小鼠造血干细胞与祖细胞及MLL-AF9驱动型白血病中线粒体活性氧的流式细胞术分析

摘要

我们描述了一种利用多参数流式细胞术检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中白血病细胞线粒体活性氧（ROS）的方法。

摘要

我们介绍了一种通过流式细胞术分析来自健康小鼠以及由MLL-AF9驱动急性髓系白血病（AML）小鼠的多种活体骨髓（BM）来源干细胞和祖细胞群体中线粒体活性氧（ROS）的方法。具体而言，我们描述了一个两步细胞染色流程：首先使用一种可被荧光激活的染料对健康或白血病骨髓细胞进行染色，以检测线粒体超氧化物；随后使用偶联荧光染料的单克隆抗体进行染色，用于区分不同的健康与恶性造血祖细胞群体。我们还提供了通过流式细胞术获取和分析样本的策略。整个实验流程可在短短3–4小时内完成。我们同时强调了在利用荧光激活染料结合流式细胞术监测活体造血干细胞、白血病干细胞及其祖细胞亚群中线粒体区室ROS生成时需要考虑的关键变量，以及该方法的优势与局限性。此外，我们展示了不同健康造血干细胞/祖细胞（HSPC）亚群与白血病祖细胞之间线粒体ROS水平存在差异的数据，并讨论了该技术在血液学研究中的潜在应用价值。

引言

活性氧（ROS）是一类由分子氧衍生而来的高反应性分子。细胞内ROS生成最明确的位点是线粒体，在氧化磷酸化（OXPHOS）过程中，电子传递链（ETC）中的电子被分子氧吸收，从而形成一类特定的活性氧，称为超氧阴离子¹。通过一系列称为超氧化物歧化酶（SODs）的酶的作用，超氧阴离子被转化为过氧化氢，后者再由过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等酶进一步中和为水。ROS调控机制的紊乱可导致ROS过量产生，通常被称为氧化应激，会引起大分子损伤（如DNA、蛋白质和脂质）等有害甚至致命的细胞后果。此外，氧化应激与多种病理状态相关，包括糖尿病、炎症性疾病、衰老和肿瘤^2,3,4。为了维持氧化还原稳态并防止氧化应激，细胞具备多种ROS调控机制⁵。

某些活性氧（ROS）的生理水平对于正常的胚胎期和成体造血过程是必需的⁶。然而，过量的ROS与DNA损伤、细胞分化以及造血干细胞和祖细胞池的耗竭相关。也有证据表明，白血病细胞与健康细胞之间的氧化还原生物学变化可能存在差异。例如，与相应的正常细胞相比，急性髓系白血病（AML）细胞中的ROS水平通常较高；而其他研究则提示，白血病干细胞可维持较低的稳态ROS水平以利于其存活^7,8。重要的是，针对这些氧化还原差异的治疗策略已在多种人类癌症模型中展现出应用前景^9,10。因此，能够评估小鼠模型中ROS水平的检测方法，可能有助于加深我们对这些分子在细胞生理及疾病发生机制中作用的理解，并有望为评估新型靶向氧化还原的抗癌疗法的有效性提供平台。

方案

本方案中描述的所有动物实验程序均已获得福克斯蔡斯癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

注意： 本实验方案流程分为4个部分，如图1所示，所需试剂列于材料表中。

1. 骨髓（BM）的分离

注意：MLL-AF9 白血病小鼠的制备方法如前所述¹¹。

1. 按照先前所述方法^12,13,14,15，从小鼠中分离单核骨髓细胞，包括野生型 C57.Bl6 小鼠（表达 CD45.2 同源标记）以及移植了表达 MLL-AF9 的白血病细胞（CD45.2⁺）的 C57.Bl6-SJL 小鼠（表达 CD45.1 同源标记）。
   注意： 骨髓可通过碾碎骨骼^12,13或冲洗骨骼^14,15的方式从小鼠中获取。在本研究所展示的实验中，健康小鼠和白血病小鼠的骨髓均通过骨骼冲洗法获得。

2. 线粒体活性氧荧光染料染色

1. 从健康小鼠和/或白血病小鼠中分离出单核骨髓细胞后，取部分细胞用台盼蓝染色，并使用血细胞计数板计数，以确定起始的总骨髓细胞数量。
2. 将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 F-PBS（含 2% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素混合液的 PBS）中，调整细胞浓度至 2 × 10⁶ 个细胞/mL。
3. 将细胞悬液每管 200 µL 分装至 9 支单色对照管中，标记如下：
   未染色对照、B220-Cy5-PE、cKit-Cy7-APC、Sca1-PacBlue、CD150-APC（仅用于健康造血干细胞和祖细胞）、CD45.2-APC（仅用于白血病细胞）、CD34-FITC、线粒体 ROS 染料、活/死细胞染料。
   注意： （可选）可通过将 2 × 10⁵ 个细胞溶于 200 µL 中，并加入 20 µM 亚硫酸氢钠甲萘醌（MSB），在 37 ˚C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1 小时，制备线粒体 ROS 诱导的阳性对照。第二个对照用于逆转 MSB 介导的线粒体 ROS 诱导，可通过将 2 × 10⁵ 个细胞溶于 200 µL 中，并加入 20 µM MSB 和 100 µM N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），在 37 ˚C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1 小时来制备。
4. 将剩余细胞分装至一支试管（实验管）中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
5. 根据制造商说明书，将细胞重悬于含活/死细胞染料的 F-PBS 中，在冰上孵育 30 分钟。务必向单色对照管中也加入活/死细胞染料。
6. 向已染色活/死细胞染料的单色对照管和实验管中各加入 1.0 mL 室温（RT）F-PBS，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
7. 将 50 µg 线粒体 ROS 染料溶于 13 µL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 5 mM 储存液。
8. 将线粒体 ROS 染料用室温 F-PBS 稀释至终浓度为 5 µM，可选择性加入维拉帕米（Verapamil，50 µM）。
9. 吸除活/死细胞染料的洗涤液。向每支实验管以及线粒体 ROS 染料单色对照管中加入含维拉帕米的 200 µL 线粒体 ROS 染料染色液。
10. 涡旋混匀，于 37 ˚C 避光孵育 10 分钟。
11. 向已染色线粒体 ROS 的单色对照管和实验管中各加入 1.0 mL 室温 F-PBS，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
12. 吸除上清液，再用额外的 1.0 mL 室温 F-PBS 洗涤细胞一次，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。

3. 系列抗体染色

1. 配制 表 1 中列出的抗体混合液。
   注意： 这些抗体混合液此前已优化过^14,15,16。
2. 吸除含有健康骨髓样本的实验管中线粒体 ROS 染料的最后一次洗涤上清液，每管加入 200 µL 抗体混合液 #1，涡旋混匀。同时制备单色对照管。冰上避光孵育 60 分钟。
3. 吸除含有白血病骨髓样本的实验管中线粒体 ROS 染料的最后一次洗涤上清液，每管加入 200 µL 抗体混合液 #2，涡旋混匀。冰上避光孵育 60 分钟。
4. 用 1.0 mL 冷 F-PBS 洗涤，室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
5. 将细胞重悬于 500 µL 冷 F-PBS 中，并使用 40 µm 滤膜过滤至流式细胞仪检测管中，以去除聚集体。

4. 流式细胞术数据采集与分析

注意： 多种造血干细胞和祖细胞亚群较为稀有，例如长期造血干细胞。因此，在流式细胞术检测过程中，为充分分析各类造血干细胞和祖细胞亚群中的线粒体活性氧，每个实验管 ideally 应采集 300 万至 500 万个事件。

1. 使用未染色对照管，根据所分析细胞群体的大小和复杂性，设置前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）图。
2. 使用未染色对照管和单色对照管对流式细胞仪进行补偿调节。
3. 在前向散射和侧向散射图中圈选并排除无关碎片（图2A,B，从左起第一张图）。
4. 使用双判别器（如前向判别器）排除双联体（doublets）（图2A,B，从左起第二张图）。
5. 按照图2A、B中提出的设门策略，选择活细胞、谱系标记低表达（lineage low）细胞以及各类造血干细胞/祖细胞（HSPC）和白血病亚群。
6. 针对每个目标细胞群，通过直方图分析TRPE通道（x轴）的中位荧光强度（MFI），以评估线粒体活性氧（mitochondrial ROS）信号的差异（图3A-C，左侧面板）。通过在散点图中比较线粒体ROS染色与特异性谱系标记物，可在单细胞水平上评估线粒体ROS水平。

结果

本文介绍了一种用于分析多种健康细胞及表达MLL-AF9的白血病前体细胞中线粒体活性氧（ROS）的方法。图1展示了该实验流程的示意图，共包括四个主要步骤：1）从小鼠中分离骨髓细胞；2）使用一种可被线粒体ROS（特别是超氧阴离子）激活的荧光探针染色骨髓细胞；3）通过表面标志物抗体染色，区分不同的健康与白血病造血细胞群体；4）流式细胞术检测与数据分析。

图2A,B展示了在健康和白血病骨髓（BM）中分析各类造血干细胞和祖细胞群体的代表性设门策略。首先通过FSC/SSC图去除碎片，再利用FSC-面积（FSC-A）与FSC-高度（FSC-H）图排除双联体和聚集体。结合一组谱系表面标志物（表1和步骤3.1）排除多种成熟的造血细胞群体，如淋巴细胞、红细胞、粒细胞以及单核细胞/巨噬细胞（即谱系低表达或Lin^low）。谱系抗体混合物中还包括CD48抗体，因此所有谱系低表达的细胞亚群均为CD48<...

讨论

用于检测活性氧（ROS）的荧光探针染料通常通过显微镜在固定细胞中或通过流式细胞术在活细胞中进行评估。²²使用线粒体活性氧荧光探针对骨髓细胞进行流式细胞术检测线粒体活性氧具有两大优势：1）该技术快速简便，适用于活细胞分析；2）结合表面标志物染色，可在单细胞水平上区分并分析骨髓中稀有细胞群体。本文所展示的逐步实验方案旨在研究 离体 使用流式细胞术检测健康小鼠以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中造血干细胞与祖细胞群体的氧化还原状态。在执行本方案时，需考虑若干关键的技术变量。

首先，使用促氧化剂和抗氧化剂对照可帮助使用者建立线粒体活性氧染色增强的基线，并验证染色的特异性。在本实验方案中，促氧化剂MSB被用作阳性对照，以在健康和白血病骨髓细胞中均可检测到线粒体活性氧染色的诱导作用（图4）。抗氧化剂NAC可作为额外对照，因其可显著逆转MSB诱导的线粒体活性氧染色（图4）。

其次，本研...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
热灭活胎牛血清	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	培养基
青霉素-链霉素	Corning	30-002-CI	培养基
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	缓冲液
15 mL 圆锥形离心管	BD falcon	352096	组织培养耗材
50 mL 圆锥形离心管	BD falcon	352098	组织培养耗材
40 μm 细胞筛	Fisher Scientific	22-363-547	组织培养耗材
红细胞裂解缓冲液	Fisher Scientific	50-112-9751	组织培养耗材
甲萘氢醌钠亚硫酸氢盐	Sigma aldrich	M5750	促氧化剂
NAC	Sigma aldrich	A7250	抗氧化剂
CD3 PE-Cy5 克隆 145-2c11	Biolegend	100310	抗体
CD4 PE-Cy5 克隆 RM4-5	eBioscience	15-0041-81	抗体
CD8 PE-Cy5 克隆 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	抗体
CD19 PE-Cy5 克隆 6D5	Biolegend	115510	抗体
B220 PE-Cy5 克隆 RA3-6B2	Biolegend	103210	抗体
Gr1 PE-Cy5 克隆 RB6-8C5	Biolegend	108410	抗体
Ter119 PE-Cy5 克隆 Ter-119	Biolegend	116210	抗体
CD48 PE-Cy5 克隆 HM48-1	Biolegend	103420	抗体
CD117  APC-Cy7 克隆 2B8	Biolegend	105825	抗体
Sca1 Pacific Blue 克隆 D7	Biolegend	108120	抗体
CD150 APC 克隆 TC15-12F12.2	Biolegend	115909	抗体
CD34 FITC 克隆 RAM34	BD Bioscience	553733	抗体
CD45.2 APC 克隆 104	Biolegend	1098313	抗体
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	染料
MitoTracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	染料
活/死黄染料	ThermoFisher Scientific	L34967	染料