神经递质改变是脑震荡后发生的神经功能障碍机制，并可能导致有时灾难性的长期后果。该大鼠模型结合了可实现活体神经递质定量的微透析技术，以及通过对头颈部施加快速加速和减速的落重技术，后者是人类颅脑创伤的重要因素。
本文内容
摘要
摘要
持续的认知与运动症状是脑震荡/轻度创伤性脑损伤（mTBIs）的已知后果，部分可归因于神经递质传递的改变。事实上，啮齿类动物的脑部微透析研究表明，创伤后最初10分钟内海马区细胞外谷氨酸会大量释放。微透析技术具有明显优势，可在不牺牲动物的情况下实现体内神经递质的连续取样。除上述技术外，还需一种能够引起头部和躯干快速加速与减速的闭合性头部损伤模型，因为这一因素在许多其他动物模型中均不具备。韦恩州立大学的落锤模型模拟了人类颅脑创伤的关键特征，可通过下落重物对未束缚的啮齿类动物头部施加冲击。我们提出的一种新颖且具有转化价值的大鼠模型，将脑部微透析技术与韦恩州立大学落锤模型相结合，用于研究轻度麻醉且未束缚的成年大鼠在脑震荡后细胞外神经递质水平的急性变化。在本方案中，微透析探针被插入海马区作为目标区域，并在冲击发生时保留在脑内。海马区富含神经末梢和受体，是记录脑震荡后神经递质传递改变的相关脑区。当该模型应用于成年Sprague-Dawley大鼠时，在最初10分钟内可诱导海马区细胞外谷氨酸浓度升高，这与先前报道的脑震荡后症状一致。这种联合落锤模型为研究人员提供了一种可靠的工具，可用于研究脑震荡的早期治疗反应以及重复性脑损伤，因为本方案可诱导闭合性轻度创伤。
引言
本方法旨在为研究人员提供一种可靠的工具，能够真实再现人类颅脑创伤的生物力学特征，同时允许对脑震荡/轻度创伤性脑损伤（mTBIs）的分子效应进行纵向表征。该方法结合脑部微透析技术与韦恩州立大学落锤模型，用于记录在轻度麻醉且未束缚的成年大鼠中，脑震荡后细胞外神经递质水平的急性变化。通过这种微创方法，可在创伤后体内快速、连续地定量分析谷氨酸、GABA、牛磺酸、甘氨酸和丝氨酸等神经递质，而无需牺牲实验动物。
脑震荡/轻度创伤性脑损伤（mTBI）是一种由外力机制引起的、影响大脑功能的病理生理紊乱。脑震荡/轻度创伤性脑损伤是创伤性脑损伤中最常见的类型，占所有病例的70%-90%1。大多数脑震荡后的急性功能障碍可归因于原发性和继发性脑损伤2,3：（1）原发性脑损伤由头颈部快速加速和减速引起，导致脑组织受压，并在反冲过程中造成轴突拉伸和剪切损伤4,5,6；（2）继发性脑损伤则是对创伤产生的间接细胞反应，发生在原发性脑损伤后的数小时至数天内，在随时间推移出现的运动和认知功能障碍中起重要作用。许多症状可归因于神经递质传递的改变，例如先前已证实的损伤后最初10分钟内细胞外谷氨酸大量释放7,8,9。由于海马区具有高密度的神经末梢和受体，该脑区在损伤后特别容易受到这种兴奋性毒性反应的影响。鉴于其在认知功能中的重要作用10,11，动物研究表明，与脑震荡相关的海马损伤可导致恐惧条件反射和空间记忆学习能力受损12,13。本方法的主要目标是建立一种脑震荡/轻度创伤性脑损伤的大鼠模型，采用韦恩州立大学闭合性头部撞击（weight-drop）方法，真实再现原发性脑损伤的机制，并结合脑部微透析技术，在活体条件下研究脑震荡后继发性脑损伤所引起的急性细胞外神经递质变化。通过检测海马区细胞外谷氨酸和GABA的浓度，作为本方法的代表性结果。
既往的啮齿类动物研究已将微透析与其他损伤模型（如开颅重物坠落法和可控皮层撞击法）相结合，以证明损伤后细胞外神经递质水平在不同严重程度下的急性变化14,15,16,17。然而，除了存在高度变异性外，诸如开颅重物坠落法和可控皮层撞击法等模型的转化价值还因生态效度固有的不足而受到限制，原因在于两个方面：（1）这些模型所诱发的损伤远比人类运动相关性脑震荡更为严重，涉及直接的脑组织负荷；（2）这些模型需要进行颅骨切除或开颅手术，且啮齿类动物的头部被完全固定于立体定位架中，限制了头颈部和躯干的快速加速与减速运动，因而难以真实再现脑震荡的生物力学特征。
微透析是一种微创方法，具有在创伤后连续、活体取样神经递质（如谷氨酸、GABA、牛磺酸、甘氨酸和丝氨酸）的显著优势，且无需处死动物。除了微透析本身的优势外，韦恩州立大学开发了一种闭合颅骨的落锤模型（与其它模型的开颅方式不同），可在轻度麻醉且未束缚的啮齿类动物头部施加冲击，从而诱导轻度创伤性脑损伤（mTBI），并实现头部和躯干的快速加速与减速18。如前所述，头部和躯干的加速与减速是人类运动相关脑震荡的核心生物力学特征，而以往的啮齿类动物mTBI模型未能充分模拟这一特征。落锤操作可快速完成，无需预先手术或头皮切口。在诱导脑震荡后，啮齿类动物几乎可自发恢复翻正反射，单次冲击后不会出现瘫痪、癫痫发作或呼吸困难。颅内出血和颅骨骨折罕见，仅报道存在轻微的运动协调功能障碍。该大鼠模型操作简便、成本低廉，有助于在脑震荡急性期定量检测神经递质的释放，且在冲击过程中无需移除微透析探针。
我们结合微透析与脑震荡的动物模型适用于希望纵向表征脑震荡分子效应的研究人员，并可广泛用于多种治疗学研究。事实上，尽管已有多年研究且临床需求迫切，目前仍无任何药物能够通过预防脑震荡长期后遗症的临床试验阶段19。这些研究失败的潜在原因之一，可能是所使用的动物模型未能真实再现人类脑震荡所经历的创伤性生物力学作用力。本研究所提出的方法符合人类脑震荡的定义，即原发性脑损伤由钝性冲击以及头颈部的快速加速与减速所引起2,3。
此外，我们的联合模型适用于研究重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）影响的研究人员，因为该模型的一个关键特征使其区别于其他脑震荡动物模型，即能够在同一个体上诱导出重复的轻度损伤18。在人类中，rmTBI与更严重的创伤后症状、更长的恢复时间以及随时间推移而加重的运动和认知功能障碍相关20,21。其他相关动物模型也已帮助人们更好地理解rmTBI的创伤后病理生理机制22,23,24,25,26,27。研究表明，啮齿类动物在间隔24小时接受至少5次mTBI后，脑部易损性增加。神经炎症随着mTBI次数的增加而加剧，并出现神经退行性变的标志物28。重复的mTBI会阻碍小胶质细胞从促炎状态向正常恢复状态的转变，导致兴奋性毒性活动持续存在并激活神经退行性机制29。利用本模型，可在1周时间内每天对大鼠施加1次冲击，共进行5次暴露。鉴于该动物模型的简便性，它有助于表征mTBI后立即发生的急性非特异性神经递质释放的累积效应。
该模型还可使动物每天轻松接受两次冲击，从而能够研究更为严重的情况，例如运动员在首次撞击后短时间内再次遭受创伤性撞击30。正如先前一项研究所示31，第二次头部撞击的时机可显著影响血管和轴突损伤程度。第二次撞击与第一次撞击间隔越短，造成的后果越严重。该模型适用于探究此种特定条件对细胞外神经递质释放的影响。
在本方法中，由于海马体在脑震荡研究中的相关性，被选为感兴趣区域，但微透析样本也可从其他感兴趣区域采集。然而，选择其他脑区时需考虑导管套管及其周围牙科水泥所占据的空间，这些结构在大鼠头部可能占用较大面积。此外，本方法中所述的微透析参数，如膜的分子量截留值和有效长度、采样时间间隔以及流速，均可根据所研究分子的类型进行调整。例如，高效采集脑震荡中涉及的促炎性细胞因子，需要使用孔径更大的透析膜。
方案
本项目的动物实验方案已获得蒙特利尔圣心医院动物护理委员会的批准，符合加拿大动物护理委员会的指导方针。
注意：研究方案的示意图见图1。
1. 动物准备
- 从标准实验动物供应商处订购 Sprague-Dawley 大鼠，要求在 43 至 50 日龄之间送达，体重介于 151 至 200 g 之间。
- 将所有大鼠单独饲养于 12:12 小时光照:黑暗循环环境中，温度保持在 24–26 °C，自由饮水和进食。
- 在开始实验方案前的 2 周内，每天对大鼠进行约 5 分钟的抓取操作，以促进其与研究人员接触时的适应。在实施脑震荡或假损伤时，大鼠年龄应约为 10 周龄，体重介于 295 至 351 g 之间。
2. 微透析导管套管植入手术
- 在无菌条件下进行手术。整个操作过程中佩戴无菌手套、头套和外科口罩。提前对所有材料和外科器械进行高压灭菌和消毒。使用70%乙醇溶液彻底清洁和消毒工作区域及立体定位仪。
- 通过腹腔注射氯胺酮（70 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的混合物对动物进行麻醉。通过脚趾夹捏反射测试评估麻醉深度。
- 使用电动剪刀去除动物头部的毛发。用2%异丙醇和2%葡萄糖酸氯己定溶液清洗剃净的头部（清洗三次）。麻醉期间涂抹润滑性眼膏以防止眼睛干涩。
- 覆盖手术区域，仅暴露动物头部。将大鼠头部固定于立体定位仪上，小心地将耳杆插入耳道，然后拧紧鼻夹。将一根26 G不锈钢导向套管固定在立体定位仪的持针器臂上。
- 在切口前10分钟，于头部皮下局部注射布比卡因（1.5 mg/kg）和利多卡因（1.5 mg/kg）的麻醉混合液。
- 在整个手术过程中，通过鼻罩以0.5 L/min的氧气流速输送2.5%的异氟烷以维持麻醉状态。
- 使用手术刀沿头皮正中线做3 cm长的切口。在切口周围安装4个夹子以充分暴露颅骨。
- 用手术刀用力刮除颅骨上的骨膜，直至前囟（Bregma）和后囟（Lambda）缝合线清晰可见。如有出血，用纱布或棉签施加牢固压力止血。
- 通过比较前囟和后囟缝合线的背腹向坐标，确认颅骨在立体定位仪上是否正确对齐。以前囟缝合线的前后向、内外向和背腹向坐标作为导向套管植入坐标的参考点。
- 以前囟缝合线坐标为参考，计算导向套管在海马区的植入坐标。
注意：以下坐标根据Paxinos和Watson的大鼠脑图谱确定（前后向：-0.60 cm；内外向：±0.58 cm；背腹向：-0.16 cm，图2A)32。 - 使用标记笔精确标记植入位置。
- 在导向套管目标位置钻一个直径0.5 mm的颅骨孔。在该点周围约5 mm处再钻3个孔，用于植入3颗固定螺钉，以便在涂抹牙科丙烯酸水泥后加固套管。
- 将套管插入海马区，并用牙科水泥固定。该套管将在7天后的微透析操作中用于将探针插入目标区域。注意避免在即将落重锤的位置周围溢出过多牙科水泥。
- 让水泥干燥2分钟，然后从套管上取下持针器臂。将一根可拆卸的不锈钢堵塞针插入套管内，以防止脑脊液渗漏和感染风险。
- 取下4个夹子，复位牵开的皮肤，并用4-0外科缝合线缝合。
- 将大鼠从仪器上取下，并皮下注射布伦诺啡以缓解疼痛（0.05 mg/kg，术后立即注射，随后连续2天每日一次）。将动物放回笼中，并在其下方放置加热垫直至苏醒，随后将其送回动物饲养设施，在密切监测下进行为期7天的恢复期。
3. 微透析实验步骤
- 进行微透析操作时，佩戴无菌手套、头套和外科口罩。在套管植入手术后第7天，使用异氟烷钠（2.5%）在0.5 L/min的氧气流速下麻醉大鼠。
- 从套管中取出内芯，缓慢插入灌流有人工脑脊液（ACSF）的微透析探针（26 mmol/L NaHCO₃3, 3 mmol/L NaH2PO4, 1.3 mmol/L MgCl2, 2.3 mmol/L CaCl2, 3.0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0.2 mmol/L L-抗坏血酸）通过套管注入海马或其他目标区域。
注意： 大鼠仅在移除堵头和插入微透析探针以及诱导脑震荡或假手术损伤时需要麻醉。此处使用的探针为实验室自制的 I 形探针，由并列熔接的石英进样管和出样管组成［内径（ID）： 50 μm] 封装在聚乙烯管（内径：0.58-0.38 mm）中。导管末端固定有一段再生中空纤维素膜［分子量截留值：13 kDa，外径（OD）： 216 μm；ID： 200 μm] 使用氰基丙烯酸酯粘合剂固定，并用环氧树脂密封尖端。活性膜长度为2.5 mm，适用于海马体的植入，但可根据目标脑区的深度进行调整。通过定制的螺纹不锈钢套管将大鼠体内留置的导管与探针连接并固定。 - 将探针组件固定在不锈钢弹簧上，该弹簧连接至一个液体旋转接头和平衡杠杆臂，并用铁架台和夹具将其悬挂在笼具上方，使动物能够在笼内自由活动。在微透析过程的整个持续期间，拴系的大鼠可自由获取水和食物。
- 使用微输注泵将灌流液输送至探针，并从熔融石英出口管路（死体积：0.79）收集透析液 μL).
- 至少在实验开始前 1 小时 30 分钟，将探针调节至其工作流速（1 μL/min使用移液器通过时间-体积测量法验证探针的流速是否稳定。
注意： 流速可根据所采样的神经递质及目标脑区的不同而有所增减。在脑震荡或假手术损伤诱导前、期间及之后均采集透析样本。采样间隔取决于目标脑区、待分析的神经递质、分析物在透析液中的浓度以及所用分析化学设备的灵敏度。本研究中针对海马区谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）采样的收集阶段如下：
1. 基线： 实验开始时，以10分钟为间隔采集透析样本，持续60分钟。
2. 脑震荡后或假手术损伤： 脑震荡或假手术损伤后，继续采集样本90分钟（共9个样本）。 - 将每个透析液样品收集到预先装有 1 μL 0.25 mol/L 高氯酸以防止分析物降解。将样品储存在 4 °C 用于后续分析。
- 在采集完最后一个透析样本后，通过鼻罩输送2.5%异氟烷（sodium isoflurane）对大鼠重新进行麻醉，流量为0.5 L/min 氧气流速
- 从套管中取出微透析探针，重新插入闭塞针，然后将大鼠送回动物饲养设施。
4. 脑震荡装置安装
- 在开始实验前，将一块实心黄铜加工成用于造成脑震荡的重物（直径19 mm），使其质量为450 g。在黄铜重物顶部安装一个金属环。在垂直聚氯乙烯（PVC）导管内距底端1.0 m处预先钻好孔。
- 用锋利的剃刀片在铝板上切出狭缝。带狭缝的铝板应能支撑大鼠的体重（295至351 g），同时在黄铜重物撞击头部后不妨碍其身体的加速下落。
- 将带狭缝的铝板紧密地固定在一个U形有机玻璃框架上（长38 cm × 宽27 cm × 深30 cm，图3A,B），该框架内含一个泡沫垫（长37 cm × 宽26 cm × 深12 cm）。
- 将有机玻璃框架置于聚氯乙烯导管（直径20 mm × 长1.5 m）下方。
- 使用铁架台将聚氯乙烯导管固定，使其底端位于带狭缝铝板上方3.5 cm处。
- 将尼龙飞钓线（承重能力9.1 kg，直径0.46 mm）穿过金属环，使重物底部悬挂在带狭缝铝板上方2.5 cm处，以防止大鼠受击后下落到泡沫垫时发生多次撞击。
- 将尼龙飞钓线固定在铁架台上。
- 用尼龙飞钓线将重物通过聚氯乙烯导管向上提起，然后通过将六角扳手插入1.0 m处的预钻孔中将其固定到位。
5. 脑震荡诱导
- 在完成透析样本采集的基线阶段后，通过面罩给予异氟烷（2.5% 异氟烷，氧气流速为 0.5 L/min）对大鼠进行轻度再麻醉，直至其对脚趾夹捏无反应（如第 3.1 节所述）。
- 将动物俯卧于带槽铝板上，使其头部位于黄铜重物的正下方路径中（图 3C,D）。持续使用面罩维持麻醉，以确保大鼠在重物撞击前不会移动或苏醒。
- 移开面罩并抽出六角扳手，重物将沿 PVC 管垂直下落并撞击大鼠头部。大鼠将经历快速的 180° 旋转，并仰卧着地（图 3E）。
- 将大鼠从泡沫垫上取出，并将其仰卧放置于笼中。
- 使用数字计时器测量翻正反射时间，作为恢复情况和损伤严重程度的指标。翻正反射时间是指从撞击开始至啮齿类动物苏醒并自主从仰卧位翻转为俯卧位或开始行走的总时间。注意记录任何死亡、骨折或出血的迹象。
注意：该操作可在同一受试动物的不同时间点重复进行，以建立重复性脑震荡模型。
6. 假手术诱导
- 在完成透析样本采集的基线阶段后，通过将输送七氟烷钠（2.5%）的鼻罩连接至0.5 L/min的氧气流，对大鼠进行轻度再麻醉，直至其对脚趾夹捏无反应（如第3.1节所述）。
- 将动物俯卧于带槽铝板上，使其头部位于黄铜重锤下落路径的正下方。持续使用鼻罩维持麻醉，确保大鼠不会移动或苏醒。
- 移除鼻罩，并在不拉动六角扳手的情况下将动物从铝板上取下。此时大鼠不会发生快速180°旋转。
- 将大鼠仰卧放置于其笼内。
- 使用数字计时器测量翻正时间，作为神经功能恢复的指标。
7. 高效液相色谱
- 通过柱前衍生化结合高效液相色谱快速分离荧光检测法测定神经递质水平（即谷氨酸和γ-氨基丁酸），所用系统包括快速分离自动进样器和泵，与3.0 x 50 毫米 5 μm 分析柱
- 配制含有100 mmol/L磷酸氢二钠（Na2人类表型本体4），3.5% 乙腈和 20% 甲醇。根据需要使用 85% 磷酸调节 pH 至 6.7。
- 将流速设定为0.5 mL/min。
- 每日新鲜配制衍生化试剂和工作标准品（100 ng/mL），由储备液配制而成。将它们装入冷藏的（10 °C快速分离自动进样器及样品
- 将每一份样品依次加入分析柱，每次加入20 μL 3-巯基丙酸（0.071 mol/L) 用 H 稀释2O 和 20 μL 邻苯二甲醛（0.0143 mol/L) 用 0.1 稀释 mol/L 硼砂溶液。混合后静置反应 10 分钟。
- 为防止后续样品污染，每次进样后用甲醇（20%）冲洗进样环。
注意： 该方案中谷氨酸的保留时间约为1 min，每份样品的总运行时间为30 min。 - 在分析色谱峰时，根据已知标准品的保留时间匹配样品，以鉴定未知峰。将分析物的水平表示为 μg/mL.
8. 组织学
- 在微透析手术及脑震荡或假手术损伤诱导一个月后，通过腹腔注射氯胺酮（70 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物麻醉动物，并通过心脏灌注4%多聚甲醛和生理盐水实施安乐死。
- 将啮齿类动物断头后取出脑组织。
- 将脑组织保存在4%多聚甲醛中，随后置于30%蔗糖溶液中进行冷冻保护。
- 使用冷冻切片机将脑组织切成50 μm厚的冠状切片。
- 采用焦油紫（cresyl violet）对脑切片进行染色，以进行损伤情况和探针位置的组织学验证（尼氏染色）。
结果
通过结合力和旋转的脑震荡模型，并联合体内脑部微透析技术，本研究在21只雄性成年Sprague-Dawley大鼠中，通过在海马CA1区植入导向套管，探究了脑震荡或假手术损伤后谷氨酸和GABA在细胞外的急性动态变化。
探针定位与损伤的组织学验证
对经焦油紫染色的海马组织切片进行组织学验证后，未发现如大规模脑内出血或挫伤等形态学改变。导管套管植入和微透析探针插入在损伤组与假手术组之间引起的损伤均较轻微且相似。此外，在诱导假手术损伤或脑震荡前未立即取出探针，并未导致显微镜下可区分的海马组织损伤（分别见图2B、C），且探针膜在术后仍保持完整（图2D、E）。在微透析操作一个月后，经4%多聚甲醛灌注的脑震荡与假手术组脑组织，在肉眼观察下亦无明显差异（图2F、G）。
翻正反射时间
与假手术组相比，损伤组动物的平均翻正时间显著延长（Student’s t检验，p = 0.042801）（图4），且在恢复意识后表现出短暂的意识迟钝。在10例脑震荡组动物中，仅1只动物在重物坠落撞击部位下方出现轻微出血迹象。未观察到其他颅骨骨折或颅内出血的体征。
活体脑部微透析
为展示本方法的代表性结果，以1 μL/min的流速，每隔10分钟从活体海马组织中提取10 μL透析液样本，共采集15份。在基线期（60分钟）期间，从6个样本中测定细胞外谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的水平；在模拟损伤或脑震荡诱导后（90分钟）期间，从9个样本中测定上述物质的水平。
细胞外谷氨酸浓度
与假损伤组相比，在创伤诱导后的前10分钟内，海马CA1区的细胞外谷氨酸浓度显著升高（Mann-Whitney U检验，p = 0.009175）（图5）。在其他任何时间点，各组之间的谷氨酸浓度均未观察到其他差异。
细胞外GABA浓度
与假手术损伤相比，在创伤诱导后的前10分钟内，海马CA1区的GABA浓度未见显著变化（Mann-Whitney U检验，p = 0.943861）（图6）。在脑震荡病例与假手术损伤病例之间，其他任何时间点的GABA浓度均无显著差异。
图1：研究方案的示意图。 本图改编自 IO Masse 2018。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：探针定位与损伤的组织学验证。 （A）根据 Paxinos 和 Watson 的立体定位图谱，显示海马体中微透析探针及引导套管放置位置的冠状面视图。（B）假手术模型中由微透析探针和引导套管引起的海马组织损伤的代表性显微照片（焦油紫染色）。（C）脑震荡模型中由微透析探针和引导套管引起的海马组织损伤的代表性显微照片（焦油紫染色）。（D）脑震荡诱导前微透析探针的代表性显微照片。（E）脑震荡诱导后微透析探针的代表性显微照片，膜结构仍保持完整。（F–G）假手术（F）和脑震荡（G）损伤小鼠在假手术或脑震荡操作后1个月，经4%多聚甲醛灌注固定后的代表性脑组织显微照片。肉眼观察下，两个脑组织样本无法区分。本图经修改自 IO Masse 2018。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：脑震荡装置与微透析仪器关键组件示意图。（A）整个装置的照片，包括位于大鼠平台上方用于下落重物的垂直聚氯乙烯（PVC）导管、有机玻璃框架、泡沫垫、计算机控制的微注射泵、气密注射器、液体旋转接头，以及并排的熔融石英进样和出样管路。（B）有机玻璃框架与泡沫垫的示意图，标注了所有相关尺寸。（C）位于泡沫垫上方作为大鼠平台的带槽铝箔片的照片。（D）大鼠在下落重物撞击头部前即刻置于平台上的位置示意图。（E）大鼠头部受到撞击后的照片，显示撞击后大鼠身体发生180°水平旋转，体现了撞击引发的加速度与旋转运动。本图经 IO Masse 2018 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：翻正时间。 大鼠在脑震荡（红色菱形，n = 10）或假手术损伤（蓝色方块，n = 11）后从麻醉状态苏醒并从仰卧位翻转至俯卧位或开始行走所需时间的直方图表示。脑震荡组大鼠完成翻正所需时间显著长于假手术损伤组。每张图中的均值以水平线表示。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。该图改编自 IO Masse 2018。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：细胞外谷氨酸浓度。 通过微透析法测定的海马区细胞外谷氨酸平均浓度（μg/mL），记录于基线期（60 分钟）以及脑震荡后（红色菱形，n = 10）或假手术损伤后（蓝色方块，n = 11）条件下的 90 分钟内。误差线表示平均值的标准误。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。该图改编自 IO Masse 2018。 请点击此处查看此图的高清版本。
图6：细胞外GABA浓度。 通过微透析法测定海马区在基线期（60分钟）及脑震荡后（红宝石形，n = 10）或假手术损伤（蓝方形，n = 11）条件下（90分钟）的GABA平均细胞外浓度（μg/mL）。误差线表示均值的标准误。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。本图改编自IO Masse 2018。请单击此处查看此图的放大版本。
讨论
实验方案中的关键步骤
为了获得可靠的结果，本方案中的关键步骤需要特别注意。在套管植入手术过程中，应避免使用过多的粘固剂，尤其是当粘固剂过于稀薄时，以防其溢出至撞击部位。为防止堵塞植入位置，应使用与套管长度相同的闭塞针。在微透析操作过程中，需缓慢将探针插入套管，并确保其完全插入，以保证透析液的正常采集。在诱导脑震荡前，务必使用锋利的剃须刀片在铝箔上准确开槽；否则，黄铜重物的冲击力将不足以撕裂铝箔，导致大鼠胸部朝下而无法完成180°翻转并背部着地。若发生此种情况，所造成的损伤将主要源于钝性撞击，类似于开颅重物坠落模型，且损伤程度会显著加重。在诱导脑震荡过程中，应避免重物撞击到套管，否则会对大鼠颅骨造成严重损伤。建议以两人团队协作方式进行实验，以减少操作误差。
修改与故障排除
在微透析过程中，一旦探针连接至泵，流速应保持恒定，并产生与灌注速率相匹配的液体体积。若收集到的液体体积偏低，可能表明探针膜存在堵塞或管路中有气泡。若发生堵塞，应弃用并更换探针；而管路中的气泡则可通过循环人工脑脊液（ACSF）将其排出。若未发现堵塞或气泡但仍无液体流出，可剪去最靠近末端的少量流出管以恢复流动。
方法的局限性
其他采用韦恩州立大学落锤法的研究已评估了一些基本的结构和分子变化18。然而，更深入的研究将有助于进一步验证该方法的可靠性。有关表观遗传和细胞水平上发生的生物学与神经解剖学变化的信息，将进一步巩固本方法的可靠性和可转化价值。此外，认知功能的评估是啮齿类动物模型中与轻度创伤性脑损伤（mTBI）相关结局的可靠指标33。尽管本方案中测量了翻正时间，并发现损伤组相比假手术组显著延长，但未来的研究应集中于在啮齿类动物创伤诱导后系统地评估其认知功能。
该方法相对于现有/替代方法的重要性。
该方法的主要意义体现在两个方面：首先，它成功地利用韦恩州立大学（Wayne State University）的方法诱导出脑震荡，该方法可实现头部和躯干的快速加速与减速。采用此方法可避免出现严重损伤后果，如心肺骤停、颅骨骨折、高死亡率以及撞击部位明显的脑挫伤迹象。其次，该微透析技术成功重现了先前研究所证实的创伤后10分钟内发生的急性且短暂的细胞外谷氨酸释放14,16。此外，在整个实验过程中保持探针留置，显著降低了因反复插入微透析探针而对轻度创伤敏感的血脑屏障造成损伤的可能性34。
该方法的未来应用或发展方向。
鉴于韦恩州立大学落锤法操作简便，以及微透析技术可检测急性细胞外神经递质水平变化，将微透析与脑震荡模型相结合的大鼠模型为研究人员提供了一种可靠工具，能够真实再现人类颅脑创伤的生物力学特征，并对脑震荡的分子效应进行长期表征。该大鼠模型还可广泛应用于多种治疗学研究，因其提供了在活体中持续研究药物作用机制及疗效的宝贵机会，且无需处死动物。此外，此类大鼠模型的建立有望极大促进人们对神经递质失衡与脑震荡行为后果之间关系的深入理解。
披露
不存在竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Louis Chiocchio 在动物护理与维护方面的帮助，Morgane Regniez 在心脏灌注实验操作中的协助，以及 David Castonguay 在冷冻切片机使用方面的协助。本研究工作由蒙特利尔大学授予 LDB 的Caroline Durand 急性创伤学讲席基金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物准备 | |||
| Sprague Dawley 大鼠 | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| 微透析导管埋植手术 | |||
| 盐酸氯胺酮 (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| 盐酸赛拉嗪 (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| 2% 葡萄糖酸氯己定与 2% 异丙醇溶液 | Carefusion | 260100C | |
| 盐酸利多卡因 | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| 盐酸布比卡因 | Hospira | 1559 | |
| 眼用软膏 | Bausch and Lomb inc. | 2125706 | |
| 立体定位仪 | Stoelting | 51600 | |
| 立体定位导管夹持臂 | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| 钻孔机 | Dremel | 8050-N/18 | |
| Vicryl Rapide 4-0 涂层缝合线 | Ethicon | VR2297 | |
| 牙科丙烯酸骨水泥 | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| 螺钉 | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 异氟烷 | Baxter | CA2L9100 | |
| 20 号导管，10.55 mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
| 假导管，10.55 mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| 微透析操作 | |||
| CMA 402 注射泵 | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
| 2.5 ml 玻璃微量注射器 | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
| 适用于 1–2.5 ml 注射器的中型夹具 | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
| 低扭矩双通道石英衬里旋转接头 | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
| GSC 铸铁支撑环架 | Fisher Scientifique | S13748 | |
| Fisherbrand Castaloy 可调角度夹具 | Fisher Scientifique | 05769Q | |
| NaHCO3 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| MgCl2 氯化镁 | Sigma-Aldrich Canada | M8266-100G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| NaCl 氯化钠 | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich Canada | A5960-25G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| KCl 氯化钾 | Sigma-Aldrich Canada | P9333-500G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| NaH2PO4 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich Canada | S0751-1KG | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| CaCl2 氯化钙 | Sigma-Aldrich Canada | 383147-100G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| 打火机 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| 环氧胶 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| 超级胶水凝胶 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| 热缩管，内径 0.063"，Gardner Bender | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| Dremel #409 切割轮 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| BD 26 号针头，0.5 英寸 PrecisionGlide 无菌 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | 用于实验室自制探针 |
| BD 21 号针头，1.5 英寸 PrecisionGlide 无菌 305167 | Fisher Scientifique | 14-826-5B | 用于实验室自制探针 |
| 26G 不锈钢管，一英尺长 | HRS Scientific | SST-26/FT | 用于实验室自制探针 |
| 聚乙烯管 PE/20，外径 0.024"，内径 0.015" | HRS Scientific | C315CT | 用于实验室自制探针 |
| 聚乙烯管 PE/10，外径 0.024"，内径 0.011" | HRS Scientific | C314CT | 用于实验室自制探针 |
| 聚乙烯管 PE/50，外径 0.038"，内径 0.023" | HRS Scientific | C313CT | 用于实验室自制探针 |
| 30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ 长 | HRS Scientific | 008BSH/30S | 用于实验室自制探针 |
| Polymicro Technologies 柔性熔融石英毛细管，内径 50µm，外径 150µm | Molex LLC Polymicro Technologies | 106815-0015 | 用于实验室自制探针 |
| Spectra Por 132294 微透析中空纤维膜，13 kD MWCO | Spectrum Labs | FSSP9778671 | 用于实验室自制探针 |
| 不锈钢套环 | Sirnay In.c | 304 | 用于实验室自制探针 / 定制 |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| 脑震荡装置 | |||
| 黄铜重物 | Rapido Métal Inc. | 将金属环固定于底座 | |
| 金属环 | Rona Inc. | 多数五金店有售 | |
| PVC 导向管 | Rona Inc. | 多数五金店有售 | |
| 铝箔 | Alcan | 多数杂货店有售 | |
| 胶带 | 市售可得 | ||
| GSC 铸铁支撑环架 | Fisher Scientifique | S13748 | |
| U 形有机玻璃框架 | Présentoirs PlexiPlus Inc. | 定制 | |
| 泡沫垫 | Mousse D&R Foam Inc. | 定制 | |
| 剃须刀片 | VWR International | 55411-055 | |
| Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | 多数五金店有售 | |
| 异氟烷 | Baxter | CA2L9100 | |
| 秒表 | 多数体育用品零售商有售 | ||
| 动物准备 | |||
| Sprague Dawley 大鼠 | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| 微透析导管埋植手术 | |||
| 盐酸氯胺酮 (100 mg/ml) | Bioniche | 1989529 | |
| 盐酸赛拉嗪 (100 mg/ml) | Bimeda | 8XYL004C | |
| 2% 葡萄糖酸氯己定与 2% 异丙醇溶液 | Carefusion | 260100C | |
| 盐酸利多卡因 | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| 盐酸布比卡因 | Hospira | 1559 | |
| 眼用软膏 | Bausch and Lomb inc. | 2125706 | |
| 立体定位仪 | Stoelting | 51600 | |
| 立体定位导管夹持臂 | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| 钻孔机 | Dremel | 8050-N/18 | |
| Vicryl Rapide 4-0 涂层缝合线 | Ethicon | VR2297 | |
| 牙科丙烯酸骨水泥 | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| 螺钉 | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 异氟烷 | Baxter | CA2L9100 | |
| 20 号导管，10.55 mm | HRS Scientific | C311G/SPC | |
| 假导管，10.55 mm | HRS Scientific | C311DC/1/SPC | |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| 微透析操作 | |||
| CMA 402 注射泵 | Harvard Apparatus Canada | CMA-8003110 | |
| 2.5 ml 玻璃微量注射器 | Harvard Apparatus Canada | CMA-8309021 | |
| 适用于 1–2.5 ml 注射器的中型夹具 | Harvard Apparatus Canada | CMA-3408310 | |
| 低扭矩双通道石英衬里旋转接头 | Instech Laboratories Inc. | 375/D/22QM | |
| GSC 铸铁支撑环架 | Fisher Scientifique | S13748 | |
| Fisherbrand Castaloy 可调角度夹具 | Fisher Scientifique | 05769Q | |
| NaHCO3 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich Canada | S5761-500G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| MgCl2 氯化镁 | Sigma-Aldrich Canada | M8266-100G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| NaCl 氯化钠 | Sigma-Aldrich Canada | S7653-1KG | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich Canada | A5960-25G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| KCl 氯化钾 | Sigma-Aldrich Canada | P9333-500G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| NaH2PO4 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich Canada | S0751-1KG | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| CaCl2 氯化钙 | Sigma-Aldrich Canada | 383147-100G | 用于人工脑脊液 (aCSF) |
| 打火机 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| 环氧胶 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| 超级胶水凝胶 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| 热缩管，内径 0.063"，Gardner Bender | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| Dremel #409 切割轮 | Canadian Tire | 用于实验室自制探针 / 多数五金店有售 | |
| BD 26 号针头，0.5 英寸 PrecisionGlide 无菌 305111 | Fisher Scientifique | 14-826-15 | 用于实验室自制探针 |
| BD 21 号针头，1.5 英寸 PrecisionGlide 无菌 305167 | Fisher Scientifique | 14-826-5B | 用于实验室自制探针 |
| 26G 不锈钢管，一英尺长 | HRS Scientific | SST-26/FT | 用于实验室自制探针 |
| 聚乙烯管 PE/20，外径 0.024"，内径 0.015" | HRS Scientific | C315CT | 用于实验室自制探针 |
| 聚乙烯管 PE/10，外径 0.024"，内径 0.011" | HRS Scientific | C314CT | 用于实验室自制探针 |
| 聚乙烯管 PE/50，外径 0.038"，内径 0.023" | HRS Scientific | C313CT | 用于实验室自制探针 |
| 30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ 长 | HRS Scientific | 008BSH/30S | 用于实验室自制探针 |
| Polymicro Technologies 柔性熔融石英毛细管，内径 50µm，外径 150µm | Molex LLC Polymicro Technologies | 106815-0015 | 用于实验室自制探针 |
| Spectra Por 132294 微透析中空纤维膜，13 kD MWCO | Spectrum Labs | FSSP9778671 | 用于实验室自制探针 |
| 不锈钢套环 | Sirnay In.c | 304 | 用于实验室自制探针 / 定制 |
| 名称 | 公司 | 目录号 | 备注 |
| 脑震荡装置 | |||
| 黄铜重物 | Rapido Métal Inc. | 将金属环固定于底座 | |
| 金属环 | Rona Inc. | 多数五金店有售 | |
| PVC 导向管 | Rona Inc. | 多数五金店有售 | |
| 铝箔 | Alcan | 多数杂货店有售 | |
| 胶带 | 市售可得 | ||
| GSC 铸铁支撑环架 | Fisher Scientifique | S13748 | |
| U 形有机玻璃框架 | Présentoirs PlexiPlus Inc. | 定制 | |
| 泡沫垫 | Mousse D&R Foam Inc. | 定制 | |
| 剃须刀片 | VWR International | 55411-055 | |
| Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley | Canadian Tire | 多数五金店有售 | |
| 异氟烷 | Baxter | CA2L9100 | |
| 秒表 | 多数体育用品零售商有售 |
参考文献
- Cassidy, J. D., et al. Incidence, risk factors and prevention of mild traumatic brain injury: results of the WHO Collaborating Centre Task Force on Mild Traumatic Brain Injury. Journal of Rehabilitation Medecine. 43, 28-60 (2004).
- McCrory, P., et al. What is the definition of sports-related concussion: a systematic review. British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 877-887 (2017).
- McCrory, P., et al. 5th International Conference on Concussion in Sport (Berlin). British Journal of Sports Medecine. 51 (11), 837(2017).
- Cernak, I. Animal models of head trauma. NeuroRx. 2 (3), 410-422 (2005).
- Davis, A. E. Mechanisms of traumatic brain injury: biomechanical, structural and cellular considerations. Critical Care Nursing Quarterly. 23 (3), 1-13 (2000).
- Gaetz, M. The neurophysiology of brain injury. Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 115 (1), 4-18 (2004).
- Giza, C. C., Hovda, D. A. The new neurometabolic cascade of concussion. Neurosurgery. 75, Suppl 4. S24-S33 (2014).
- Guerriero, R. M., Giza, C. C., Rotenberg, A. Glutamate and GABA imbalance following traumatic brain injury. Current neurology and neuroscience reports. 15 (5), 27(2015).
- Meldrum, B. S. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology. Journal of Nutrition. 130 (4S Suppl), 1007S-1015S (2000).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Olton, D. S., Papas, B. C. Spatial memory and hippocampal function. Neuropsychologia. 17 (6), 669-682 (1979).
- Ray, S. K., Dixon, C. E., Banik, N. L. Molecular mechanisms in the pathogenesis of traumatic brain injury. Histology and histopathology. 17 (4), 1137-1152 (2002).
- Reger, M. L., et al. Concussive brain injury enhances fear learning and excitatory processes in the amygdala. Biological Psychiatry. 71 (4), 335-343 (2012).
- Faden, A. I., Demediuk, P., Panter, S. S., Vink, R. The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury. Science. 244 (4906), 798-800 (1989).
- Folkersma, H., et al. Increased cerebral (R)-[(11)C]PK11195 uptake and glutamate release in a rat model of traumatic brain injury: a longitudinal pilot study. Journal of neuroinflammation. 8, 67(2011).
- Katayama, Y., Becker, D. P., Tamura, T., Hovda, D. A. Massive increases in extracellular potassium and the indiscriminate release of glutamate following concussive brain injury. Journal of neurosurgery. 73 (6), 889-900 (1990).
- Nilsson, P., Hillered, L., Ponten, U., Ungerstedt, U. Changes in cortical extracellular levels of energy-related metabolites and amino acids following concussive brain injury in rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 10 (5), 631-637 (1990).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of neuroscience. 203 (1), 41-49 (2012).
- Dewitt, D. S., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C. E., Dash, P. K., Robertson, C. S. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (9), 688-701 (2013).
- Eisenberg, M. A., Andrea, J., Meehan, W., Mannix, R. Time interval between concussions and symptom duration. Pediatrics. 132 (1), 8-17 (2013).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. JAMA. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Frontiers in neurology. 5, 12(2014).
- Meehan, W. P. 3rd, Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental neuroscience. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Schwetye, K. E., et al. Traumatic brain injury reduces soluble extracellular amyloid-beta in mice: a methodologically novel combined microdialysis-controlled cortical impact study. Neurobiology of disease. 40 (3), 555-564 (2010).
- Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. Journal of neuropathology and experimental neurology. 70 (7), 551-567 (2011).
- Willie, J. T., et al. Controlled cortical impact traumatic brain injury acutely disrupts wakefulness and extracellular orexin dynamics as determined by intracerebral microdialysis in mice. Journal of neurotrauma. 29 (10), 1908-1921 (2012).
- Bolton, A. N., Saatman, K. E. Regional neurodegeneration and gliosis are amplified by mild traumatic brain injury repeated at 24-hour intervals. Journal of neuropathology and experimental neurology. 73 (10), 933-947 (2014).
- Blaylock, R. L., Maroon, J. Immunoexcitotoxicity as a central mechanism in chronic traumatic encephalopathy-A unifying hypothesis. Surgical neurology international. 2, 107(2011).
- McCrory, P., Davis, G., Makdissi, M. Second impact syndrome or cerebral swelling after sporting head injury. Current Sports Medecine Reports. 11 (1), 21-23 (2012).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29 (12), 2172-2180 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th edn, Academic Press. (1998).
- Bales, J. W., Wagner, A. K., Kline, A. E., Dixon, C. E. Persistent cognitive dysfunction after traumatic brain injury: A dopamine hypothesis. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 33 (7), 981-1003 (2009).
- Sumbria, R. K., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochemical Research. 36 (1), 109-116 (2011).
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