并使用 Bradford 法测定蛋白浓度。将 rHDL 颗粒溶液在 4 °C 下、惰性气体氛围中保存。

4. LDL 颗粒的标记

  1. 配制10倍浓度的LDL缓冲液（1.5 M NaCl，3 mM EDTA，1 mM 乙二醇双(β-氨基乙基醚)四乙酸 [EGTA, pH 7.4]），并在室温下保存。
  2. 在无RNase的水中新鲜配制30 mM亚精胺溶液。取合成miRNA的等分试样（100 µL, 10 µM）（见步骤2.2）与100 µL亚精胺溶液混合，并在30 °C下孵育30分钟。
    注意：在阴性对照实验中，用等体积的1倍浓度LDL缓冲液替代miRNA和/或亚精胺溶液。
  3. 向步骤4.2中的miRNA/亚精胺溶液中加入100 µL DMSO，并用1.2 mL 1倍浓度LDL缓冲液进一步稀释。
  4. 用PBS将LDL颗粒溶液稀释至终浓度约为4 mg/mL，取450 µL与50 µL 10倍浓度LDL缓冲液混合。在冰上孵育10分钟。
  5. 将上一步所得的LDL颗粒溶液与步骤4.3中的miRNA/亚精胺/DMSO溶液混合，在40 °C下孵育2小时。
  6. 进行透析，方法类似于第3.3节所述，并相应地保存标记的LDL颗粒溶液。

5. 重组/标记脂蛋白颗粒的质量控制

注意：对于质量控制，可使用原子力显微镜（AFM）或电子显微镜（EM）来测定脂蛋白颗粒的直径和总体形状。此处采用高速原子力显微镜（HS-AFM）来测量天然/重组/标记脂蛋白颗粒的尺寸分布。

  1. 将HDL/LDL颗粒溶液用PBS稀释（1:100–1:1,000），并在新剥离的云母片上孵育5分钟。用于剥离云母12将粘性胶带按压在基底上，然后通过撕下胶带去除上层的云母片。
    注意：根据所使用的特定原子力显微镜仪器、观察区域以及颗粒的初始浓度，需调整稀释倍数以观察单个颗粒。
  2. 孵育后，用 PBS 缓冲液冲洗样品，并在 PBS 缓冲液中以轻敲模式进行 HS-AFM 成像，所用悬臂的弹簧常数为 k不能 < 0.2 N/m。建议使用扫描尺寸 <1 µm2 并尽可能降低成像作用力。
  3. 使用合适的软件确定成像颗粒相对于云母表面的高度。
    1. 将数据导入 Gwyddion（免费软件），通过颗粒分析检测颗粒通过阈值标记颗粒）并将阈值设定在基底背景之上。展平图像（去除多项式背景) 选择 排除遮罩区域 选项
    2. 导出所检测颗粒的高度值（不同谷物特征的分布）并对所有记录的图像重复这些步骤。通过生成所得颗粒高度的直方图或计算其概率密度函数来进行统计分析。
  4. 重复步骤5.1–5.3，对天然及重组/标记的脂蛋白颗粒进行相同操作，并比较所得结果以验证颗粒质量。若观察到碎片和/或聚集体，应弃用该样品。

6. 细胞培养

  1. 根据既定方案培养贴壁细胞（例如 ldlA7-SRBI13），直至细胞达到汇合状态。
    注意：需要多个独立的培养腔室，具体数量取决于实验次数（建议每种实验条件设置两个腔室）以及阴性对照实验（建议设置两个不添加脂蛋白颗粒的腔室）。此外，还需两个腔室用于测定细胞数量。
  2. 用预热的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）轻柔清洗细胞 3 次，以去除细胞碎片，并加入适量无血清培养基覆盖细胞层。加入适量脂蛋白颗粒溶液，使脂蛋白颗粒的终浓度为 50 µg/mL。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 16 小时。
    注意：根据实验设计和细胞系的不同，需调整孵育时间，以确保细胞内 miRNA 水平有足够（即可检测）的升高。
  3. 用预热（37 °C）的 HBSS 轻柔清洗细胞 3 次，以去除细胞碎片和脂蛋白颗粒，并加入适量无血清培养基覆盖细胞层。
  4. 采用适当方法（例如血细胞计数板、自动细胞计数仪）在至少两个独立腔室中测定细胞密度，用于计算步骤 6.3 样品体积中的细胞数量。该数值将用于归一化处理。

7. 从细胞和脂蛋白颗粒样本中提取miRNA

注意：使用 miRNA 提取试剂盒从细胞中提取 miRNA，但需进行以下修改。

  1. 细胞样品
    1. 将离心机预冷至 4 °C。向两个含有细胞的腔室中各加入 350 µL 裂解试剂。作为阴性对照实验，使用不含细胞的腔室。
      注意：操作裂解试剂时需佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中操作，因为该试剂含有苯酚和硫氰酸盐。
    2. 等待 3–5 分钟（根据细胞系而定）以使细胞脱落。如有需要，可通过明场显微镜检查细胞是否已脱落。将两个腔室中的内容物合并至一个 1.5 mL 离心管中。
    3. 使用 20 号针头和 5 mL 注射器，通过反复抽吸 5–10 次对样品进行匀浆/破碎，并孵育 5 分钟。加入 140 µL 氯仿（CHCl3），剧烈震荡 15 秒，然后孵育 3 分钟。
    4. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。之后停止对离心机降温。
    5. 将上层水相转移至新的 1.5 mL 离心管中；避免相间混合/污染，因为中间层含有 DNA，下层有机相含有蛋白质。加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇，并用移液器充分混匀。
    6. 将离心柱放入 2 mL 收集管中，加入 7.1.5 步骤所得混合液 700 µL。在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。弃去穿流液，并用剩余样品体积重复此步骤。
    7. 弃去穿流液，在离心柱中加入 700 µL 第一洗涤缓冲液。在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。
    8. 弃去穿流液，在离心柱中加入 500 µL 第二洗涤缓冲液。在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。重复整个步骤一次，第二次离心时间为 2 分钟。
    9. 将离心柱转移至新的 2 mL 收集管中，在最大转速下离心 1 分钟以干燥膜。
    10. 将离心柱放入 1.5 mL 收集管中。在膜中央加入 30 µL 无 RNase 水用于洗脱，以 8,000 x g 离心 1 分钟。重复整个步骤一次，使用第一次的穿流液作为洗脱液。逆转录步骤应在提取后立即进行；否则，将提取的 miRNA 样品储存于 -20 °C。
  2. 脂蛋白颗粒
    1. 将蛋白浓度最低的样品体积设定为 100 µL（= 最大样品体积）。根据此归一化标准，按浓度反比计算其他样品的体积。对于阴性对照实验，使用 100 µL 无 RNase 水。
      注：归一化并非必需，但可简化 qPCR 步骤及分析过程中结果的直接比较。
    2. 将离心机预冷至 4 °C。向 7.2.1 步骤的样品体积中加入 700 µL 裂解试剂。
    3. 按照步骤 7.1.3–7.1.10 进行 miRNA 提取。

8. 逆转录

注意：miRNA 的反转录使用以下经过修改的反转录试剂盒进行。

  1. 将试剂盒试剂和反转录引物置于冰上解冻。在冰上的一支反应管中配制以下主混合液：45.7 µL 无 RNase 的 H2O、16.5 µL 10x 反转录缓冲液、11 µL 反转录酶、2.1 µL RNase 抑制剂和 1.7 µL dNTP 混合液。轻轻混匀，切勿涡旋混合。
    注意：配制体积根据样本数量而定；此处按 10 个反应计算。
  2. 相应标记 0.2 mL 离心管，将步骤 8.1 中的 7 µL 主混合液与步骤 7.1.10 提取的 5 µL 样本以及 3 µL 反转录引物混合。轻轻混匀，短暂离心后将混合物置于冰上保存。
  3. 为使每种细胞系使用相同的细胞数量，需减少细胞总数较高的细胞系的样本体积；使用该剩余体积补充至 5 µL 无 RNase 水的总体积。
    注意：脂蛋白颗粒样本已在步骤 7.2.1 中完成归一化处理。标准曲线制备时，将 miRNA 的等分试样在无 RNase 水中进行连续稀释，并计算每个样本体积中的链数。要求至少获得五个位于样本定量循环（cq）值范围内的数据点。通常，总稀释倍数在 102 至 106 之间较为合适。
  4. 将离心管放入热循环仪中并启动以下程序：16 °C 反应 30 分钟（退火阶段），42 °C 反应 30 分钟（反转录阶段），85 °C 反应 5 分钟（变性阶段），然后暂停于 4 °C（保存）。反转录完成后应立即进行 qPCR 检测；否则，应将由 miRNA 样本合成的互补 DNA（cDNA）在 -20 °C 保存。

9. qPCR

  1. 使用市售试剂盒（参见材料表）对cDNA（由miRNA逆转录获得）进行qPCR，具体操作如下所述进行修改。
  2. 将所有试剂（预混液、无RNase的H2O）、cDNA样品（来自步骤8.4）以及引物置于冰上解冻。在冰上于反应管中配制以下主混合液：75 µL 预混液、47.5 µL 无RNase的H2O、7.56 µL 引物。轻轻混匀，切勿涡旋震荡。
    注：配制量根据样品数量而定；此处按10个反应计算。
  3. 相应标记0.2 mL离心管，将2 µL cDNA样品加入含13 µL主混合液的管中，并轻轻混匀。通常情况下，每个样品需设置2个重复。
    注：还需至少设置两个阴性对照样品——以无RNase水作为样品。若标准曲线未与待测样品在同一轮反应中检测，则还需包含一条标准曲线中的一个样本，用于校准每一轮反应的一致扩增效率。
  4. 将离心管放入PCR仪中，并启动以下程序：50 °C孵育2分钟，95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环：95 °C变性15秒，60 °C退火延伸60秒。最后两个步骤重复最多50次。
  5. 使用PCR仪配套软件分析cq值时，启用动态管归一化（通过各样品扩增曲线的二阶导数校正不同背景信号水平）和噪声斜率校正（基于噪声水平进行归一化）。
    注：阴性对照的cq值应比最高样品的cq值高出数个循环。
    1. 进行标准曲线分析时，针对每种miRNA，利用软件包中的自动阈值查找功能，根据各自的标准曲线单独确定cq值计算所用的阈值，并对同一种miRNA保持该阈值恒定。
    2. 进行样品分析时，如有需要，可利用标准曲线样本的数据点对样品运行中的不同扩增效率进行校正。软件将根据相应标准曲线测定所设定的阈值水平，计算各样品的cq值。

10. miRNA 含量的计算

  1. 标准曲线
    1. 根据每份等分试样中miRNA链的初始数量计算（100 µL 的 10 µM miRNA，分子量来自数据表）以及后续的系列稀释步骤，样品体积中miRNA链的数量（ 5 µL 步骤8.3的样品体积
      注：假设逆转录效率为1，此数值等于cDNA链的数量。
    2. 计算步骤9.3中2 µL样品体积内的cDNA链数量。计算时需考虑7.5的额外稀释因子（步骤9.4中的2 µL样品来自步骤8.4的15 µL样品体积）。
    3. 绘制 cq 步骤9.5.1中得到的数值相对于链数 n链 在10.1.2步骤中计算，并在以10为底的半对数坐标图中对数据点拟合以下回归曲线（M 线性回归曲线的斜率， B = 偏移量)
      用于化学分析中基于链数浓度计算的方程，ca = -M×log(nstrands) + B。
      确认相关系数（R2) 用于该直线的是 >0.99.
  2. 脂蛋白颗粒
    1. 使用测得的样品 c 计算每单位样品体积中的 miRNA 链数q 值（步骤 9.5.2）及以下公式（M 和 B 是特定miRNA的校准曲线参数。
      用于计算链数的方程，包含科学研究中的变量 cq、B 和 M。
    2. 从步骤 7.2.1 中的体积开始，计算样品体积中相应的脂蛋白颗粒数量，100 µL），其已知浓度以及后续的稀释步骤（100 µL -> 30 µL 步骤 7.1.10 中的样品体积 -> 5 µL [稀释比例1:6] 样本在 15 µL 步骤 8.4 中的总体积> 2 µL [步骤9.4中稀释倍数为1:7.5]。假设HDL颗粒的分子量为250 kDa，LDL颗粒为3 MDa，且在miRNA提取步骤中miRNA回收率为100%（忽略脂质对分子量的贡献会导致每脂蛋白颗粒中miRNA链数的估算值略有偏高）。
    3. 将步骤10.2.1中获得的miRNA链数量除以上一步计算出的颗粒数，得到每个脂蛋白颗粒所含的miRNA链数。
  3. 细胞
    1. 根据步骤10.2.1计算每个样本体积中的miRNA分子数量。
    2. 根据步骤6.4中测得的初始细胞浓度，按照步骤10.2.2计算样品体积中相应的细胞数量。
    3. 将10.3.1步骤中获得的miRNA链数量除以上一步计算得到的细胞数量，得到每个细胞中的miRNA链数。
    4. 通过将上一步经阴性对照实验校正细胞本底miRNA水平后的总miRNA链数量，除以miRNA/颗粒比率（步骤10.2.3）和孵育时间（16 h，参见步骤6.2），计算脂蛋白颗粒的摄取速率。

11. 多孔微流控阵列

  1. miRNA 提取
    1. 按照步骤 7 所述方法进行 miRNA 提取。
  2. 逆转录
    1. 将逆转录引物、逆转录试剂盒组分以及 MgCl2（25 mM）置于冰上解冻。对于八个样品，将以下组分混合：8 µL 逆转录引物（10x）、2.25 µL dNTPs（含 dTTP，100 mM）、16.88 µL 逆转录酶（50 U/µL）、9.00 µL 10x 逆转录缓冲液、10.12 µL MgCl2、1.12 µL RNase 抑制剂（20 U/µL）以及 1 µL 无核酸酶水。
    2. 轻柔混匀后短暂离心。将 4.3 µL 逆转录反应混合液加入含有 3.5 µL 提取 miRNA 的离心管中，混匀、离心并置于冰上孵育 5 分钟。将离心管放入热循环仪中，启动以下程序：16 °C 持续 2 分钟，42 °C 持续 1 分钟，50 °C 持续 1 秒，共重复 40 次；随后进行终止反应：85 °C 持续 5 分钟，然后保持在 4 °C 直至终止。
  3. 预扩增
    1. 将引物置于冰上解冻，轻轻翻转并短暂离心。通过轻轻旋转瓶身混匀预扩增主混合液（2x）。根据以下说明为八个样品配制预扩增反应混合液：112.5 µL 预扩增主混合液（2x）、22.5 µL 预扩增引物以及 67.5 µL 无核酸酶水。翻转并短暂离心。
    2. 将步骤 11.2.2 中得到的 2.5 µL 逆转录反应产物与上一步配制的 22.5 µL 预扩增反应混合液混合，翻转并短暂离心。将样品置于冰上孵育 5 分钟。
    3. 将离心管放入热循环仪中，按以下条件孵育：95 °C 酶活化 10 分钟，55 °C 退火 2 分钟，72 °C 延伸 2 分钟，随后重复 12 次：95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火/延伸 4 分钟，接着 99.9 °C 酶失活 10 分钟，最后保持在 4 °C。
    4. 短暂离心后，加入 7.5 µL 1x TE 缓冲液（pH 8.0）和 67.5 µL 无核酸酶水，翻转混匀并短暂离心。样品可在 -20 °C 保存最多 1 周。
  4. qPCR
    1. 通过轻轻旋转瓶身混匀主混合液。为一张芯片配制 PCR 反应混合液：450 µL 主混合液、441 µL 无核酸酶水以及 9 µL 来自步骤 11.3.4 的预扩增样品。翻转并短暂离心。
    2. 根据制造商说明书，将 100 µL 已配制的 PCR 反应混合液加入多孔微流控芯片的每个加样储液池中，并以 3,000 × g 离心 2 次，每次 1 分钟。连续两次离心过程中的加速度对于芯片的充分填充至关重要。按照制造商说明书密封芯片。
    3. 使用 PCR 系统运行以下程序：95 °C 酶活化 10 分钟，随后重复 40 次：95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火/延伸 1 分钟。
    4. 从 PCR 系统导入结果文件，并使用系统配套软件计算 RQ 值，分析参数设置如下：最大允许 cq 值为 40.0，计算中包含最大 cq 值，排除重复样本中的异常值。启用 Benjamini–Hochberg 错误发现率作为 p 值校正选项（用于校正假阳性出现率14），并选择全局归一化作为归一化方法（使用所有样品的中位阈值进行归一化15）。

结果

脂蛋白颗粒分离的通用方案
图1展示了从全血开始，通过逐步漂浮超速离心法分离脂蛋白颗粒的通用流程16。根据需要，可在本实验过程中收集其他脂蛋白颗粒组分，如极低密度脂蛋白（VLDL）和中密度脂蛋白（IDL）颗粒。固定角钛转子与聚丙烯快速密封管的组合可耐受离心过程中产生的作用力。为防止试管塌陷，必须避免试管中存在气泡。离心过程在4 °C下进行，以最大限度减少蛋白质降解。通常从三位志愿者混合捐献的血浆（每位供者60–80 mL）开始，预计可分别获得约3 mL的低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）颗粒溶液，浓度范围为1–3 mg/mL。整个流程从采血开始，耗时约7天。

采用不同转速和温度进行密度梯度离心的脂蛋白分离流程图。
图1： 脂蛋白分离流程图。 使用真空采血管采集健康志愿者的血液，离心后收集血浆（上层相）。加入溴化钾（KBr）调节血浆密度至 ρ = 1.019 g/mL，于 4 °C 条件下以 214,000 × g 离心 20 小时。取下层组分，再次用 KBr 调节其密度至 ρ = 1.063 g/mL，于 4 °C 条件下以 214,000 × g 再次离心 20 小时。将含有低密度脂蛋白（LDL）颗粒的上层组分暂时储存在 4 °C。取剩余下层组分，用 KBr 调节其密度至 ρ = 1.220 g/mL，于 4 °C 条件下以 214,000 × g 连续两次离心，每次 20 小时。收集含有高密度脂蛋白（HDL）颗粒的上层组分，对 HDL 和 LDL 颗粒溶液均进行透析，并在 1、2 和 4 小时后更换缓冲液。24 小时后测定蛋白浓度，并将样品在惰性气体保护下储存于 4 °C。请点击此处查看该图的放大版本。

高密度脂蛋白（HDL）颗粒的重建
高密度脂蛋白（HDL）颗粒的重建按照 Jonas 之前发表的方案进行7。第一步是 HDL 颗粒的去脂化，如图2A所示；第二步是再脂化（即重建）过程，如图2B所示，使用磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（CO）和胆固醇酯（C），并加入 microRNA（miRNA）与亚精胺的混合物。我们选择人成熟 miR-223 和 miR-155，因为 miR-223 在脂蛋白颗粒中含量较高，而 miR-155 则较为稀少17。通常，这两个步骤在连续两天内完成。在重建过程中，可根据需要加入其他脂溶性或两亲性成分。PC、CO 和 C 所用的乙醇/乙醚以及甲醇/氯仿溶剂必须完全蒸发，这是关键步骤。最后一步如图2C所示，为透析过程，以分离重建后的 HDL 颗粒（rHDL）与游离脂质/miRNA/去垢剂，此过程需额外 1–2 天。在透析液中加入吸附珠可维持透析膜两侧的密度梯度恒定。rHDL 颗粒的产率约为 50%。

HDL 制备示意图；显示去脂化、miRNA 相互作用、透析步骤；仅供研究使用。
图2： 高密度脂蛋白颗粒重建流程图 (A) 去脂化：将HDL颗粒溶液与预冷的乙醇/乙醚混合，并在 -20 °C 2小时。弃去上清液后，重悬沉淀并重复该步骤。用N₂干燥沉淀2 气体并重悬于缓冲液A中。测定浓度后，将去脂化HDL在惰性气体氛围下保存于 4 °C. (B) 重构：将磷脂酰胆碱（PC）、油酸胆固醇酯（CO）和胆固醇（C）混合后，使用氮气蒸发溶剂2 旋转试管的同时通入气体。将miRNA等分试样与亚精胺溶液在30分钟内孵育 30 °C，加入脱氧胆酸钠并重悬干燥的脂质膜。将样品搅拌2 h，于 4 °C，加入去脂质的HDL溶液，再次搅拌样品，此次在4°C下过夜搅拌 4 °C 在惰性气体氛围下。 (C透析：将溶液从图示面板转移 B 将含有重组高密度脂蛋白（rHDL）颗粒的溶液加入透析膜腔室（分子量截留值：20 kDa），用磷酸盐缓冲液（PBS）和吸附珠进行透析 4 °C. 在1小时和2小时后更换缓冲液和磁珠。24小时后收集重组高密度脂蛋白（rHDL）颗粒溶液，测定其浓度，并将样品在惰性气体氛围下保存于 4 °C. 请点击此处以查看此图的放大版本。

LDL 颗粒的标记
由于载脂蛋白 apoB-100 是 LDL 颗粒的主要组成成分，具有疏水性，因此如 HDL 颗粒所示的 miRNA 标记方法（图 3）在 LDL 颗粒上不可行。使用 DMSO 穿透 LDL 颗粒的脂质单层，从而介导 miRNA 的结合。整个过程耗时 1–2 天，标记效率接近 100%。

通过精胺DMSO和LDL缓冲液标记miRNA；示意图显示了吸水珠和透析装置。
图3： LDL颗粒标记流程图。 将miRNA等分试样与精胺溶液在30 °C下孵育30分钟，然后加入DMSO和LDL缓冲液。将LDL样品在冰上用LDL缓冲液孵育10分钟，随后加入miRNA/精胺/DMSO混合物。在40 °C下孵育2小时后，将溶液转移至透析膜腔室（分子量截留值：20 kDa），在+4 °C下用PBS和吸水珠进行透析。分别在1小时和2小时后更换缓冲液和吸水珠。24小时后回收标记的LDL颗粒溶液，测定浓度，并在惰性气体环境中+4 °C保存。 请点击此处查看该图的放大版本。

脂蛋白颗粒的质量控制
高速原子力显微镜（HS-AFM）可用于在云母表面观察天然及重组/标记脂蛋白颗粒的大小和形状。使用前必须对云母进行新鲜解理（使用胶带剥离其上层），以获得洁净且平整的表面。在将高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）颗粒孵育于云母表面时，需调整稀释倍数（和/或孵育时间），以便观察到单个颗粒。聚集的颗粒无法用于测定颗粒尺寸。HDL颗粒在云母表面具有移动性。若使用常规原子力显微镜而非HS-AFM，则需相应调整固定化方案（缓冲液、表面涂层），以降低颗粒的侧向移动性。扫描样品时，必须保持较低的成像作用力（轻敲模式），以避免颗粒发生形变，从而影响测量结果。在数据分析中，通过阈值算法（例如在Gwyddion软件中：颗粒 > 按阈值标记）识别颗粒，并相对于云母表面测定其高度。测量颗粒高度是确定颗粒尺寸最精确的方法，因为横向尺寸会因探针形状而产生展宽效应（参见图4中的示例图像）。为进行统计评估和比较不同脂蛋白颗粒的尺寸分布，计算了颗粒高度的概率密度函数（pdfs）。如图4所示，对天然LDL颗粒与miRNA标记的LDL颗粒进行比较，可验证标记与未标记（即天然）脂蛋白颗粒在结构上的基本相似性（未添加miRNA/精胺混合物的标记LDL颗粒作为标记操作本身的对照）。整个过程耗时约1天。

原子力显微镜高度分析示意图；云母表面HDL/LDL检测；直方图结果。
图4：高速原子力显微镜（HS-AFM）测量的流程图及代表性结果。 将HDL/LDL颗粒样品用PBS稀释（1:102-1:103），滴加于新解理的云母表面，孵育5分钟，随后用PBS小心冲洗，以去除未结合（非静电吸附）的游离颗粒。进行HS-AFM成像，并检查表面颗粒密度。在室温下以PBS为缓冲液进行测量。本图上方图像显示颗粒密度过高；下方图像适合用于分析。经阈值处理后，对单个颗粒的高度进行分析，并在统计评估中比较天然颗粒（黑色曲线）与重组/标记颗粒（红色和绿色曲线）。比例尺 = 100 nm。该图改编自Axmann等19。 请点击此处查看此图的高清版本。

miRNA 提取、逆转录与qPCR
采用miRNA提取试剂盒从天然/人工富集的脂蛋白或细胞样本中提取miRNA，如图5A所示。此过程需在无RNase的环境中进行，极为关键。该步骤耗时约1 h。对提取的miRNA样本进行逆转录（如图5B所示），依据试剂盒制造商提供的标准生化操作流程进行，耗时约1.5 h。最后，采用qPCR测定上一步所得cDNA的含量（如图5C所示）。通过标准曲线将获得的cq值与miRNA绝对链数关联，从而计算出初始样本中miRNA的绝对含量。该步骤耗时约2.5 h。

miRNA 提取与 qPCR 流程；三步图示中的离心步骤及 RT-PCR 分析
图5：miRNA提取、逆转录与qPCR流程图 (A) miRNA 提取：将样品与裂解试剂混合，使用注射器抽吸裂解。孵育 5 分钟，加入 CHCl3剧烈振荡15秒，孵育3分钟。随后在1,200 x g 15 分钟 4 °C，收集上层相并与乙醇混合。将溶液转移至离心柱中（最大体积 <700 µL) 并在 8,000 x g 15秒。弃去洗脱液，用剩余溶液重复上一步骤。加入第一种洗涤缓冲液，于8,000 x g 15秒。弃去洗脱液，加入第二种洗涤缓冲液，8,000 x g 15秒。以2分钟的离心时间重复上一步骤。再以最大转速离心1分钟，进一步干燥膜。用H2O并以80,000 x g 1分钟。将提取的miRNA样品在-20 °C. (B逆转录：将10x缓冲液、H2将 O、dNTP 混合液、抑制剂和酶置于冰上，并配制主混合液。从面板中加入提取的 miRNA A 将反转录引物加入主混合液中，使用PCR仪进行反转录反应。将cDNA样品保存于-20 °C. (C) qPCR：解冻超级混合液，H2O，并将引物置于冰上，准备配制混合液。加入来自板的cDNA B 加入到混合液中并进行qPCR。分析数据以获得cq 数值并计算样品中miRNA的绝对含量（参见 图6 以及代表性结果的详细信息）。 请点击此处查看此图的放大版本。

miRNA 绝对含量与转移速率
天然及人工富集的高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）颗粒中miRNA的绝对含量，是根据样品的cq值以及相应miRNA的标准曲线计算得出，如图6所示。图6A展示的数据由分析软件计算获得（启用了DynamicTube 归一化功能，用于通过各样品扩增曲线的二阶导数校正不同背景信号水平，以及噪声斜率校正，即根据噪声水平进行归一化）。标准曲线的cq值是通过qPCR仪器测得的归一化荧光信号，并使用软件包中的自动阈值识别（Auto-find threshold）功能确定。该过程中，软件会最大化标准曲线拟合的R值。在针对每种特定miRNA的样品分析中，阈值水平保持恒定。随后，将cq值对miRNA分子拷贝数作图，并拟合得到回归直线。样品的cq值采用与标准曲线相同的阈值确定，如图6B所示；不同qPCR运行之间的反应效率差异，通过每次运行中加入的一个额外校准曲线样品，由软件自动校正。利用回归方程，即可计算出样品中未知的miRNA含量。脂蛋白颗粒数量是根据初始蛋白浓度及其平均分子量（MWHDL ~250 kDa）估算得出。此估算未考虑脂质对分子量的贡献，因此每个脂蛋白颗粒所携带的miRNA拷贝数略有高估。此外，假设miRNA提取步骤的回收率为100%。进一步地，测定细胞在与HDL颗粒孵育前后细胞内的miRNA含量，并据此计算miRNA的转移速率，如图6C所示。

定量 PCR 分析，包括荧光扩增曲线图、自动阈值设定及数据表格。
图6：绝对miRNA含量与转移率的计算流程图 (AmiR-155标准曲线：取一份miR-155等分试样（100 µL, 10 µM) 用无 RNA 水按所示进行连续稀释。qPCR 得到 cq 每个系列稀释样品（测量两次）的数值，使用 自动查找阈值 软件包的功能。阴性对照实验（未添加miRNA）产生了cq 值 >35. c 的数据点q 根据初始浓度和系列稀释计算得到的每单位样品体积中的miRNA链数，其数值通过所示方程进行拟合（红色线条，右图），得到 M = -3.36 和 B = 42.12。测定的PCR效率为0.98。误差线根据实验重复结果计算得出，且小于数据点圆圈的直径。Bcq 天然/人工富集HDL颗粒的数值采用与图中所确定的相同阈值水平进行测定 A 并转换为qPCR样本体积中miRNA链的数量。根据样本体积中HDL颗粒的数量（浓度）（3.2 x 1011 颗粒）。C细胞样品（细胞系 ldlA7-SRBI）与人工富集的HDL颗粒共同孵育16小时（50 µg/mL）并进行类似分析。所确定的 cq 仅含细胞、细胞与天然HDL共孵育、或细胞与rHDL颗粒溶液共孵育的值分别为22.5、22.5和19.3（两者） 50 µg/mL），分别。这些数值已如图示面板所示转换为miRNA链的数量 B孵育后的miRNA链数量（7.3 x 106) 通过减去孵育前的miRNA链数量（8.6 × 105）。将结果除以样本体积中的细胞数量（3,100），得到miRNA-颗粒比（1.5 x 10-4），以及孵育时间（16 小时）。由此得出通过miRNA摄取介导的脂蛋白颗粒转移速率（每细胞每秒240个HDL颗粒摄取事件）。该数据经Axmann等修改而来。19. 请点击此处以查看此图的放大版本。

多孔微流控阵列
由于miRNA提取产量较低，提取后需对miRNA进行逆转录，并随后进行预扩增步骤。最后进行qPCR，如图所示 图6，进行了实验。所有步骤均按照制造商所述的标准生化操作程序进行。此处提供了针对一项关于慢性肾功能衰竭（CRF）对巨噬细胞胆固醇外流影响研究中招募的尿毒症患者HDL颗粒上全局miRNA谱的部分分析结果。18 如图所示。本研究测定了17例年轻成人尿毒症患者（CKD 3-5期）和14例年轻成人血液透析患者（均无伴随疾病）以及相匹配的对照组的血清或高密度脂蛋白（HDL）胆固醇接受能力。数据分析采用默认设置（最大允许CT值：40.0，计算中包含最大CT值，并排除重复样本中的离群值）。 P-值通过以下方法进行校正： 本杰明尼-霍赫伯格错误发现率 （减少假阳性结果的发生）以及作为归一化方法， 全局归一化 选择在所有样本中均存在的共同检测项目，并采用其 C 值的中位数T 用于标准化。在代表性结果中，展示了从尿毒症患者高密度脂蛋白（HDL）中分离的某些miRNA的相对定量值（RQ）（对照组RQ为1）。显然，miR-122和miR-224在尿毒症患者HDL中高表达。此步骤共耗时约1天。

逆转录、热循环仪和结果图表的PCR过程示意图
图7：多孔微流控阵列的流程图及代表性结果。 如图5A所示完成miRNA提取后，将miRNA样本与逆转录引物以及含有10×缓冲液、H2O、dNTP混合物、抑制剂、MgCl2和酶的主混合液混合。冰上孵育5分钟后，使用热循环仪进行逆转录反应。加入预扩增主混合液，冰上孵育5分钟，随后使用热循环仪进行预扩增。加入0.1× TE（pH 8.0），取部分产物与PCR主混合液和H2O混合。将PCR反应混合液移入多孔微流控阵列的加样口，以3,000 × g离心两次，每次1分钟。使用PCR系统进行qPCR，并分析数据以获得相对定量值（RQ值）（本图显示了尿毒症患者高密度脂蛋白颗粒的RQ值与健康对照组的比较18）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文逐步描述了从人血液中分离脂蛋白颗粒组分并测定其各自miRNA含量的方法。在处理分离和合成的miRNA时，必须在无RNase的环境中操作——而嵌入颗粒中的miRNA显然可免受酶降解。由于天然脂蛋白颗粒中的miRNA/颗粒比例较低，因此需要人为富集miRNA，以研究全颗粒被细胞摄取的过程。为此，对先前所述的HDL颗粒重建方法7进行了改进，以将miRNA链整合入颗粒中。此外，该过程中脂质组分与蛋白质组分的分离，使研究人员能够分别分析脂蛋白颗粒中与脂质和蛋白质相关的组分19。类似地，LDL颗粒的标记方法也进行了相应调整。有趣的是，添加精胺（一种核苷酸的天然稳定剂）并未影响miRNA/颗粒的比例。需要注意的是，原则上该方法允许将除miRNA以外的其他物质包载入脂蛋白颗粒中。当然，包载物质的物理尺寸受限于HDL颗粒（直径：5–12 nm）和LDL颗粒（直径：18–25 nm）的整体大小。

关于重组或标记脂蛋白颗粒的质量控制，高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种可在单颗粒水平上表征高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）颗粒的适用方法。与电子显微镜（EM）相比，该方法具有更短的样品制备时间，并可在接近生理条件（湿润环境、室温）下进行。

由于其固有的高灵敏度和扩增能力，qPCR 是检测低浓度 miRNA 的首选方法。相比之下，尽管单分子灵敏度的荧光显微镜能够检测单个分子，但由于每个颗粒中荧光标记的 miRNA 链浓度极低，因此并不适用。据研究发现，每个天然脂蛋白颗粒中的 miRNA 链数量比为 10-8。人工富集可使该比值提高 10,000 倍，从而有助于估算细胞对脂蛋白的摄取速率（使用天然脂蛋白颗粒检测时无显著差异19）。qPCR 的高灵敏度使得通过测量孵育时间后的 miRNA 链数量以及 miRNA/颗粒比值来确定该摄取速率成为可能。需要注意的是，所计算的数值忽略了细胞内 miRNA 的降解和释放，因此仅代表脂蛋白颗粒摄取比值的最低下限。

未来，该方法可被用于将药物物质（尤其是脂溶性药物）转入细胞，并将其生物学效应与细胞内浓度相关联（通过脂蛋白颗粒的摄取速率来确定）。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了奥地利科学基金项目P29110-B21、“维也纳市高等教育纪念基金会促进科学项目”H-3065/2011、欧洲区域发展基金（EFRE, IWB2020）、上奥地利州联邦州以及“上奥地利州基础资助”的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
超速离心机BeckmanOptima L-100 XP脂蛋白分离
超速离心机转子BeckmanTI 55.2脂蛋白分离
真空采血管（EDTA）Becton Dickinson366643脂蛋白分离
溴化钾Sigma Aldrich2110脂蛋白分离
超速离心管Beckman342414脂蛋白分离
超速离心管密封器Beckman342428脂蛋白分离
氯化钠Carl Roth GmbHP029.2脂蛋白分离
EDTAFisher ScientificD/0650/50脂蛋白分离
透析管，截留分子量 12 - 14kSpectra132700脂蛋白分离
合成miRNAmicroSynth-合成miRNA
TRIS缓冲液 pH 7AmbionAM9850G合成miRNA
TRIS缓冲液 pH 8AmbionAM9855G合成miRNA
无菌管Carl Roth GmbHENE8.1合成miRNA
分光光度计EppendorfEppendorf BiophotometerBradford测定
比色皿Carl Roth GmbHXK20Bradford测定
考马斯亮蓝G-250染料BioRad GmbH161-0786Bradford测定
氯化钠Carl Roth GmbH3957.1去脂化
EDTAFluka Analytical03690-100ML去脂化
TRIS缓冲液 pH 8.0AmbionAM9855G去脂化
乙醇 100%AustrAlcoEthanol Absolut 99.9%去脂化
乙醚Carl Roth GmbH3942.1去脂化
离心机Thermo ScientificMultifuge X3R去脂化
氯仿Carl Roth GmbH3313.1再构建
甲醇Carl Roth GmbH4627.1再构建
磷脂酰胆碱Sigma Aldrich GmbHP3556-25mg再构建
胆固醇油酸酯Sigma Aldrich GmbHC-9253-250mg再构建
胆固醇Sigma Aldrich GmbHC8667-500mg再构建
玻璃管Carl Roth GmbHK226.1再构建
精胺Sigma Aldrich GmbHS3256-1G再构建
恒温混匀仪EppendorfThermomixer comfort再构建
脱氧胆酸钠Sigma Aldrich GmbH3097-25G再构建
磁力搅拌子Carl Roth GmbH0955.2再构建
100µL 微量移液器Carl Roth GmbHA762.1再构建
PBSCarl Roth GmbH9143.2透析
Amberlite XAD-2 树脂珠Sigma Aldrich GmbH10357透析
Slide-A-Lyzer 透析盒（截留分子量 20 kDa）Thermo Scientific66003透析
注射器Braun9161406V透析
注射器针头Braun465 76 83透析
EGTACarl Roth GmbH3054.2LDL颗粒标记
DMSOlife technologiesD12345LDL颗粒标记
原子力显微镜RIBMSS-NEX再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制
云母（V-1级）Christine GröplG250-1/V1再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制
AFM悬臂梁NanoworldUSC-F1.2-k0.15再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制
Gwyddion 2.49捷克计量研究院http://gwyddion.net再构建/标记脂蛋白颗粒的质量控制
细胞培养腔室载玻片，Nunc Lab-TekVWR734-2122细胞培养
HBSSCarl Roth GmbH9117.1细胞培养
细胞计数仪Omni Life Science GmbHCasy细胞培养
miRNeasy Mini试剂盒QIAGEN217004miRNA提取
离心机Eppendorf5415RmiRNA提取
20G针头BraunSterican 465 75 19miRNA提取
5ml注射器Becton Dickinson309050miRNA提取
PCR操作柜EscoPCR-3A1逆转录
TaqMan逆转录试剂盒Thermo Scientific4366596逆转录
无RNase水Carl Roth GmbHT143逆转录
0.2 ml 管Brand781305逆转录
离心机Carl Roth GmbHMicrocentrifuge AL逆转录
热循环仪SensoquestLabcycler逆转录
TaqMan引物Thermo Scientific-qPCR
iTaq通用探针预混液BioRad GmbH1725131qPCR
PCR仪CorbettRotor-Gene RG-6000qPCR
TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒Applied Biosystems4366596TaqMan阵列
Megaplex RT引物，人A池 v2.1Applied Biosystems4399966TaqMan阵列
TaqMan PreAmp主混合液Applied Biosystems4391128TaqMan阵列
Megaplex PreAmp引物，人A池 v2.1Applied Biosystems4399933TaqMan阵列
TaqMan通用主混合液II，不含UNGApplied Biosystems4440040TaqMan阵列
TaqMan Advanced miRNA人A芯片Applied BiosystemsA31805TaqMan阵列
无核酸酶水Thermo ScientificR0581TaqMan阵列
MgCl2 (25mM)Thermo ScientificR0971TaqMan阵列
TE缓冲液，pH 8.0InvitrogenAM9849TaqMan阵列
7900HT快速实时PCR系统Applied Biosystems4351405TaqMan阵列
TaqMan阵列芯片封膜仪Applied Biosystems-TaqMan阵列

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microRNA HDL LDL Bradford microRNA
天然脂蛋白颗粒中microRNA的富集及其绝对/相对microRNA含量与细胞间转移速率的测定
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