原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

摘要

我们提出了一种用于免疫学研究的原子力显微镜（AFM）悬臂梁功能化方案，可在其上固定单个T细胞和微粒。本文展示了利用AFM探测单对T细胞-树突状细胞结合的步骤，以及结合荧光成像技术，利用AFM实时监测巨噬细胞对单个固体微粒的细胞反应的方法。

摘要

基于原子力显微镜的单细胞力谱技术（AFM-SCFS）是研究活细胞生物物理特性的有力工具。该技术可用于探测活细胞膜上的相互作用强度与动态过程，包括细胞间的相互作用、受体与配体之间的结合，以及其他多种情况。此外，该技术还可作为一种机制，以时空可控的方式对单个细胞施加物理或生化刺激，从而在与活细胞荧光成像结合时，实现实时监测特定细胞的激活及其后续的细胞事件。此类AFM-SCFS测量的关键步骤是原子力显微镜悬臂梁的功能化，即以某种方式将待研究对象固定在悬臂梁上。本文介绍了分别将单个T细胞和单个聚苯乙烯微球修饰到原子力显微镜悬臂梁上的方法，用于免疫学研究。前者采用一种生物相容性胶体，在溶液环境中将单个T细胞偶联至平头悬臂梁的尖端；后者则依赖环氧胶在空气环境中实现单个微球的粘附。本文还提供了与每种悬臂梁修饰方法相关的两项免疫学应用实例。此处描述的方法可轻松适用于不同类型的细胞和固体颗粒。

引言

原子力显微镜（AFM）作为一种多功能工具，已在细胞生物学研究中得到广泛应用^1,2,3,4,5。除了具备高分辨率成像能力外，其固有的力探测功能还可在单细胞水平上直接原位研究活细胞的生物物理特性^6,7，包括亚细胞结构甚至整个细胞的刚度^8,9,10,11,12、细胞表面单分子水平上的特异性配体/受体结合强度¹³，以及单个颗粒与细胞之间或两个细胞之间的黏附力^1,2,

方案

小鼠实验方案遵循清华大学的动物护理指南

1. 使用单个T细胞对悬臂梁进行功能化修饰

1. 小鼠脾细胞制备
   1. 使用二氧化碳处死小鼠（8-16周龄，性别不限；例如C57BL/6品系），随后进行颈椎脱位。
   2. 用75%乙醇清洁小鼠，沿中线做皮肤切口，随后进行脾脏切除术。
   3. 使用玻片在含有2%胎牛血清（FBS）的4 mL PBS中研磨脾脏组织，并将细胞悬液通过70 μm尼龙筛网过滤，以去除细胞团块和碎片。
   4. 将细胞悬液在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，加入2 mL室温平衡的红细胞裂解缓冲液重悬细胞，裂解5分钟。加入8 mL PBS溶液终止裂解反应。
   5. 将细胞悬液在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，用含2% FBS和1 mM EDTA的PBS重悬细胞至密度为1 x 10⁸ 个细胞/mL（标记为溶液A），体积通常为0.25-2 mL，具体取决于细胞密度。将重悬的细胞转移至5 mL（12 x 75 mm）聚苯乙烯圆底管中。
2. 小鼠CD4+ T细胞制备
   1. 向步骤1.1.5获得的细胞样品中加入50 μL/mL大鼠血清（见材料表）和50 μL/mL CD4+ T细胞分离试剂盒（见材料表....

结果

图4A 显示了一个T细胞与一个树突状细胞（DC）在一次接近-回撤循环中结合相互作用的典型力-距离曲线。浅红色曲线为延伸曲线，深红色曲线为回撤曲线。由于延伸曲线通常用于压痕或刚度分析，此处仅关注回撤曲线以研究细胞黏附。曲线中的最小值（绿色圆圈）反映了最大黏附力的大小。曲线下的面积（阴影区域）表示将T细胞从DC上分离所需的功（能量）。在完全分离之前，常可观察到尖锐且呈阶梯状的断裂事件。这被解释为由于细胞-细胞界面处的强结合，在持续拉力作用下，细胞膜表面被拉出膜纳米管（membrane tethers），随后在拉力下离散断裂所致。这些阶梯的数量、高度和长度可用于表征细胞膜的力学特性²¹。对于T细胞-DC相互作用，我们关注的是结合强度，因此仅对每条曲线的最大黏附力进行分析。图4B 比较了传统T细胞（Tconv）/DC与调节性T细胞（Treg）/DC之间的黏附力。Tconv可识别由抗原呈递细胞（如DC）呈递的肽类抗原.......

讨论

基于原子力显微镜的单细胞力谱技术已发展成为研究活细胞生物物理特性的有力工具。在这些应用中，需对悬臂梁进行适当的修饰，以探测目标细胞上的特定相互作用或特性。本文分别描述了将单个T细胞和单个微米级小球连接至无针尖悬臂梁的方法。为将单个T细胞固定在悬臂梁上，选用一种生物相容性胶体作为细胞黏附剂。该胶体是一种从海洋贻贝中提取的特制蛋白质溶液，其黏附性来源于多酚类残基，这些残基上的羟基可非特异性地与细胞表面暴露的残基形成氢键。这种结合方式通常不会干扰被结合细胞的正常细胞功能。为了实现良好的黏附效果，待固定细胞的状态也至关重要。以新纯化的鼠源CD4+ T细胞为例，必须先用重组人IL-2处理过夜，方可用于悬臂梁的功能化修饰；否则，细胞会迅速发生死亡。若细胞状态不佳，即使能够成功附着于悬臂梁，在经历数次力探测循环后也极可能因黏附强度较弱而脱落，导致力测量实验失败率升高。这种生物相容性胶体的缺点是易发生氧化，因此偶联操作应尽快完成，这对操作者而言有时具有挑战性。为减少该胶体的氧化，强烈建议将30 µL分装液置于充满N₂的冷冻管中保存₂ 来自N₂储备液的气体₂ 空气环境并储存在液氮中₂ 以获.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
10 μl 移液器吸头	Thermo Fisher	104-Q
15 ml 离心管	Corning	430791
6 cm 直径培养皿	NALGENE nunc	150462
6 孔培养板	JET	TCP011006
AFM 悬臂梁	NanoWorld	Arrow-TL1-50	无针尖悬臂梁
β-巯基乙醇	Sigma	7604
生物相容性胶水	BD Cell-Tak	354240
CD4+ T 细胞分离试剂盒	STEMCELL	19852C.1
DC2.4 细胞系	由 K. Rock（美国马萨诸塞大学医学院，伍斯特，MA）惠赠
葡聚糖包被磁性颗粒	STEMCELL	SV30010
EDTA	GENEray	Generay-E1101-500 ml
环氧树脂	ERGO	7100
乙醇	twbio	00019
FBS	Ex Cell Bio	FSP500
FcR 阻断剂	STEMCELL	18731
玻璃盖玻片	本地供应商（海门联升）	HX-E37	直径 24 mm，厚度 0.17 mm
载玻片	海门金通实验室与设备管理科	N/A	定制
H2O2 (30%)	国药集团	10011218
H2SO4	国药集团	80120892
HEPES	Sigma	51558
磁铁	STEMCELL	18000
尼龙网筛	BD Falcon	REF 352350
Moesin-EGFP	N/A		实验室克隆
小鼠 CD25 Treg 细胞阳性分离试剂盒	STEMCELL	18782	组分：FcR 阻断剂、调节性 T 细胞阳性选择试剂、PE 选择试剂、Dextran RapidSpheres
小鼠 CD4+ T 细胞分离试剂盒	STEMCELL	19852	组分：CD4+ T 细胞分离试剂、链霉亲和素 RapidSpheres、大鼠血清
NaOH	北京兰谊化学产品有限公司	1310-73-2
PBS	Solarbio	P1022-500
PE 选择试剂	STEMCELL	18151
青霉素-链霉素	Hyclone	SV30010
PLCδ-PH-mCherry	Addgene	36075
聚苯乙烯微球 6.0μm	Polysciences	07312-5
聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	352054
大鼠血清	STEMCELL	13551
RAW264.7	ATCC
重组人白细胞介素-2	Peprotech	Peprotech, 200-02-1000
红细胞裂解缓冲液	碧云天	C3702
调节性 T 细胞阳性选择试剂	STEMCELL	18782C
RPMI 1640	Life	C11875500BT
样品室	自制
链霉亲和素包被磁性颗粒	STEMCELL	50001
转染试剂盒	Clontech	631318
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Life	25200114
镊子	JD	N/A
名称	公司	货号	备注
设备
20x 物镜 NA 0.8	Zeiss	420650-9901	Plan-Apochromat
原子力显微镜	JPK	cellHesion200
离心机	Beckman coulter	Allegra X-12R
荧光成像系统	基于 Zeiss 显微镜支架自制的物镜型全内反射荧光显微镜
加湿 CO2 培养箱	Thermo Fisher	HERACELL 150i
倒置光学显微镜	Zeiss	Observer A1 手动型