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方法文章

利用慢病毒介导的基因沉默技术在低吸附培养板中制备的人类假胰岛中的应用

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DOI：

10.3791/59578

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2019年5月14日

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1Department of Internal Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center, University of Iowa, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用携带短发夹RNA（shRNA）的慢病毒转导分散的人胰岛细胞，从而制备基因修饰的人源假胰岛的实验方案。该方案使用常规易得的酶和培养器具，操作简便，可生成适用于功能学和形态学研究的基因修饰人源假胰岛。

摘要

目前已有多种遗传学工具可用于调控啮齿类动物胰岛中的基因，以解析胰岛基因在糖尿病研究中的功能。然而，由于物种间胰岛结构与功能存在已知差异，啮齿类动物胰岛获得的研究数据往往难以在人胰岛中完全重现或适用。目前可用于操控人胰岛基因表达的技术仍十分有限。通过腺病毒、质粒或寡核苷酸将外源基因导入完整胰岛的方法常面临效率低和毒性高的问题。在需要高效率的完整胰岛基因下调研究中，低效率问题尤为突出。已知经酶消化分散的胰岛细胞在培养中可重新聚集，形成称为假胰岛（pseudoislets）的球状结构。通过控制人胰岛细胞的重聚集规模，可生成在长期培养后仍维持动态第一时相胰岛素分泌功能的假胰岛，并为高效、低毒地引入慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）提供条件。本文详细描述了一种利用两种 commercially available 多孔板在慢病毒转导后制备人假胰岛的实验方案。该方案操作简便，可实现人胰岛细胞中基因的高效下调，并评估胰岛素分泌的动态特性。因此，通过慢病毒介导基因调控的人假胰岛为研究人胰岛细胞内基因功能提供了一个强大且灵活的模型。

引言

功能性β细胞质量的丧失是1型和2型糖尿病共同的核心病理基础1。尽管β细胞是胰岛中胰岛素的产生细胞，但β细胞与非β细胞之间的相互通讯在胰岛素分泌调控中发挥着关键作用2。此外，胰高血糖素分泌的失调也参与了糖尿病中高血糖的发生3。因此，人们高度关注通过调控胰岛内细胞的基因表达，以阐明糖尿病胰岛功能障碍背后的机制。目前已有多种方法可用于调控小鼠胰岛的基因表达，包括使用转基因小鼠模型。然而，人和小鼠的胰岛在神经支配、细胞分布、α细胞与β细胞的比例以及对促分泌剂的反应等方面均存在显著差异4。因此，直接评估基因在人胰岛中的功能，对于理解人胰岛病理生理机制至关重要。

腺病毒载体是体外转导胰岛最常用的病毒载体，因其在非分裂细胞中具有高效的转导能力。然而，腺病毒难以有效穿透胰岛核心区域，尤其是在人胰岛中5，且在高剂量时具有细胞毒性6。相比之下，慢病毒载体细胞毒性较低，并能将外源基因永久整合至终末分化细胞的染色体中，因此被广泛用作基因治疗的载体7。然而，慢病毒穿透完整人胰岛核心的能力也有限，因此需要通过酶消化部分分散胰岛以提高转导效率8。但分散完整人胰岛的问题在于会中断细胞间及细胞与基质间的相互作用，从而损害胰岛素分泌的动态调控功能，而这种调控对维持人体葡萄糖稳态至关重要9。因此，在人胰岛模型中评估基因调控对胰岛功能动态调节的影响一直具有挑战性。

已知来自人和啮齿类动物胰岛的分散胰岛细胞能够自主重聚形成类似胰岛的结构，称为“假胰岛”。假胰岛中的β细胞和非β细胞分布与天然胰岛相似10,11。此外，天然胰岛在长期培养后会逐渐丧失强烈的葡萄糖刺激第一时相胰岛素分泌能力5,10,11,12。然而，在相同培养时间后，假胰岛相较于天然胰岛能更好地保留对葡萄糖刺激的第一时相胰岛素分泌反应5。除了胰岛素分泌功能的更好维持外，在低吸附培养板中对人胰岛细胞进行尺寸可控的重聚，还提供了一个在细胞重聚为假胰岛前引入慢病毒载体的机会窗口11。已有多个研究证明了假胰岛结合慢病毒介导转导的应用价值。Caton 等人13报道，在大鼠假胰岛中引入表达绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒对胰岛素分泌几乎没有影响，同时实现了GFP在假胰岛中的均一表达，而对照组未感染病毒。他们还通过慢病毒过表达连接蛋白connexin 32、36和43，证明了不同connexin对胰岛素分泌的特异性影响13。使用市售的96孔超低吸附培养板制备的人假胰岛显示，通过慢病毒介导过表达转录因子SIX3可提高静态孵育评估下的胰岛素分泌水平14。最近，利用96孔超低吸附培养板制备的人假胰岛通过慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）下调葡萄糖激酶（glucokinase），作为概念验证，结果显示葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，而KCl刺激的胰岛素分泌得以保留5。该研究还表明，人假胰岛在基因表达和分泌谱方面与天然胰岛相似，进一步支持了人假胰岛在解析胰岛功能调控机制中的应用价值5。尽管尚未进行灌流实验，但已有报道指出，一种新近上市的生物工程微孔培养板同样适用于慢病毒转导，并可生成在体外及移植后体内均表现出优异胰岛素分泌功能的人假胰岛11。综上所述，人假胰岛的形成结合慢病毒转导是一种简单且高效的策略，可用于研究人胰岛的病理生理机制，为人胰岛中的机制性研究提供了有价值的工具。

本报告介绍了一种利用两种市售平台——96孔超低吸附培养板和微孔培养板，通过慢病毒转导形成人源伪胰岛的实验方案。这两种方法均可高效调控基因表达，并生成适用于后续功能评估（包括静态孵育和灌流实验）的人源伪胰岛。 

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方案

在研究开始之前，爱荷华大学机构审查委员会对本研究进行了人体受试者研究判定，认定本研究不符合人体受试者研究的标准。在启动研究前，请咨询当地的审查委员会，以确定胰岛来源及计划开展的研究是否需要事先批准。

注意：通常，需要1,200−1,400个胰岛当量（IEQ）的人胰岛，用于在96孔超低吸附培养板中形成192个类胰岛（每个类胰岛含3,000个细胞），或在微孔培养板中形成1,200个类胰岛（每个类胰岛含500个细胞）。由于供体因素（年龄、健康状况、体重）、胰岛分离效率及培养条件的不同，不同批次人胰岛所需的IEQ数量会有所差异。在本方案中，使用含有靶向目的基因的shRNA的慢病毒。已有报道表明，基于巨细胞病毒（CMV）和人磷酸甘油酸激酶（hPGK）启动子的慢病毒载体可在人源类胰岛中高效下调基因表达5,15。使用慢病毒需注意其生物危害性16。在开始使用慢病毒前，请事先联系当地的生物安全委员会。

1. 人胰岛运输后恢复的过夜培养

  1. 在生物安全柜（BSC）中，将50 mL CMRL-1066培养基、0.5 g人血清白蛋白（HSA）、0.5 mL青霉素-链霉素和0.5 mL 100 mg/mL谷氨酰胺混合，配制含1%人血清白蛋白的Connaught医学研究实验室1066（CMRL-1066）培养基（1% HSA CMRL），并通过0.2 μm滤器过滤除菌。
  2. 轻轻摇动运输瓶以保持胰岛悬浮状态。将含有胰岛的运输液转移至50 mL锥形离心管中，在生物安全柜中静置15分钟，使胰岛沉降至管底。
  3. 使用10 mL移液器小心吸除运输液，避免扰动胰岛沉淀。用1% HSA CMRL重悬胰岛沉淀，调整浓度至400 IEQ/mL。
  4. 将胰岛转移至未经组织培养处理的培养皿中。若需将胰岛分装至多个培养皿，分装前应轻轻摇动以保持胰岛在培养基中均匀悬浮。在37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
    注意：必须使用未经组织培养处理的培养皿，以防止胰岛贴附于培养皿表面。

2. 人胰岛单细胞悬液的制备

  1. 准备以下物品：室温（RT）的含10%热灭活胎牛血清（HiFBS）、青霉素-链霉素和谷氨酰胺的CMRL-1066培养基（10% HiFBS CMRL）、40 µm细胞筛、35 mm培养皿、1 mL结核菌素注射器和血细胞计数板。
  2. 将经过过夜培养的人胰岛转移至15 mL锥形离心管中，在水平转子中以190 × g离心5分钟。用5 mL移液器吸除上清液，注意不要扰动胰岛沉淀。
  3. 向管中加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻混匀后，以190 × g离心5分钟。吸除PBS，注意不要扰动胰岛沉淀。
  4. 将胰岛沉淀重悬于0.5 mL预热的蛋白酶和胶原酶混合液中，使用P1000移液器轻柔吹打5次以混匀胰岛。在37 °C孵育5分钟，期间轻柔上下吹打1−5次。
    注意：剧烈吹打会增加细胞损失。
  5. 观察溶液浑浊程度（单个细胞）及碎片数量（未消化的胰岛）。根据浑浊程度和碎片数量判断消化程度，必要时在37 °C继续孵育2−3分钟。当碎片减少至消化前的约10%，且溶液呈现浑浊时，停止消化。
    注意：消化所需时间因不同人胰岛制备样品中胰岛大小分布而异。
  6. 将40 µm细胞筛置于35 mm培养皿中，加入1 mL含10% HiFBS的CMRL培养基润湿细胞筛，并用1 mL注射器活塞轻压。将全部细胞悬液转移至细胞筛上方，收集滤过液于新的15 mL离心管中。
  7. 用0.5 mL新鲜CMRL培养基冲洗用于胰岛消化的离心管，以回收残留细胞，并将冲洗液通过细胞筛过滤。将滤过液合并至同一15 mL离心管中。重复此步骤一次。
  8. 接下来，将置于35 mm培养皿中的细胞筛用1 mL注射器活塞轻压，以解离残留在筛网上的未消化胰岛。再次收集滤过液，并用新鲜CMRL-1066培养基冲洗细胞筛，以彻底清除筛网和培养皿中残留的消化产物。此时，15 mL离心管中将获得总量约3 mL的单细胞悬液。
  9. 记录细胞悬液的总体积，取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。
  10. 将细胞悬液以200 × g离心5分钟。小心吸除上清液，勿扰动沉淀。若使用96孔超低吸附培养板进行细胞重聚，则进入步骤3.1.1；若使用24孔微孔培养板，则进入步骤3.2.1。

3. 假胰岛形成及慢病毒转导

  1. 使用96孔超低吸附培养板的实验方案
    1. 确定每个拟胰岛所需的细胞数量以及需要制备的拟胰岛数量。通常，在96孔超低吸附培养板中，每个拟胰岛使用1,000−3,000个细胞。若每个拟胰岛需要3,000个细胞，则通过将步骤2.10中获得的胰岛沉淀重悬于10% HiFBS CMRL培养基中，调整细胞悬液浓度至1 × 105 个细胞/mL，使30 µL细胞悬液含有3,000个细胞。使用以下公式计算所需1 × 105 个细胞/mL单细胞悬液的总体积（mL）：
      单细胞悬液（1 × 105 个细胞/mL）的总体积（mL）=（每个拟胰岛的细胞数）×（拟制备的拟胰岛数量）/ 1 × 105。
      注意：根据每个拟胰岛所需的细胞数量调整细胞悬液浓度，确保30 µL细胞悬液可形成一个拟胰岛。
    2. 将所需体积（30 µL × 拟制备的拟胰岛数量）的单细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。加入每细胞250转导单位（TU）的慢病毒，该病毒携带靶向目标基因或对照的shRNA。
      注意安全：慢病毒属于生物安全二级（BSL-2）物质，可整合至感染细胞的DNA中。
      注意：使用浓缩的慢病毒，以使添加的病毒体积最小化。高效基因沉默所需的每细胞病毒滴度可能因慢病毒载体结构不同而异。
    3. 使用P1000移液器轻柔吹打5次，混合细胞悬液与病毒。若使用8通道移液器，可将混合后的细胞转移至50 mL无菌试剂储液槽中。
    4. 使用8通道移液器或P200移液器，将30 µL含慢病毒的单细胞悬液加入每孔中。
    5. 将96孔板置于摆动式转子离心机中，在室温下以270 × g 离心7分钟。检查细胞是否聚集于各孔中央。若未完全聚集，需再次离心，因为所有细胞聚集于孔中央对拟胰岛形成至关重要。随后在37 °C、5% CO2 恒湿培养箱中过夜培养。
    6. 次日早晨，每孔加入100 µL预热的10% HiFBS CMRL培养基，以避免后续培养过程中细胞干燥。在室温下以270 × g 离心7分钟。继续在37 °C、5% CO2 培养箱中培养。拟胰岛将在5−7天内完成形成。
    7. 收获拟胰岛前，预热所需体积的10% HiFBS CMRL培养基（每胰岛100 µL），并在生物安全柜（BSC）中准备一个50 mL无菌储液槽、一个无菌10 cm培养皿和一个8通道移液器。
    8. 将96孔板从培养箱中取出并置于生物安全柜内。将每胰岛100 µL的10% HiFBS CMRL培养基移入储液槽中。
    9. 从储液槽中吸取每孔100 µL的10% HiFBS CMRL培养基加入拟胰岛孔中，并在孔内轻柔吹打2−3次，使胰岛脱离孔底。然后吸出含有拟胰岛的培养基，并排入10 cm培养皿中。使用8通道移液器可一次性转移8个拟胰岛。
    10. 在光学显微镜下检查培养板，确保所有拟胰岛均已完全移除。拟胰岛形成紧密的细胞团块，脱离后仍保持聚集状态。此时拟胰岛已可用于后续实验。
  2. 使用24孔微孔培养板的实验方案
    1. 将抗黏附冲洗液（材料表）升温至室温，以促进球状体形成。同时预热普通CMRL-1066培养基和10% HiFBS CMRL培养基。
    2. 向拟用于拟胰岛培养的24孔微孔培养板的每孔中加入500 µL抗黏附冲洗液。在摆动式转子离心机中以1,300 × g 离心5分钟。
    3. 在显微镜下观察培养板，确保微孔中无气泡残留。若微孔中存在气泡，需再次以1,300 × g 离心5分钟。
    4. 在生物安全柜（BSC）中吸除各孔中的抗黏附冲洗液。每孔用2 mL温热的普通CMRL-1066培养基冲洗一次，随后吸除CMRL-1066培养基。向计划使用的每孔中加入0.5 mL温热的10% HiFBS CMRL培养基。此时各孔已准备好用于接种步骤2.10中制备的分散人胰岛细胞。
    5. 确定每孔所需的总细胞数。一个24孔微孔培养板的每孔含有1,200个微孔，可形成1,200个拟胰岛。500个细胞/拟胰岛 × 1,200个微孔 = 6 × 105 个细胞。将步骤2.10中获得的单细胞重悬于0.8 mL 10% HiFBS CMRL培养基中，使细胞总数为6 × 105 个，置于无菌1.5 mL离心管中。
      注意：每孔最大体积为2 mL，细胞悬液体积不应超过1.5 mL。本方案描述的是通过慢病毒转导制备一孔拟胰岛的操作步骤。根据每种慢病毒所需制备的孔数，按比例放大操作。
    6. 进行病毒转导时，向单细胞悬液中加入每细胞125 TU的慢病毒。保持病毒体积低于0.2 mL。在37 °C孵育细胞与病毒混合物1小时，期间偶尔轻柔混匀，以使细胞在步骤3.2.8细胞浓缩前充分接触病毒。
      注意：使用浓缩的慢病毒，以使添加的病毒体积最小化。与方案1相比，方案2中每细胞使用的TU数较低，原因是单位细胞所对应的培养基总体积较少。然而，高效基因沉默所需的每细胞病毒滴度可能因慢病毒载体结构不同而异，需进行优化。
      注意安全：慢病毒属于生物安全二级（BSL-2）物质，可整合至感染细胞的DNA中。
    7. 孵育1小时后，加入10% HiFBS CMRL培养基将胰岛细胞与病毒混合物的总体积调整至1 mL。若细胞在孵育后形成团块，需通过轻柔快速吹打2−3次将其重新分散为单细胞悬液。此步骤对细胞在微孔中的均匀分布至关重要。将细胞悬液转移至24孔微孔培养板的一孔中。
    8. 移液后立即在室温下以100 × g 离心3分钟，使细胞进入所有微孔。在显微镜下观察，确认细胞在所有微孔中均匀分布。
    9. 将微孔培养板置于37 °C、5% CO2 培养箱中培养。拟胰岛将在24−48小时内形成。拟胰岛可在不更换培养基的情况下培养长达7天。
    10. 若需在培养超过7天后更换培养基，每次更换50%−75%的培养基，具体操作如下：使用P1000移液器缓慢从每孔中移除0.5−1 mL培养基。将0.5−1 mL新鲜的10% HiFBS CMRL培养基缓慢加入孔壁，避免冲击导致拟胰岛从微孔中脱落。
    11. 准备收获拟胰岛时，预热10% HiFBS CMRL培养基。拟胰岛在无血清CMRL-1066培养基中容易上浮，难以收集。
    12. 使用1 mL移液器从孔中吸出0.5 mL培养基，并用力将培养基重新排回培养板表面，使拟胰岛从微孔培养板中脱离。
    13. 使用1 mL移液器轻柔吸出已脱离的拟胰岛，并转移至未经组织培养处理的6孔板中。通过置于15 mL锥形管上的37 µm可逆小滤网过滤。拟胰岛将保留在滤网上，未结合的单细胞则通过滤网。
      注意：为避免小尺寸拟胰岛通过滤网丢失，可省略滤网步骤。
    14. 向孔的整个表面加入1 mL 10% HiFBS CMRL培养基，以冲出任何残留的拟胰岛，吸出脱离的拟胰岛并通过滤网。重复此步骤3次，以确保完全收集所有拟胰岛。
    15. 在倒置显微镜下观察微孔培养板，确认所有拟胰岛均已收集。若仍有拟胰岛残留，重复步骤3.2.14的清洗操作。

4. 基因沉默效率评估的RNA提取

  1. 将伪胰岛挑选至1.5 mL离心管中的无RNase PBS中，在4 °C下以300 × g离心3分钟。移除PBS时注意不要扰动胰岛沉淀，再用PBS洗涤一次，随后在4 °C下以300 × g离心3分钟。
  2. 使用P1000移液器吸除大部分PBS，然后更换为P10移液器，小心吸除剩余PBS，避免扰动胰岛沉淀。
  3. 每管加入0.5 mL硫氰酸胍RNA提取试剂（材料表），使用电动研磨器匀浆2−3次。此时，含有伪胰岛的硫氰酸胍RNA提取试剂匀浆液可储存于-80 °C，或直接进行RNA纯化。
    注意：在96孔板中形成的24个含3,000个细胞的伪胰岛，或在微孔培养板中形成的48个含500个细胞的伪胰岛，足以获得0.5−1 µg的RNA。

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结果

图1展示了使用96孔超低吸附培养板和微孔培养板制备伪胰岛的关键步骤。图2a显示了在96孔超低吸附培养板中，由3 × 103个人类胰岛细胞形成伪胰岛过程中形态的连续变化。第1天观察到的单层细胞或松散细胞团在第5至7天转变为具有光滑圆形边界的致密聚集体（图2a）。在微孔培养板中，通常在4天内即可观察到致密伪胰岛的形成（图2b）。当在每个微孔中接种600个细胞时，人类胰岛细胞会凝聚成大小均一的球形结构。观察发现，与96孔超低吸附培养板相比，微孔培养板能够利用更少量的细胞成功形成伪胰岛。通常，使用96孔超低吸附培养板每孔需要超过1,500个细胞才能形成伪胰岛，而使用24孔微孔培养板每孔仅需500个细胞即可满足需求。成功形成的伪胰岛在从96孔超低吸附培养板或微孔培养板中回收后仍保持球形结构，并适用于包括静态孵育（

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讨论

本文介绍了一种利用慢病毒转导在96孔超低吸附培养板或微孔培养板中生成人源伪胰岛的详细实验方案。已有研究报道，伪胰岛在形态和分泌功能方面与天然人胰岛相似，并可在体外长期培养5,11,18。与大小差异较大的天然人胰岛不同，伪胰岛的尺寸相对均一，从而减少了供体间及实验重复间的变异5,11。在单细胞悬液阶段、伪胰岛形成前，可方便地对需要高效转导的基因进行下调。该方法避免了病毒穿透完整胰岛多层细胞结构的困难。因此，这一简单、高效且可重复的人源伪胰岛制备方案具有广泛的应用前景。

尽管已有多种不同平台被报道用于伪胰岛的形成12,14,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了美国国立卫生研究院对 Y.I. 的资助（R01-DK090490）以及美国糖尿病协会对 Y.I. 的资助（1-17-IBS-132）。J.A. 和 Y.I. 得到了鹰友会糖尿病研究中心的支持。A.B. 获得了美国国立卫生研究院培训基金（T32NS45549）的支持。作者使用了由美国国家糖尿病、消化系统与肾脏疾病研究所（NIDDK）资助、希望之城（City of Hope）负责运营的整合性胰岛分配计划（IIDP）提供的人胰岛组织（资助号：2UC4DK098085）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗黏附冲洗液Stemcell Technologies7919
生物安全柜Thermo Scientific1300 系列 A2 型
细胞筛，40 微米Corning431750
CMRL-1066 培养基ThermoFisher11530037
CO2 培养箱Thermo ScientificHeracell VIOS 160i
圆锥形离心管，15 mLVWR89039-666
圆锥形离心管，50 mLVWR89039-658
胎牛血清ThermoFisher26140079
硫氰酸胍RNA提取试剂ThermoFisher15596026Trizol
谷氨酰胺ThermoFisher25030164
血细胞计数板Marienfeld改进型Neubauer亮线
人血清白蛋白SigmaA1653
倒置显微镜Fisher Brand11-350-119
微量离心机Beckman CoulterMicrofuge 20
微量离心管，1.5 mLUSA Scientific1615-5500
微孔培养板Stemcell Technologies34411Aggrewell 400，24孔
电动研磨杵GAMUT#399X644
非组织培养处理培养皿，10 cmFisher ScientificFB0875713
PBS缓冲液ThermoFisher14190250
青霉素-链霉素双抗ThermoFisher10378016
培养皿，35 mmCelltreat229638
移液器，5 mLDOT Scientific667205B
移液器，8通道VWR#613-5253
移液器，10 mLVWR667210B
移液器，P10DenvilleUEZ-P-10
移液器，P200DenvilleUEZ-P-200
移液器，P1000DenvilleUEZ-P-1000
蛋白水解和胶原酶解酶混合物SigmaA6965Accutase
试剂储液槽，50 mLVWR89094-680
可逆式筛网，37 微米Stemcell Technologies27251
摆动桶式平板离心机Beckman CoulterAllegra X-14R
摆动桶转子Beckman CoulterSX4750A
结核菌素注射器，1 mLBD309659
超低吸附96孔微孔板Corning4515

参考文献

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