体外与体内伤口愈合分析的划痕迁移实验与背侧皮肤折叠腔技术

摘要

本文介绍了一种利用原代成纤维细胞进行体外划痕实验的方法，以及一种在小鼠中进行的体内皮肤伤口愈合实验方案。这两种实验均为评估体外和体内伤口愈合的简便方法。

摘要

皮肤伤口愈合受损是糖尿病患者和老年人面临的主要问题，亟需有效的治疗方法。为了发现可改善皮肤伤口愈合过程的新药物靶点分子，建立合适的体外和体内研究方法至关重要。我们通过两种独立的实验方法——体外划痕迁移实验和体内背部皮肤折叠室模型，鉴定出电压门控钙通道的β3亚基（Cavβ3）是一种潜在的调控伤口愈合的靶分子。实验中使用了从野生型（WT）小鼠和Cavβ3基因敲除小鼠（Cavβ3 KO）急性分离的原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），或从野生型小鼠急性分离并用siRNA处理以降低编码Cavβ3的Cacnb3基因表达的成纤维细胞。在融合的单层细胞上制造划痕，随后在设定的时间点拍摄显微图像，追踪迁移细胞重新填充划痕区域的过程，直至完全闭合。对这些图像进行分析，并计算每种条件下的细胞迁移速率。在体内实验中，我们在野生型和Cavβ3基因敲除小鼠身上植入背部皮肤折叠室，制造一个直径为2 mm的圆形伤口，用玻璃盖玻片覆盖伤口以防止感染和干燥，并随时间监测宏观的伤口闭合情况。结果显示，Cacnb3基因缺陷小鼠的伤口闭合速度显著更快。由于体内和体外实验结果高度一致，因此体外实验可用于在利用体内伤口愈合模型进行验证之前，进行高通量筛选。本研究中针对野生型和Cavβ3缺陷小鼠或细胞所展示的方法，也可能适用于除Cavβ3以外的其他特定分子的研究。

引言

皮肤损伤后，皮肤伤口愈合立即启动，以恢复皮肤的完整性并保护机体免受感染。伤口愈合过程经历四个重叠的阶段：凝血、炎症、新生组织形成和组织重塑¹。细胞迁移在这些阶段中至关重要。炎症细胞、免疫细胞、角质形成细胞、内皮细胞和成纤维细胞在不同时间点被激活并侵入伤口区域²。体外和体内研究伤口愈合的方法不仅对于理解其潜在机制具有重要意义，而且对于测试新药以及开发旨在改善和加速皮肤伤口愈合的新策略也备受关注。

为了监测和分析细胞迁移，可以使用划痕迁移实验。该实验常被称为体外伤口愈合实验。此方法需要具备细胞培养设施。³这是一种简单的实验方法，无需高端设备，大多数细胞生物学实验室均可开展。该实验通过机械划痕破坏融合的单层细胞（优选上皮样细胞、内皮样细胞或成纤维细胞），形成无细胞区域。划痕边缘的细胞会迁移以重新填充该空白区域。通过定量测定随时间推移无细胞区域的减少程度，可反映细胞的迁移速率，并指示细胞完全闭合划痕所需的时间。实验可采用野生型小鼠或缺乏特定目的基因的小鼠来源的原代分离细胞。⁴，或来自可靠细胞库的永生化细胞。划痕实验可用于研究药理学活性化合物，或转染的cDNA及siRNA对细胞迁移的影响。

在体内，伤口愈合是一个复杂的生理过程，需要多种细胞类....

方案

所有实验操作均经萨尔州及萨尔兰大学动物福利委员会批准，并依照伦理规范和动物福利要求进行。

1 原代细胞培养与siRNA转染

注意：在所述方法中使用的是原代成纤维细胞。这些细胞在伤口愈合和组织重塑过程中发挥着关键作用¹¹在本实验中， Cacnb3 基因，编码高电压门控钙通道的Cavβ3亚基¹² 呈下调，从而表明其在体外细胞迁移和体内皮肤伤口修复中的作用⁴.

1. siRNA的制备：在重悬siRNA之前，先短暂离心管体，以确保内容物沉降至管底。用以下溶液重悬siRNA： 100 µL RNase-free缓冲液（100 mM醋酸钾，30 mM HEPES，pH 7.5），由制造商提供，浓度为 20 µM这是一份siRNA的储存液。
2. 将此储备液分装 10 µL 每管（20 µM 浓度）并于 -20 °C 直至使用。
3. 使用超细永久性记号笔，在6孔板每个孔的底部标记一条水平线，以便始终能够识别相同的划痕区域并追踪其闭合情况。
   注意：本实验采用6-well培养板，因其尺寸足够大，可提供充足的空间和操作灵活性，便于使用移液器枪头 consistently、reproducibly 且垂直地划出划痕 200 µ....

结果

在野生型和β3缺陷型MEF的融合细胞单层上进行了划痕实验（图1c）。使用200 μL移液枪头制造“划痕”后，两种基因型的细胞均迁移到划痕区域并闭合间隙。分别在6、10和30小时后拍摄图像（图1a）。细胞迁移能力以划痕后6小时迁移细胞重新占据的划痕区域百分比（%）进行量化。与野生型小鼠MEF相比，Cavβ3缺陷型MEF显著更早地闭合了划痕区域（图1a,b）。为排除细胞增殖的影响，划痕迁移实验分别在含10%或1%胎牛血清（FCS）的条件下进行。在10% FCS条件下，细胞增殖和迁移两种过程均存在，而在1% FCS条件下细胞增殖被最小化。在10%（图1b，左）或1% FCS（图1b.......

讨论

在本研究中，我们描述了一种体外和体内伤口愈合实验方法，并对所得结果进行了相关性分析。对于体外实验，我们使用了原代小鼠成纤维细胞^4,14,15，这类细胞在伤口愈合和组织重塑过程中发挥着重要作用¹¹。其他以单层形式生长的贴壁细胞类型（例如上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞）也可用于该实验。为了获得准确且可重复的结果，至关重要的是接种相同数量的活细胞且细胞状态健康，并在相同的汇合度下进行划痕操作。强烈建议进行生物学重复和技术重复。本方法中使用了6孔板，但当细胞数量有限时，也可使用12孔或24孔板。若涉及siRNA处理，则每次实验后必须进行免疫印迹分析，以确认目标蛋白被有效下调。在开始迁移实验前，应针对每种细胞类型测试并选择合适的转染试剂和转染时间窗口。以成纤维细胞和Cacnb3基因为例，通常需要3至4天才能达到理想的蛋白下调水平。相比之下，划痕迁移实验所需时间较短（6小时至24小时）。为避免划痕.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9 % NaCl
1 ml 注射器	BD Plastipak	303172
6 孔板	Corning	3516
活检打孔器	Kai Industries	48201	2 mm
Cacnb3 小鼠 siRNA 寡核苷酸双链（基因位点编号 12297）	Origene	SR415626
脱毛膏			任意品牌的脱毛膏
5% 泛醇（BEPANTHEN）	拜耳	3400935940179.00	（BEPANTHEN）
盐酸二羟甲苯噻嗪（赛拉嗪）	Bayer Health Care		Rompun 2%
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco by life technologies	41966-029
胎牛血清	Gibco by life technologies	10270-106
六角全螺母
盐酸氯胺酮	Zoetis		KETASET
光学显微镜	Keyence, 大阪, 日本	BZ-8000	可使用类似型号的显微镜
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	13778075
显微镊子
显微剪刀
小鼠固定器	自制
普通剪刀
物镜	尼康	plan apo 10x/0.45
Opti-MEM 培养基	Gibco by life technologies	51985-026
聚丙烯缝合线
螺丝刀
皮肤消毒剂（Octeniderm）	Schülke & Mayr GmbH	118212
开槽盘头螺钉
卡簧
卡簧钳
带摄像头的手术显微镜	Leica	Leica M651
皮肤窗植入用钛合金框架	IROLA	160001	Halteblech M
金属丝钳