Method Article

原子力显微镜罐体功能化,具有单T细胞或单粒子免疫单细胞力光谱

DOI:

10.3791/59609

⸱

July 10th, 2019

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In This Article

Summary

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我们提出了一种协议,用单个T细胞和珠子粒子使原子力显微镜(AFM)的吊带功能化,用于免疫学研究。显示了通过AFM探测单对T细胞树突状细胞结合的过程,并监测宏噬细胞对单个固体颗粒的实时细胞响应,并采用荧光成像。

Abstract

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基于原子力显微镜的单细胞力光谱(AFM-SCFS)是研究活细胞生物物理特性的有力工具。这种技术允许在活细胞膜上探测相互作用强度和动力学,包括细胞、受体和配体之间的相互作用强度和动力学,以及许多其他变异。它还作为一种机制,以时空控制的方式在单个细胞上提供物理或生化刺激,从而在与活细胞结合时实时监控特定的细胞激活和随后的细胞事件荧光成像。这些 AFM-SCFS 测量的关键步骤是 AFM 悬臂功能化,换句话说,将感兴趣的主题附加到悬臂上。在这里,我们提出用单个T细胞和单个聚苯乙烯珠分别修改AFM吊杆的方法,用于免疫学研究。前者涉及一种生物相容性胶水,将单T细胞耦合到溶液中的扁平悬臂尖端,而后者则依靠环氧胶在空气环境中的单珠粘附。还提供了与每个悬臂修饰相关的两个免疫学应用。此处描述的方法可以很容易地适应不同的细胞类型和固体颗粒。

Introduction

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原子力显微镜(AFM),一个多功能的工具,在细胞生物学研究1,2,3,4,5中已经发现许多应用。除了高分辨率成像能力外,原生力探测功能还允许活细胞的生物物理特性在单细胞6、7级直接就地研究。这些包括亚细胞结构,甚至整个细胞的刚性 8,9,10,11,12,特定的配体/受体结合强度细胞表面的单分子水平13,固体粒子和细胞的单对之间的附着力或两个细胞1、2、14、15之间的附着力。

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Protocol

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小鼠实验方案遵循清华大学动物护理指南

1. 单T细胞的悬臂功能化

  1. 小鼠脾细胞制剂
    1. 牺牲小鼠(8-16周的年龄(两性);例如,C57BL/6菌株)使用二氧化碳,其次是宫颈脱位。
    2. 用75%乙醇清洁小鼠,进行中线皮肤切口,然后进行切除。
    3. 使用玻璃滑梯将含有 2% 胎儿牛血清 (FBS) 的 PBS 4 mL 中的脾脏均匀化,并通过 70 μm 网状尼龙滤网将细胞悬浮液排出骨质和碎屑。
    4. 将细胞悬浮在500 x g下悬浮5分钟,在2 mL红细胞解压缓冲液(在室温下平衡)中丢弃上清液并重新悬浮细胞5分钟。通过加入8 mL的PBS溶液终止赖舍反应。
    5. 将细胞悬浮在500 x g

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Results

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图 4A显示了单 T 单元和单 DC 之间在一个接近缩回周期中结合交互的典型力距离曲线。浅红色曲线是延伸曲线,深红色曲线为回缩曲线。由于延伸曲线通常用于缩进或刚度分析,因此这里只涉及缩进曲线, 与细胞粘附有关。曲线中的最小值(绿色圆圈)表示最大附着力的度量。曲线下的区域(带沙区)表示将 T 单元与 DC 分离所需的工作(能量)。在完全分离之前,经常观察到尖锐和逐步破裂事件。这被解释为膜系绳由于细胞/细胞界面的强结合而从细胞表面拉出,然后在连续拉扯下分立断裂。步骤的数量、高度和长度可用于表征细胞膜的机械特性21。对于T细胞-DC相互作用,我们对结合强度感兴趣,因此只分析每条曲线的最大附着力。图 4B比较了传统 T 单元 (Tconv)/直流和调节 T 单元 (Treg)/DC 之间的粘附力。Tconv识别抗原呈现的肽抗原,如DC,而Treg是抑制T细胞,关闭Tconv介导的免疫接近免疫反应的末端。显然,Tre.......

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Discussion

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基于AFM的单细胞力光谱已经演变为解决活细胞生物物理特性的有力工具。对于这些应用,悬臂需要正确工作,以便探测感兴趣的单元上的特定交互或属性。分别介绍了单T单元和单微米尺寸珠与无尖悬臂耦合的方法。为了将单个T细胞附着在悬臂上,选择生物相容性胶水作为细胞粘合剂。它是一种从海洋贝类中提取的特制蛋白质溶液。其粘附性源于多酚残留物,其羟基基组可与以非特异性方式在细胞表面暴露的残留物形成氢键。这种结合方法通常不会干扰结合细胞的功能。对于适当的附着力,要连接的细胞的条件也很重要。对于新纯化的小鼠CD4+T细胞,首先必须用人类IL-2进行一夜治疗,然后才能用于悬臂功能化。否则,他们将很快地经历细胞死亡。如果细胞在条件不好的情况下,即使它们可以附着在悬臂上,由于粘附强度较弱,它们很可能在几轮力探测后脱离悬臂,从而导致力测量的故障率很高。这种生物相容性胶水的缺点是容易氧化,因此必须尽快完成耦合程序,这有时对操作员来说可能具有挑战性。为了减少生物相容性胶水的氧化,强烈建议在N2空气环境中从库存溶液中填充N2气体的低温小瓶中制备30μL等分,并将其储存在液体N2中,以获得最佳性能.最重要的是,这.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了国家自然科学基金总体计划(31370878)、国家重点计划(31630023)和创新研究组计划(81621002)的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
材质
10 μl 移液器吸头Thermo Fisher104-Q
15 ml 管Corning430791
6 cm 直径培养皿NALGENE nunc150462
6 孔培养板JETTCP011006
AFM 悬臂NanoWorldArrow-TL1-50无吸头悬臂
&β;-巯基乙醇Sigma7604
生物相容性胶水BD Cell-Tak354240
CD4+ T 细胞分离 鸡尾酒STEMCELL19852C.1
DC2.4 细胞系K. Rock（马萨诸塞大学医学院，伍斯特，马萨诸塞州）的礼物葡
聚糖包被的磁性颗粒STEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 ml
环氧树脂ERGO7100
乙醇twbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR 阻断剂STEMCELL18731
玻璃盖玻片本地供应商（海门联生）HX-E37直径 24 毫米，厚度 0.17 毫米
玻璃载玻片海门市金通实验室与设备管理部 N/A定制
H2O2 （30%）中药10011218
H2SO4中药80120892
HEPESSigma51558
磁铁STEMCELL18000
网状尼龙过滤器BD FalconREF 352350
Moesin-EGFPN/A在实验室克隆
CD25 Treg 细胞阳性分离试剂盒STEMCELL18782组分：FcR 阻断剂、调节性 T 细胞阳性选择混合物、PE 选择混合物、葡聚糖 RapidSpheres、
小鼠 CD4+ T 细胞分离试剂盒STEMCELL19852组分：CD4+T 细胞分离混合物、链霉亲和素RapidSpheres， 大鼠血清
NaOH兰逸化工产品有限公司？北京1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
PE 选择混合物STEMCELL18151
青霉素-链霉素海克隆SV30010
PLCδ-PH-mCherryAddgene36075
聚苯乙烯微球 6.0&μ;mPolysciences07312-5
聚苯乙烯圆底管BD Falcon352054
大鼠血清STEMCELL13551
RAW264.7 ATCC
重组人白细胞介素-2PeprotechPeprotech，200-02-1000
红细胞裂解缓冲液BeyotimeC3702
调节性 T 细胞阳性选择混合物STEMCELL18782C
RPMI 1640LifeC11875500BT
样品室自制
链霉亲和素包被的磁性颗粒STEMCELL50001
转染试剂盒Clontech631318
胰蛋白酶 0.25% EDTALife25200114
镊子JDN/A
名称Company目录号<strong>评论
设备
20x 物镜 NA 0.8蔡司420650-9901平场复消色差
原子力显微镜JPKcellHesion200
离心机贝克曼库尔特Allegra X-12R
荧光成像基于蔡司显微镜支架
加湿 CO2 培养箱Thermo FisherHERACELL 150i
倒置光学显微镜ZeissObserver A1 手册
小鼠 的自制物镜式全内反射荧光显微镜

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al.

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