拟南芥底部库组织中加载CFDA示踪剂的向顶运输

摘要

本实验方案的目的是展示如何将CFDA加载到微流控芯片底部不同位点 拟南芥然后我们展示了CF在茎中的分布模式结果。

摘要

同质体示踪剂5(6)-羧基荧光素二乙酸盐（CFDA）已广泛应用于活体植物中，以示踪细胞间连接、韧皮部运输及维管组织模式。本实验方案分别采用根部切断法和下胚轴夹压法，展示羧基荧光素（CF）在拟南芥（Arabidopsis）中由下向上的运输过程。这两种不同的处理方法导致CF运输效率存在差异：采用下胚轴夹压法时，约91%的植株地上部分可检测到CF；而采用根部切断法时，仅有约70%的植株地上部分出现CF。仅改变染料加载位点即引起该同质体染料运输效率的显著变化，提示CF的运输可能受到同质体调控机制的影响，最可能的调控部位为根与下胚轴交界区。

引言

目前已开发并应用于植物中以监测共质体运输和韧皮部活性的荧光示踪剂种类繁多，具有不同的光谱特性，例如5(6)-羧基荧光素（CF）¹、8-羟基芘-1,3,6-三磺酸²、荧光黄CH（LYCH）³、七叶苷和CTER⁴。通常将共质体染料加载至目标组织的切口处，随后观察报告分子在植物其他部位的依次扩散，从而揭示细胞间的通讯情况。尽管染料吸收机制尚未完全阐明，但CF在活细胞内运输的基本原理已被广泛认可。CF的酯化形式（CF二乙酸酯，CFDA）本身无荧光且可穿透膜。该特性使得染料能够快速通过膜扩散进入细胞。一旦进入活细胞，细胞内的酯酶会切除CFDA在3'和6'位点的乙酰基团，释放出具有荧光且不可穿透膜的CF（图1，另见Wright等人的研究²）；随后CF可通过胞间连丝迁移至植物的其他部位。

使用CFDA进行实验是一种成熟的方法，可将其加载到源叶中，用于监测多种物种韧皮部的物质运输及在库组织中的卸载过程，例如拟南芥（Arabidopsis）根中的CF卸载⁵、马铃薯块茎形成过程中的韧皮部卸载⁶、烟草（Nicotiana）库叶中的韧皮部卸载⁷等。通过类似的加载方法，其他研究也利用该染料来证明寄主与寄生植物之间的共质体连接^8,9，或揭示共生关系^10,11。

利用这种染料的另一种方法是通过显微注射将其导入特定细胞或单个细胞，以确定其分布模式。这类精密技术极大地促进了我们对胞间连丝介导的细胞间通讯的深入理解，尤其是在共质体结构域概念的发展方面^12,13。例如，将CFDA显微注射到拟南芥（Arabidopsis）子叶细胞中，结果染料在下胚轴表皮细胞中发生耦合扩散，但在其下方的细胞或根表皮细胞中则不发生耦合，因此下胚轴表皮构成了一个共质体结构域¹⁴。通过显微注射技术，已鉴定出多个类似的结构域，如气孔保卫细胞¹⁵、筛管-伴胞复合体¹⁶、根毛细胞¹⁴以及根冠^17,18。最令人惊讶的是，某些结构域允许示踪分子朝特定方向移动。以毛状体结构域为例，将荧光探针注射到支撑性的表皮细胞中，示踪物可流入毛状体结构域，但反向注射则无法实现该流动¹⁹。最近一项研究也在景天科（Sedum）胚胎的共质体结构域中发现了类似现象²⁰。因此，上述所有案例表明，更换染料加载位点可能为共质体通讯研究带来新的见解。我们先前一项旨在解析根部至地上部分可移动沉默信号传递路径的实验，鉴定出一个新的共质体结构域，即下胚轴-上胚轴连接区（HEJ区），并通过根部加载（非经典源-库加载）CFDA实验进一步验证了该区域的存在²¹。在此，我们通过一种简便方法进一步阐明了CF从根到茎的移动过程，并通过改变加载位点重新发现了一个潜在的共质体结构域。此外，该方法还可用于区分在根至地上部长距离运输方面存在差异的遗传背景。

方案

1. 拟南芥 MS培养基中的垂直生长

1. 使用前，需对超净工作台内部进行30分钟紫外照射和15分钟通风。开启紫外灯时，务必关闭玻璃门。将所有工具和培养皿用70%乙醇喷洒后，再放入工作台内。
2. 在超净工作台中，于标准的90 mm直径培养皿内配制MS（Murashige and Skoog）培养基。
   注意：MS 培养基包含以下组分：20.6 mM NH₄一氧化氮₃，18.8 mM KNO₃₃，1.25 mM KH₂PO₄，1.5 mM MgSO₄₄·7H₂O，3 mM CaCl₂·2H₂O，0.1 mM MnSO₄₄·H₂O，1.03 µM Na₂MoO₄·2H₂O₂，0.1 mM H₂O₂₃BO₃，30 µM ZnSO₄₄·7H₂O，0.1 µM CuSO₄₄·5H₂O₂，0.1 µM CoCl₂₂·6H₂O₂，1.39 µM KI，97 µM FeSO₄·7H₂O₂O、114.5 µM 乙二胺四乙酸（EDTA）、4.07 µM 烟酸、2.44 µM 盐酸吡哆醇、0.15 µM 盐酸硫胺素、2.68 mM 甘氨酸、555 µM 肌醇、87.7 mM 蔗糖和 10 g/L 琼脂。
3. 用灭菌的接种针或牙签轻轻接触MS培养基以润湿针尖或牙签，然后将灭菌后的种子逐个接种到每个培养皿中由播种卡标示的固定位置上。
4. 用石蜡膜和胶带密封培养皿，将其垂直放置于生长室内的透明支架上（22 °C，70% 湿度），光照周期为16小时光照、8小时黑暗（光照时间从早上6点至晚上10点）。 拟南芥 播种后第9至13天，植物即可进行CFDA负载。
   注意：以下操作在下午2点至5点之间进行。

2. 根部切割法加载CFDA

1. 使用前立即配制新鲜的CFDA工作液。将保存在-20 °C冰箱中的1 mM CFDA储备液用无菌超纯水稀释至5 µM的工作浓度。
2. 将微孔石蜡膜（见材料表）切成3 mm × 3 mm的小片。
3. 在22 °C的培养室内打开正在生长的植物，用纸巾清除多余的水分，并将膜小片置于每条根下方。
   注意：从本步骤至步骤2.6，整个操作应在15分钟内完成。
4. 将植物移至培养皿盖上，于根与下胚轴连接处下方约5–10 mm位置切断根部，再将地上部分放回培养基表面的膜上。
5. 在解剖显微镜下，小心地将0.25 µL的CFDA溶液滴加至每条根的切口末端，避免溅到植物其他部位。
6. 盖上培养皿，将植物置于生长室光照条件下孵育2–3小时（22 °C）。
7. 将染色后的植物依次在三个盛有蒸馏水的烧杯中各冲洗一次，然后在体视荧光显微镜下（放大倍数1.4x至3.3x，见材料表）观察。荧光检测时，使用高效率滤光立方体（激发光470/20 nm，分光镜495 nm，发射光525/50 nm）以接收荧光信号。

3. 下胚轴夹持法加载CFDA

1. 使用前立即配制新鲜的CFDA工作液。将保存在-20 °C冰箱中的1 mM CFDA储备液用无菌超纯水（见材料表）稀释至5 µM的工作浓度。
2. 将微孔石蜡膜（见材料表）切成3 mm × 3 mm大小的小片。
3. 在22 °C室内打开培养皿，暴露生长中的植株，并用纸巾清除多余水分。
   注意：从本步骤至步骤3.7，整个操作应在15分钟内完成。
4. 将一小片膜置于每株植物根-下胚轴连接处下方。
5. 在解剖显微镜下，用镊子轻轻夹住下胚轴靠近根-下胚轴连接处的位置。
6. 在解剖显微镜下，小心地将0.1 µL CFDA滴加到伤口处，避免溅到植株其他部位。
7. 盖上培养皿，将植株置于光照条件下（22 °C）孵育2–3小时。
8. 将染色后的植株依次在三个盛有蒸馏水的烧杯中各冲洗一次，然后在体视荧光显微镜下（放大倍数1.4x至3.3x，见材料表）观察。进行荧光检测时，安装高效滤光立方体（激发光470/20 nm，分光镜495 nm，发射光525/50 nm），以传递荧光信号。

结果

胞间连丝运输常受环境波动的影响。植物生长状态的扰动，甚至组织制备过程本身，都会影响胞间连丝的大小排阻极限，从而影响胞间运输²²。为了提高染色效率，我们选择在环境可控的培养室中进行操作，严格控制温度和湿度，并尽可能快速完成整个实验流程（理想情况下，在打开培养皿盖后10-15分钟内完成）。实验过程中采取这些预防措施，可有效降低茎部染色失败的比率。

我们描述了两种略有不同的方法以展示羧基荧光素（CF）向茎部的运输过程。通常情况下，两种方法均可在染料施加约2小时后在茎中观察到CF染色（图2）。然而，这两种方法产生的染色效率不同。下胚轴夹伤法的染色效率为91%，而根切断法为70%（Welch's t-检验，p < 0.001）（图3）。我们还尝试通过根部夹伤法加载染料，发...

讨论

近期研究表明，植物能够快速响应外界刺激²³，包括实验操作过程中引入的干扰²²。在我们最初的实验中，由于忽视了这一认识，常常导致染色失败。吸取这些教训后，我们建议在进行本实验时应注意以下事项：（1）收获后的种子应保存在设定为低温低湿的储物柜中；（2）对植物的操作，特别是将其暴露于储物柜空气中，应尽量缩短时间；（3）实验条件应保持恒定，例如所有操作均应在生长室中进行。

本实验中另一个需要注意的方面是，CFDA 的上样体积应尽可能小。过量的溶液常会导致产生假象，多余的 CFDA 溶液可通过毛细作用扩散至地上部分，从而使幼嫩库叶的毛状体着色。尽管成像前进行洗涤步骤可减轻这种假象，但最佳做法仍是上样最小必要量，以避免过量溶液带来的干扰。

在解决这些技术注意事项后，可以稳定地观察到CFDA从根到茎的运输过程，如图2所示。当植物生长至较老阶段（例如超过24天），拟南芥（Arabi...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KNO3	国药集团化学试剂有限公司	10017218
KH2PO4	国药集团化学试剂有限公司	10017608
MgSO4·7H2O	国药集团化学试剂有限公司	10013018
CaCl2·2H2O	国药集团化学试剂有限公司	20011160
MnSO4·H2O	国药集团化学试剂有限公司	10013418
Na2MoO4·2H2O	国药集团化学试剂有限公司	10019818
硼酸	国药集团化学试剂有限公司	10004818
ZnSO4·7H2O	国药集团化学试剂有限公司	10024018
CuSO4·5H2O	国药集团化学试剂有限公司	10008218
CoCl2·6H2O	国药集团化学试剂有限公司	10007216
KI	国药集团化学试剂有限公司	10017160
FeSO4·7H2O	国药集团化学试剂有限公司	10012118
EDTA	国药集团化学试剂有限公司	10009717
NaOH	国药集团化学试剂有限公司	10019718
KOH	国药集团化学试剂有限公司	10017018
蔗糖	国药集团化学试剂有限公司	10021418
肌醇	MACKLIN	I811835
烟酸	MACKLIN	N814565
盐酸吡哆醇	MACKLIN	V820447
盐酸硫胺素	MACKLIN	T818865
甘氨酸	MACKLIN	G800880
琼脂粉	Novon	ZZ14022
荧光显微镜	Zeiss	Axio Zoom V16
体视显微镜	SDPTOP	SRE-1030
200μl 移液器	Dragon Laboratory Instruments	713111110000-20-200ul
2.5μl 移液器	Eppendorf	3120000011
精细镊子	TWEEZERS	ST-15
封口膜	PARAFILM	PM-996
不锈钢双面刀片	Gillette	Platinum-Plus Double-Edge Blade