利用慢病毒介导的基因沉默技术在低吸附培养板中制备的人类假胰岛中的应用

摘要

本文介绍了一种利用携带短发夹RNA（shRNA）的慢病毒转导分散的人胰岛细胞，从而制备基因修饰的人源假胰岛的实验方案。该方案使用常规易得的酶和培养器具，操作简便，可生成适用于功能学和形态学研究的基因修饰人源假胰岛。

摘要

目前已有多种遗传学工具可用于调控啮齿类动物胰岛中的基因，以解析胰岛基因在糖尿病研究中的功能。然而，由于物种间胰岛结构与功能存在已知差异，啮齿类动物胰岛获得的研究数据往往难以在人胰岛中完全重现或适用。目前可用于操控人胰岛基因表达的技术仍十分有限。通过腺病毒、质粒或寡核苷酸将外源基因导入完整胰岛的方法常面临效率低和毒性高的问题。在需要高效率的完整胰岛基因下调研究中，低效率问题尤为突出。已知经酶消化分散的胰岛细胞在培养中可重新聚集，形成称为假胰岛（pseudoislets）的球状结构。通过控制人胰岛细胞的重聚集规模，可生成在长期培养后仍维持动态第一时相胰岛素分泌功能的假胰岛，并为高效、低毒地引入慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）提供条件。本文详细描述了一种利用两种 commercially available 多孔板在慢病毒转导后制备人假胰岛的实验方案。该方案操作简便，可实现人胰岛细胞中基因的高效下调，并评估胰岛素分泌的动态特性。因此，通过慢病毒介导基因调控的人假胰岛为研究人胰岛细胞内基因功能提供了一个强大且灵活的模型。

引言

功能性β细胞质量的丧失是1型和2型糖尿病共同的核心病理基础¹。尽管β细胞是胰岛中胰岛素的产生细胞，但β细胞与非β细胞之间的相互通讯在胰岛素分泌调控中发挥着关键作用²。此外，胰高血糖素分泌的失调也参与了糖尿病中高血糖的发生³。因此，人们高度关注通过调控胰岛内细胞的基因表达，以阐明糖尿病胰岛功能障碍背后的机制。目前已有多种方法可用于调控小鼠胰岛的基因表达，包括使用转基因小鼠模型。然而，人和小鼠的胰岛在神经支配、细胞分布、α细胞与β细胞的比例以及对促分泌剂的反应等方面均存在显著差异⁴。因此，直接评估基因在人胰岛中的功能，对于理解人胰岛病理生理机制至关重要。

腺病毒载体是体外转导胰岛最常用的病毒载体，因其在非分裂细胞中具有高效的转导能力。然而，腺病毒难以有效穿透胰岛核心区域，尤其是在人胰岛中⁵，且在高剂量时具有细胞毒性⁶。相比之下，慢病毒载体细胞毒性较低，并能将外源基因永久整合至终末分化细胞的染色体中，因此被广泛用作基因治疗的载体⁷。然而，慢病毒穿透完整人胰岛核心的能力也有限，因此需要通过酶消化部分分散胰岛以提高转导效率

方案

在研究开始之前，爱荷华大学机构审查委员会对本研究进行了人体受试者研究判定，认定本研究不符合人体受试者研究的标准。在启动研究前，请咨询当地的审查委员会，以确定胰岛来源及计划开展的研究是否需要事先批准。

注意：通常，需要1,200−1,400个胰岛当量（IEQ）的人胰岛，用于在96孔超低吸附培养板中形成192个类胰岛（每个类胰岛含3,000个细胞），或在微孔培养板中形成1,200个类胰岛（每个类胰岛含500个细胞）。由于供体因素（年龄、健康状况、体重）、胰岛分离效率及培养条件的不同，不同批次人胰岛所需的IEQ数量会有所差异。在本方案中，使用含有靶向目的基因的shRNA的慢病毒。已有报道表明，基于巨细胞病毒（CMV）和人磷酸甘油酸激酶（hPGK）启动子的慢病毒载体可在人源类胰岛中高效下调基因表达^5,15。使用慢病毒需注意其生物危害性¹⁶。在开始使用慢病毒前，请事先联系当地的生物安全委员会。

1. 人胰岛运输后恢复的过夜培养

1. 在生物安全柜（BSC）中，将50 mL CMRL-1066培养基、0.5 g人血清白蛋白（HSA）、0.5 mL青霉素-链霉素和0.5 mL 100 mg/mL谷氨酰胺混合，配制含1%人....

结果

图1展示了使用96孔超低吸附培养板和微孔培养板制备伪胰岛的关键步骤。图2a显示了在96孔超低吸附培养板中，由3 × 10³个人类胰岛细胞形成伪胰岛过程中形态的连续变化。第1天观察到的单层细胞或松散细胞团在第5至7天转变为具有光滑圆形边界的致密聚集体（图2a）。在微孔培养板中，通常在4天内即可观察到致密伪胰岛的形成（图2b）。当在每个微孔中接种600个细胞时，人类胰岛细胞会凝聚成大小均一的球形结构。观察发现，与96孔超低吸附培养板相比，微孔培养板能够利用更少量的细胞成功形成伪胰岛。通常，使用96孔超低吸附培养板每孔需要超过1,500个细胞才能形成伪胰岛，而使用24孔微孔培养板每孔仅需500个细胞即可满足需求。成功形成的伪胰岛在从96孔超低吸附培养板或微孔培养板中回收后仍保持球形结构，并适用于包括静态孵育（

讨论

本文介绍了一种利用慢病毒转导在96孔超低吸附培养板或微孔培养板中生成人源伪胰岛的详细实验方案。已有研究报道，伪胰岛在形态和分泌功能方面与天然人胰岛相似，并可在体外长期培养^5,11,18。与大小差异较大的天然人胰岛不同，伪胰岛的尺寸相对均一，从而减少了供体间及实验重复间的变异^5,11。在单细胞悬液阶段、伪胰岛形成前，可方便地对需要高效转导的基因进行下调。该方法避免了病毒穿透完整胰岛多层细胞结构的困难。因此，这一简单、高效且可重复的人源伪胰岛制备方案具有广泛的应用前景。

尽管已有多种不同平台被报道用于伪胰岛的形成^12,14,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗黏附冲洗液	Stemcell Technologies	7919
生物安全柜	Thermo Scientific	1300 系列 A2 型
细胞筛，40 微米	Corning	431750
CMRL-1066 培养基	ThermoFisher	11530037
CO2 培养箱	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i
圆锥形离心管，15 mL	VWR	89039-666
圆锥形离心管，50 mL	VWR	89039-658
胎牛血清	ThermoFisher	26140079
硫氰酸胍RNA提取试剂	ThermoFisher	15596026	Trizol
谷氨酰胺	ThermoFisher	25030164
血细胞计数板	Marienfeld	改进型Neubauer亮线
人血清白蛋白	Sigma	A1653
倒置显微镜	Fisher Brand	11-350-119
微量离心机	Beckman Coulter	Microfuge 20
微量离心管，1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
微孔培养板	Stemcell Technologies	34411	Aggrewell 400，24孔
电动研磨杵	GAMUT	#399X644
非组织培养处理培养皿，10 cm	Fisher Scientific	FB0875713
PBS缓冲液	ThermoFisher	14190250
青霉素-链霉素双抗	ThermoFisher	10378016
培养皿，35 mm	Celltreat	229638
移液器，5 mL	DOT Scientific	667205B
移液器，8通道	VWR	#613-5253
移液器，10 mL	VWR	667210B
移液器，P10	Denville	UEZ-P-10
移液器，P200	Denville	UEZ-P-200
移液器，P1000	Denville	UEZ-P-1000
蛋白水解和胶原酶解酶混合物	Sigma	A6965	Accutase
试剂储液槽，50 mL	VWR	89094-680
可逆式筛网，37 微米	Stemcell Technologies	27251
摆动桶式平板离心机	Beckman Coulter	Allegra X-14R
摆动桶转子	Beckman Coulter	SX4750A
结核菌素注射器，1 mL	BD	309659
超低吸附96孔微孔板	Corning	4515