本文介绍了一种易于应用的方案，用于评估细胞外囊泡储存稳定性的方法。细胞外囊泡是一类由细胞产生的天然纳米颗粒。本实验以葡萄糖醛酸酶作为模型酶，将其装载入囊泡中，并在不同条件下进行储存。储存后，评估囊泡的理化参数及其包封酶的活性。
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本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是当前研究中极具前景的靶点，可被用作药物、药物载体以及生物标志物。在推进其临床应用的过程中，不仅需要关注其药理活性，还必须评估其生产过程。在这一背景下，研究主要聚焦于EVs的分离、表征及其储存。本文旨在提供一种简便的方法，用于评估不同储存条件对EVs的影响，且无需进行基因操作或特定的功能检测。该方法可快速获得EVs在特定储存条件下稳定性的初步结果，并便于比较来源于不同细胞来源的EVs。稳定性评估基于EVs的理化参数（包括粒径、颗粒浓度和形态）及其所载内容物活性的保持情况。后者通过皂苷介导将β-葡萄糖醛酸酶封装入EVs中进行测定。葡萄糖醛酸酶作为替代指标，可通过裂解荧光报告分子实现简便的定量检测。本实验方案可为研究人员筛选能够最大程度维持EVs特性的储存条件提供有力工具，从而推动EVs研究向临床应用迈进。
引言
细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞类型产生的膜包被纳米颗粒。对于哺乳动物细胞而言，EVs可根据其不同的生成途径分为两大类1,2膜泡的大小范围约为100–1,000 nm，由细胞膜直接出芽产生。外泌体大小为30–200 nm，来源于多泡体，后者通过向内出芽形成于内体中，随后多泡体与细胞膜融合，一次性释放多个外泌体。这些囊泡的主要功能是介导细胞间的信息传递3为此，RNA、DNA和蛋白质等货物被主动分选进入细胞外囊泡（EVs）。EVs可对其靶细胞产生多种效应，与健康和疾病状态均密切相关。一方面，EVs介导组织再生、抗原呈递或抗生素样作用等有益效应，使其成为极具前景的治疗开发靶点4,5另一方面，EVs 可促进肿瘤血管化6，诱导应激反应中的旁观者效应7，并可能在自身免疫性疾病中发挥作用8 和炎症性疾病9因此，它们可能是深入理解多种病理效应的关键组分。然而，在癌症等多种疾病中均存在结构或功能异常的细胞外囊泡（EVs）10
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方案
1. 细胞培养及细胞条件培养基的制备
- 通常，根据各自细胞系所需的具体条件培养细胞。
- 在无血清条件下或在含有无细胞外囊泡（EV）的胎牛血清（FBS）的培养基中培养细胞 24–72 小时。
注意：若使用无 EV 的 FBS，应采用已被证实能有效去除血清中囊泡的方法，以避免牛血清来源的 EV 污染26。 - 从培养瓶中收集培养基。在 300 × g 条件下离心 10 分钟，使细胞沉淀。小心收集细胞条件培养基（CCM），避免扰动细胞沉淀。建议直接使用 CCM，或在 4 °C 下短期保存过夜。
注意：始终优先使用新鲜制备的 CCM。若无法避免较长时间的储存，应按照 MISEV2018 指南26记录所有相关参数，并需考虑由此可能带来的结果偏差。 - 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）示例实验方案
- 在含有 FBS 及其他补充成分的 EGM-2 培养基中培养 HUVEC 细胞 120 小时。
- 在不含任何额外补充物的 EBM-2 基础培养基中培养 HUVEC 细胞 48 小时。
- 从培养瓶中收集培养基，并按上述步骤（1.3）进行离心处理。通常，每次 EV 分离使用 100 mL 培养基。
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结果
图1展示了从人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离的细胞外囊泡（EVs）的储存特性。采用超速离心法（UC）分离EVs并封装葡萄糖醛酸酶，经尺寸排阻色谱（SEC）纯化后，利用纳米颗粒追踪分析（NTA）评估EVs的理化性质。随后对部分囊泡进行场流分离（AF4）纯化，并测定葡萄糖醛酸酶的活性。
随后将囊泡在4 °C或-80 °C下储存7天，或以冻干形式在4 °C下储存，后者需添加4%海藻糖。储存后，再次通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量囊泡，并在场流分离（AF4）后评估每个颗粒残留的葡萄糖醛酸酶活性。
场流分离（AF4）的工作原理基于层流与通过AF4通道底部多孔膜的垂直交叉流相结合，根据颗粒的大小对其进行差异化分离（图2）。较大的颗粒倾向于靠近膜的位置，而较小的颗粒则位于通道更上方。由于层流具有抛物线流速分布，距离膜更远的颗粒向检测器移动的速度更快，从而实现按颗粒大小进行分离。在典型的AF4实验中，首先通过施加交叉流而不施加通道内的纵向流，将.......
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讨论
在本研究中，我们提出了一种全面的实验方案，用于评估不同储存条件下细胞外囊泡（EVs）的稳定性。该方案结合了包封的葡萄糖醛酸酶作为功能性读数，并对EVs的理化参数进行评估，从而能够简便地评价EVs的储存稳定性，并比较来自不同细胞系的EVs。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）作为互补方法，可提供在单颗粒水平上EVs变化的直观信息。本文结果显示，未经冷冻保护剂处理而进行冻干的EVs和脂质体倾向于发生聚集（图6），但这一现象仅在SEM实验中观察到。尽管未对添加海藻糖保存的样品进行电镜成像，但已有文献表明，该冷冻保护剂可能确实能够减少EVs的聚集29。此外，该方案还可用于评估特定储存条件是否对EVs的粒径、回收率以及包封分子产生差异性影响。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）来源EVs的结果即为此类效应的例证（图1）。虽然在4 °C和-80 °C储存条件下的颗粒回收率优于冻干样品，但活性包封葡萄糖醛酸酶的回收率在冻干样品中最高。例如，在分析EV生物标志物时，若研究重点在于获取和保存完整的内含物而非完整囊泡，则EVs的冻干可能是更有利的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了德国联邦教育与研究部的NanoMatFutur青年研究项目（资助编号：13XP5029A）的支持。Maximilian Richter 获得了德国学术奖学金基金会（Studienstiftung des Deutschen Volkes）提供的博士奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC） | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC） | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² 细胞培养瓶 | Corning | 431082 | 与25 ml培养基一起使用 |
| 30 kDa再生纤维素膜 | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm 间隔片 | Wyatt Technology Europe | ||
| 自动馏分收集器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| β-葡萄糖醛酸酶 | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| 氯仿 | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| 柱温箱 | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-海藻糖二水合物 | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II 多角度光散射检测器 | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore 膜滤器，PVDF， 0.1 µm，47 mm | Merck | VVLP04700 | 用于AF4缓冲液的制备 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | 内皮细胞生长基础培养基，用于HUVEC细胞的无血清培养 |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | 内皮细胞生长培养基，用于HUVEC细胞的常规培养 |
| ELISA板封板膜 | R&D Systems | DY992 | 用于葡萄糖醛酸酶检测中96孔板的密封 |
| 乙醇 | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| 带支架/加热块的挤出器套装 | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| 滤膜支撑架 | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | 用于脂质体的制备 |
| 荧光素二-β-D-葡萄糖醛酸苷 | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS片剂+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | 用于在300 g下沉淀细胞 | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | 用于在3000 g下沉淀较大碎片 | |
| HUVEC细胞 | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1×30 cm | Kimble | 420401-1030 | |
| 冷冻干燥仪 ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| 微量离心管，聚丙烯材质 | VWR international | 525-0255 | 用于所有细胞外囊泡（EV）操作的离心管，经发现其在颗粒回收方面优于其他供应商的同类产品 |
| 配备绿色激光的Nanosight LM14 | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight 软件版本 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm 蚀刻型聚碳酸酯膜 | Whatman/GE Healthcare | 110406 | 用于脂质体的制备 |
| PEEK在线滤器支架 | Wyatt Technology Europe | ||
| 磷钨酸水合物 | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| 超速离心用聚碳酸酯瓶 | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| 扫描电子显微镜 Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| 带碳膜的SEM铜网 | Plano | S160-4 | |
| 小型AF4通道 | Wyatt Technology Europe | ||
| 溅射镀膜仪 Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| 透射电子显微镜 JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti 超速离心转子 | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex 自动进样器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex 等度泵 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex 在线真空脱气装置 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 超速离心机 OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| 紫外检测器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm 孔径混合纤维素滤膜 | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | 用于所有EV和SEC所用缓冲液的过滤 |
参考文献
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug t....
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