本文介绍了一种易于应用的方案，用于评估细胞外囊泡储存稳定性的方法。细胞外囊泡是一类由细胞产生的天然纳米颗粒。本实验以葡萄糖醛酸酶作为模型酶，将其装载入囊泡中，并在不同条件下进行储存。储存后，评估囊泡的理化参数及其包封酶的活性。
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本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是当前研究中极具前景的靶点，可被用作药物、药物载体以及生物标志物。在推进其临床应用的过程中，不仅需要关注其药理活性，还必须评估其生产过程。在这一背景下，研究主要聚焦于EVs的分离、表征及其储存。本文旨在提供一种简便的方法，用于评估不同储存条件对EVs的影响，且无需进行基因操作或特定的功能检测。该方法可快速获得EVs在特定储存条件下稳定性的初步结果，并便于比较来源于不同细胞来源的EVs。稳定性评估基于EVs的理化参数（包括粒径、颗粒浓度和形态）及其所载内容物活性的保持情况。后者通过皂苷介导将β-葡萄糖醛酸酶封装入EVs中进行测定。葡萄糖醛酸酶作为替代指标，可通过裂解荧光报告分子实现简便的定量检测。本实验方案可为研究人员筛选能够最大程度维持EVs特性的储存条件提供有力工具，从而推动EVs研究向临床应用迈进。
引言
细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞类型产生的膜包被纳米颗粒。对于哺乳动物细胞而言，EVs可根据其不同的生成途径分为两大类1,2膜泡的大小范围约为100–1,000 nm，由细胞膜直接出芽产生。外泌体大小为30–200 nm，来源于多泡体，后者通过向内出芽形成于内体中，随后多泡体与细胞膜融合，一次性释放多个外泌体。这些囊泡的主要功能是介导细胞间的信息传递3为此，RNA、DNA和蛋白质等货物被主动分选进入细胞外囊泡（EVs）。EVs可对其靶细胞产生多种效应，与健康和疾病状态均密切相关。一方面，EVs介导组织再生、抗原呈递或抗生素样作用等有益效应，使其成为极具前景的治疗开发靶点4,5另一方面，EVs 可促进肿瘤血管化6，诱导应激反应中的旁观者效应7，并可能在自身免疫性疾病中发挥作用8 和炎症性疾病9因此，它们可能是深入理解多种病理效应的关键组分。然而，在癌症等多种疾病中均存在结构或功能异常的细胞外囊泡（EVs）10,11,12 和心血管疾病13，且其在血液和尿液中易于获取，使其成为理想的生物标志物。最后，它们具有良好的生物相容性14 其固有的靶向能力使细胞外囊泡（EVs）在药物递送领域也具有重要意义15在本文中，我们描述了一种用于评估哺乳动物细胞来源的细胞外囊泡（EVs）储存稳定性的实验方案，该特性至关重要但迄今研究仍较少。
在细胞外囊泡（EVs）的临床开发过程中，仍存在诸多需要克服的障碍16，包括对其治疗效果的评估、生产、纯化以及储存17。尽管-80 °C被广泛视为EVs储存的金标准18，但所需的超低温冰箱成本高昂，且从生产到患者使用的整个冷链维持过程可能面临挑战。此外，一些研究报告指出，即使在-80 °C下储存，EVs的保存效果仍不理想，并会导致EVs功能的下降19,20。其他方法，如冷冻干燥21,22或喷雾干燥23，已被提出作为EVs冷冻储存的潜在替代方案。
评估储存稳定性的最佳方法是通过功能测定或特定标志物的检测来测试细胞外囊泡（EVs），例如其抗菌活性19。当已知囊泡的预期效应且仅需研究某一特定类型的EVs时，该方法是可行的。然而，若需比较不同细胞来源的EVs（例如用于药物包封研究），或缺乏已知的功能性检测指标时，则无法直接评估储存所引起的变化。
另一方面，仅评估其理化参数的变化（如尺寸、颗粒回收率和蛋白质浓度）并不总能预测细胞外囊泡（EV）活性的变化，这一点已在最近的一项专利中得到证实20。
本文提供了一种易于实施的方案，通过检测细胞外囊泡（EVs）的理化参数，并结合封装的β-葡萄糖醛酸酶活性（作为EVs内含物的替代指标），来评估EVs的储存稳定性。酶的装载采用皂苷孵育法，这是一种已建立的、适用于多种来源EVs的温和方法21,24,25。皂苷可在EV膜上形成瞬时孔道，从而使酶进入囊泡内部。由于酶在不利储存条件下容易失活，因此可作为评估EVs功能型内含物保存效果的理想替代指标。
我们已证明，将该方案应用于人源间充质干细胞（MSCs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以及人腺癌肺泡上皮细胞（A549）来源的细胞外囊泡（EVs）时，不同细胞系之间的储存稳定性确实存在显著差异，因此在选择EV来源时应充分考虑这一因素21。
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方案
1. 细胞培养及细胞条件培养基的制备
- 通常，根据各自细胞系所需的具体条件培养细胞。
- 在无血清条件下或在含有无细胞外囊泡（EV）的胎牛血清（FBS）的培养基中培养细胞 24–72 小时。
注意：若使用无 EV 的 FBS，应采用已被证实能有效去除血清中囊泡的方法，以避免牛血清来源的 EV 污染26。 - 从培养瓶中收集培养基。在 300 × g 条件下离心 10 分钟，使细胞沉淀。小心收集细胞条件培养基（CCM），避免扰动细胞沉淀。建议直接使用 CCM，或在 4 °C 下短期保存过夜。
注意：始终优先使用新鲜制备的 CCM。若无法避免较长时间的储存，应按照 MISEV2018 指南26记录所有相关参数，并需考虑由此可能带来的结果偏差。 - 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）示例实验方案
- 在含有 FBS 及其他补充成分的 EGM-2 培养基中培养 HUVEC 细胞 120 小时。
- 在不含任何额外补充物的 EBM-2 基础培养基中培养 HUVEC 细胞 48 小时。
- 从培养瓶中收集培养基，并按上述步骤（1.3）进行离心处理。通常，每次 EV 分离使用 100 mL 培养基。
2. 条件培养基的超速离心
- 在超速离心（UC）前立即进行操作，将细胞条件培养基（CCM）在 3,000 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟，以去除细胞碎片和大的聚集体。
- 小心地将上清液转移至超速离心管中。若使用固定角转子，请标记离心管在离心机中的方向，以便于超速离心后回收细胞外囊泡（EV）沉淀。在 k 值为 259.4 的条件下，以 120,000 × g 离心 2 小时。
- 超速离心后，使用移液管小心弃去上清液，避免扰动沉淀的 EV。
注意：沉淀可能不可见。 - 向第一支管中加入 200 µL 经 0.2 µm 滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS），利用 PBS 及残留的上清液通过反复吹打重悬沉淀。将所得的 EV 悬液转移至同一样本的下一支管中，并用于继续重悬。依此方式操作，最终将所有 EV 重悬于约 300–350 µL 的总体积中。
- 重悬后，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）确认颗粒的存在。使用针对特定类型 EV 优化的仪器参数设置，例如以下设置（步骤 2.5.1）。
注意：Gardiner 等人27 和 Vestad 等人28 的论文提供了有关如何优化 EV 检测参数的宝贵信息。- 为重现下述结果，应使用配备绿色激光的仪器（如 NanoSight LM14）。以 1.0 的屏幕增益和 13 的相机水平采集三段各 30 秒的视频。分析时使用 1.0 的屏幕增益和 5 的检测阈值。
- 尽量立即使用沉淀；否则，可在 4 °C 下短期保存过夜。
3. 将葡萄糖醛酸酶封装入细胞外囊泡（EVs）
- 向重悬的沉淀中加入β-葡萄糖醛酸酶（PBS中10 mg/mL），使其终浓度为1.5 mg/mL，并加入皂苷（H2O中10 mg/mL），使其终浓度为0.1 mg/mL。涡旋振荡3秒，充分混匀。
- 室温孵育10分钟，期间轻轻弹动离心管以间歇混匀。孵育结束后，直接通过尺寸排阻色谱法（SEC）进行纯化（见第5节）。
注意：β-葡萄糖醛酸酶样品解冻后请勿再次冷冻，以防止因冻融导致酶降解。
4. 脂质体的制备
- 为制备用于与细胞外囊泡（EVs）进行比较的脂质体，将1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DMPC）和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）以2:3的摩尔比溶解于氯仿中，终浓度为5 mM。将1 mL等分试样分装至高效液相色谱（HPLC）小瓶中，室温下过夜干燥，形成脂质膜。
注意：氯仿具有毒性，且可能具有致癌性。操作时应采取适当防护措施。 - 用1 mL含1.5 mg/mL葡萄糖醛酸酶的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬脂质膜。加热至42 °C，并涡旋1分钟。将挤出装置预热至42 °C，将脂质悬浮液通过200 nm聚碳酸酯膜挤出11次。随后直接通过尺寸排阻色谱法（SEC）进行纯化（见第5节）。
5. 通过SEC进行纯化
- 按照以下方案准备尺寸排阻色谱（SEC）柱。
- 仅使用新鲜纯化的水和新配制的缓冲液。所有缓冲液均需通过0.2 µm膜滤器过滤并进行脱气处理，以防止色谱柱中产生气泡。
- 准备SEC柱时，使用基于琼脂糖凝胶过滤的基质（例如Sepharose Cl-2b），或其他适用于将细胞外囊泡（EVs）和脂质体与蛋白质杂质及过量酶分离的SEC介质。首先去除介质储存所用的20%乙醇（EtOH）溶液，以防止色谱柱中形成气泡。具体操作为：将SEC介质在3,000 x g 条件下离心10分钟，弃去乙醇，并用脱气水替代。
- 将玻璃柱（内径10 mm）装填SEC介质至15 mL刻度线处。
注意：不同尺寸的色谱柱所需体积不同。确保凝胶完全沉降。 - 每次运行前，用至少两个柱体积的磷酸盐缓冲液（PBS）平衡色谱柱。储存色谱柱时，先用一个柱体积的水冲洗，再用至少两个柱体积的20%乙醇冲洗。再次使用时，先用一个柱体积的水冲洗色谱柱，再用PBS进行平衡。
- 每次分离最多上样400 µL的EV或脂质体悬液。收集每份1 mL的洗脱组分。SEC分离后，可选择储存纯化的EVs（见第7节）或进行葡萄糖醛酸酶活性检测（见第6节）。
- 确认EVs和脂质体已与污染性蛋白质及游离葡萄糖醛酸酶实现有效分离。为此，需将各收集组分中的颗粒浓度与蛋白质浓度及葡萄糖醛酸酶活性进行相关性分析。
- 采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定颗粒浓度（见2.5节）
- 采用二辛可宁酸（BCA）法或其他合适的蛋白质定量方法测定蛋白质含量。按照试剂盒制造商提供的操作说明进行检测。
- 通过葡萄糖醛酸酶活性检测法测定葡萄糖醛酸酶活性（见第6节）。
- 可选地，通过透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）评估EV的形态。
- 制备TEM样品时，将10 µL EV悬液滴加至TEM载网，孵育10分钟，然后用滤纸吸去多余液体。加入10 µL 4%多聚甲醛固定10分钟，吸去多余固定液。用水洗涤3次。加入30 µL 1%磷钨酸水合物染色20秒。吸去多余染液后，室温干燥过夜。通过TEM观察。
注意：磷钨酸具有强腐蚀性，操作时应保护皮肤和眼睛。 - 对于SEM观察，将已制备的TEM样品固定在碳导电盘上，并溅射镀上50 nm厚的金层。通过SEM观察。
- 制备TEM样品时，将10 µL EV悬液滴加至TEM载网，孵育10分钟，然后用滤纸吸去多余液体。加入10 µL 4%多聚甲醛固定10分钟，吸去多余固定液。用水洗涤3次。加入30 µL 1%磷钨酸水合物染色20秒。吸去多余染液后，室温干燥过夜。通过TEM观察。
6. 葡萄糖醛酸酶活性测定
- 为了通过关联颗粒数量和酶活性来比较不同样本及储存条件，首先使用NTA测量样本的颗粒浓度（参见步骤2.5）。
- 通过将1 µL该化合物（10 mg/mL溶于H2O中）加入199 µL PBS中，配制荧光素二-β-D-葡萄糖苷酸工作液。取25 µL该溶液加入125 µL纯化的EVs中，使终浓度为8.3 µg/mL。将样品移入黑色96孔板中。使用酶标仪测量0 h时间点，激发波长为480 nm，发射波长为516 nm。
- 用密封膜（例如用于PCR板的透明塑料膜）紧密封盖，以减少蒸发，并在37 °C避光孵育18 h。使用步骤6.2中列出的酶标仪参数测量荧光素的生成量。
7. EVs 和脂质体的储存
注意：出于所有储存目的，建议使用低吸附管，以减少因吸附造成的细胞外囊泡（EV）损失。
- 按照本节中的参数操作，以重现下述代表性实验结果。使用含有400 µL细胞外囊泡（EV）悬液的样品。
- 将样品储存于4 °C或-80 °C，或直接进行下述步骤。
- 对EV进行冻干处理。
- 向纯化的EV中加入海藻糖（溶于H2O，终浓度为4 mg/mL）。将样品在-80 °C下冷冻至少1小时。
- 使用以下参数进行冻干：主干燥阶段，设定搁板温度为15 °C，压力为0.180 mbar，干燥时间为46小时；最终干燥阶段，设定搁板温度为25 °C，压力为0.0035 mbar，干燥时间为2小时。将冻干后的样品储存于4 °C。
- 复水时，加入与初始EV悬液体积相等的H2O（通常为400 µL）。复水过程不得使用任何缓冲液。
8. 储存后的分析
- 为评估酶活性，首先需去除在储存过程中可能从细胞外囊泡（EVs）泄漏的游离葡萄糖醛酸酶。可通过额外的纯化步骤实现，该步骤可采用尺寸排阻色谱法（SEC）（见步骤5）或不对称流场流分离法（AF4）（见步骤8.1.2）。
注意：请注意，这两种方法均会导致EV样本稀释；因此，在储存前应使用足够浓度的EV，以避免低于NTA的定量检测限。由于SEC或AF4操作，预计颗粒将被稀释10倍。- 对于SEC纯化，遵循上述方案（见第5节）。
- 进行场流分离纯化。
- 使用带有350 µm间隔片和30 kD截留分子量的纤维素膜的小通道装配仪器。在HPLC泵与AF4通道之间放置孔径为0.1 µm的滤膜。采用新鲜制备的经0.1 µm滤膜过滤的PBS作为流动相，以降低光散射检测器中的颗粒负荷和噪声。
- 使用设定为280 nm的紫外检测器检测蛋白质。为检测颗粒，采用激光设定为658 nm的多角度光散射法。
- 采用以下运行方法：以1 mL/min的聚焦流速预聚焦1分钟；然后以0.2 mL/min的流速注入300 µL样品，并维持聚焦流速10分钟。注射完成后，在8分钟内将横向流速从2 mL/min逐步降低至0.1 mL/min，同时以1 mL/min的流速洗脱样品。随后在无横向流条件下继续洗脱10分钟。从12.5分钟开始收集洗脱组分，每管1 mL，持续收集至27分钟。
- 按照上述方法进行葡糖苷酸酶检测（见第6节）。
- 为评估颗粒大小和浓度，按照上述方法使用纳米颗粒追踪分析仪（NTA）（见步骤2.5）。
- 可选地，在储存后通过透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）评估细胞外囊泡（EVs）的形态（参见5.3）。
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结果
图1展示了从人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离的细胞外囊泡（EVs）的储存特性。采用超速离心法（UC）分离EVs并封装葡萄糖醛酸酶，经尺寸排阻色谱（SEC）纯化后，利用纳米颗粒追踪分析（NTA）评估EVs的理化性质。随后对部分囊泡进行场流分离（AF4）纯化，并测定葡萄糖醛酸酶的活性。
随后将囊泡在4 °C或-80 °C下储存7天，或以冻干形式在4 °C下储存，后者需添加4%海藻糖。储存后，再次通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量囊泡，并在场流分离（AF4）后评估每个颗粒残留的葡萄糖醛酸酶活性。
场流分离（AF4）的工作原理基于层流与通过AF4通道底部多孔膜的垂直交叉流相结合，根据颗粒的大小对其进行差异化分离（图2）。较大的颗粒倾向于靠近膜的位置，而较小的颗粒则位于通道更上方。由于层流具有抛物线流速分布，距离膜更远的颗粒向检测器移动的速度更快，从而实现按颗粒大小进行分离。在典型的AF4实验中，首先通过施加交叉流而不施加通道内的纵向流，将...
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讨论
在本研究中，我们提出了一种全面的实验方案，用于评估不同储存条件下细胞外囊泡（EVs）的稳定性。该方案结合了包封的葡萄糖醛酸酶作为功能性读数，并对EVs的理化参数进行评估，从而能够简便地评价EVs的储存稳定性，并比较来自不同细胞系的EVs。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）作为互补方法，可提供在单颗粒水平上EVs变化的直观信息。本文结果显示，未经冷冻保护剂处理而进行冻干的EVs和脂质体倾向于发生聚集（图6），但这一现象仅在SEM实验中观察到。尽管未对添加海藻糖保存的样品进行电镜成像，但已有文献表明，该冷冻保护剂可能确实能够减少EVs的聚集29。此外，该方案还可用于评估特定储存条件是否对EVs的粒径、回收率以及包封分子产生差异性影响。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）来源EVs的结果即为此类效应的例证（图1）。虽然在4 °C和-80 °C储存条件下的颗粒回收率优于冻干样品，但活性包封葡萄糖醛酸酶的回收率在冻干样品中最高。例如，在分析EV生物标志物时，若研究重点在于获取和保存完整的内含物而非完整囊泡，则EVs的冻干可能是更有利的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了德国联邦教育与研究部的NanoMatFutur青年研究项目（资助编号：13XP5029A）的支持。Maximilian Richter 获得了德国学术奖学金基金会（Studienstiftung des Deutschen Volkes）提供的博士奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC） | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC） | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² 细胞培养瓶 | Corning | 431082 | 与25 ml培养基一起使用 |
| 30 kDa再生纤维素膜 | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm 间隔片 | Wyatt Technology Europe | ||
| 自动馏分收集器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| β-葡萄糖醛酸酶 | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| 氯仿 | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| 柱温箱 | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-海藻糖二水合物 | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II 多角度光散射检测器 | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore 膜滤器，PVDF， 0.1 µm，47 mm | Merck | VVLP04700 | 用于AF4缓冲液的制备 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | 内皮细胞生长基础培养基，用于HUVEC细胞的无血清培养 |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | 内皮细胞生长培养基，用于HUVEC细胞的常规培养 |
| ELISA板封板膜 | R&D Systems | DY992 | 用于葡萄糖醛酸酶检测中96孔板的密封 |
| 乙醇 | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| 带支架/加热块的挤出器套装 | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| 滤膜支撑架 | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | 用于脂质体的制备 |
| 荧光素二-β-D-葡萄糖醛酸苷 | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS片剂+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | 用于在300 g下沉淀细胞 | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | 用于在3000 g下沉淀较大碎片 | |
| HUVEC细胞 | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1×30 cm | Kimble | 420401-1030 | |
| 冷冻干燥仪 ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| 微量离心管，聚丙烯材质 | VWR international | 525-0255 | 用于所有细胞外囊泡（EV）操作的离心管，经发现其在颗粒回收方面优于其他供应商的同类产品 |
| 配备绿色激光的Nanosight LM14 | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight 软件版本 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm 蚀刻型聚碳酸酯膜 | Whatman/GE Healthcare | 110406 | 用于脂质体的制备 |
| PEEK在线滤器支架 | Wyatt Technology Europe | ||
| 磷钨酸水合物 | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| 超速离心用聚碳酸酯瓶 | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| 扫描电子显微镜 Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| 带碳膜的SEM铜网 | Plano | S160-4 | |
| 小型AF4通道 | Wyatt Technology Europe | ||
| 溅射镀膜仪 Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| 透射电子显微镜 JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti 超速离心转子 | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex 自动进样器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex 等度泵 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex 在线真空脱气装置 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 超速离心机 OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| 紫外检测器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm 孔径混合纤维素滤膜 | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | 用于所有EV和SEC所用缓冲液的过滤 |
参考文献
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