一种用于定量细菌中蛋白质-RNA 结合的检测方法

摘要

本方法通过一种简单的活体报告基因检测法，在细菌细胞中定量分析RNA结合蛋白（RBPs）与其同源及非同源结合位点的结合亲和力。该检测基于报告基因的表达抑制作用。

摘要

在蛋白质翻译的起始阶段，核糖体结合到mRNA的起始区域。当RNA结合蛋白（RBP）结合到mRNA的起始区域时，会阻碍核糖体的结合，从而阻断翻译起始。在本方法中，我们利用这种阻断现象来定量测定RBP与其特异性及非特异性结合位点之间的结合亲和力。为此，我们将一个待测结合位点插入报告基因mRNA的起始区域，并诱导待测RBP的表达。当RBP与RNA发生结合时，报告基因的表达随RBP浓度呈现S形抑制曲线；而当结合位点与RBP之间无亲和力或亲和力极低时，则未观察到显著的抑制效应。该方法在活的细菌细胞中进行，无需昂贵或复杂的仪器设备。它适用于定量和比较在细菌中具有功能的不同RBP对一组设计好的结合位点的结合亲和力。对于具有高度结构复杂性的结合位点，本方法可能不适用，因为在缺乏RBP的情况下，复杂的mRNA结构本身可能抑制核糖体的起始，导致基础报告基因表达水平降低，从而使得RBP结合后引起的报告基因抑制效应难以观测。

引言

基于RNA结合蛋白（RBP）的转录后调控，特别是RBP与RNA之间相互作用的表征，在近几十年来已被广泛研究。在细菌中，存在多个由RBP抑制或直接与核糖体结合竞争而导致翻译下调的例子^1,2,3。在合成生物学领域，RBP-RNA相互作用正逐渐成为设计基于转录的遗传回路的重要工具^4,5。因此，对这类RBP-RNA相互作用在细胞环境中的表征需求日益增加。

研究蛋白质-RNA 相互作用的最常用方法是电泳迁移率变动分析（EMSA）⁶，但该方法仅限于体外实验环境，以及多种下拉分析方法⁷，包括 CLIP 方法^8,9。尽管这些方法能够用于发现新的 RNA 结合位点，但仍存在诸多缺点，例如实验流程繁琐、深度测序反应成本高昂，并且可能需要针对 RNA 结合蛋白（RBP）的特异性抗体才能进行下拉操作。由于 RNA 对其周围环境高度敏感，多种因素均可能影响 RBP-RNA 相互作用，因此在细胞环境中研究 RBP-RNA 结合显得尤为重要。例如，我们及其他研究团队已证明 RNA 在体内与体外的结构存在显著差异^10,11。

基于先前研究的方法¹²我们最近证明¹⁰ 当放置来自噬菌体GA的衣壳RBP的预先设计的结合位点时¹³，MS2¹⁴，PP7¹⁵和 Qβ¹⁶ 在报告基因mRNA的翻译起始区，报告基因的表达受到强烈抑制。我们提出一种基于该抑制现象的相对简单且定量的方法，用于测量RNA结合蛋白（RBPs）与其相应RNA结合位点之间的亲和力。s 体内

方案

1. 系统准备

1. 结合位点质粒的设计
   1. 按照图1所示设计结合位点盒。每个微型基因包含以下部分（5'至3'）：Eagl限制性酶切位点、约40个碱基的卡那霉素（Kan）抗性基因5'端序列、pLac-Ara启动子、核糖体结合位点（RBS）、mCherry基因的AUG起始密码子、一段间隔序列（δ）、一个RBP结合位点、80个碱基的mCherry基因5'端序列，以及一个ApaLI限制性酶切位点。
      注意：为提高实验成功率，针对每个结合位点设计三个结合位点盒，其间隔序列分别包含至少一个、两个和三个碱基。更多指导请参见代表性结果部分。
2. 结合位点质粒的克隆
   1. 将结合位点盒作为双链DNA（dsDNA）微型基因进行合成订购。每个微型基因长约500 bp，在5'和3'末端分别含有Eagl和ApaLI限制性酶切位点（见步骤1.1.1）。
      注意：本实验中，订购的微型基因包含一半的卡那霉素抗性基因，以便于阳性克隆的筛选。然而，Gibson组装¹⁷也适用于此情况，此时结合位点可作为两条较短的互补单链DNA寡核苷酸进行订购。
   2. 根据限制性酶切方案¹⁸，使用Eagl-HF和ApaLI对微型基因和目标载体进行双酶切，并通过柱纯化¹⁹回收产物。
   3. 将酶切后的微型基因与含有mCherry报告基因其余部分、终止子及卡那霉素抗性基因的结合位点骨架质粒进行连接²⁰。
   4. 将连接产物转化至Escherichia coli TOP10细胞中²¹。
   5. 通过Sanger测序鉴定阳性转化子。
      1. 设计一条位于目标区域上游约100个碱基处的引物（引物序列见表1）。
      2. 提取少量细菌菌落进行质粒小提²²。
      3. 准备5 µL浓度为5 mM的引物溶液和10 µL浓度为80 ng/µL的DNA溶液。
      4. 将上述两种溶液送至合适的测序服务机构进行Sanger测序²³。
   6. 将纯化的质粒以96孔板格式储存于-20 °C，菌株则以甘油保存液形式储存于-80 °C²⁴。所得DNA将用于转化含有四种融合RBP质粒之一的E. coli TOP10细胞（见步骤1.3.5）。
3. RBP质粒的设计与构建
   注意：本研究中所用衣壳蛋白的氨基酸和核苷酸序列列于表2。
   1. 将所需的RBP序列（不含终止密码子）作为定制合成的双链DNA微型基因进行订购，其两端带有适当的限制性酶切位点（图1）。
   2. 将测试用的RBP序列（不含终止密码子）克隆至一个可诱导启动子的下游，并位于一个缺少起始密码子的荧光蛋白基因的上游（图1），操作步骤类似于1.2.2–1.2.4。确保RBP质粒携带与结合位点质粒不同的抗生素抗性基因。
   3. 通过Sanger测序鉴定阳性转化子，方法同步骤1.2.5（引物序列见表1）。
   4. 选取一个阳性转化子制备成化学感受态细胞²⁵。将纯化的质粒以96孔板格式储存于-20 °C，菌株甘油保存液储存于-80 °C²⁴。
   5. 将步骤1.2.6中保存于96孔板中的结合位点质粒转化至已含有RBP-mCerulean质粒的化学感受态细菌细胞中²¹。为节省时间，无需将细胞涂布于培养皿上，而是使用8通道移液器将其接种至含有Luria-Bertani（LB）²⁶琼脂及相应抗生素（Kan和Amp）的8道板上。菌落应在16小时内出现。
   6. 为每个双转化子挑选单个菌落，在含相应抗生素（Kan和Amp）的LB培养基中过夜培养，并以甘油保存液形式在96孔板中于-80 °C保存²⁴。

2. 实验设置

注意： 此处展示的实验方案使用了液体处理机器人系统，并结合培养箱和酶标仪进行操作。每次测量包含24种诱导剂浓度，每种菌株与诱导剂的组合均设置两个重复。利用该机器人系统，每天可完成16个菌株、每个菌株24种诱导剂浓度的数据采集。然而，若缺乏此类设备，或实验规模较小，则可使用八通道多道移液器手动操作，并相应调整实验方案。例如，初步实验即采用此手动方法，每天检测4个菌株，每个菌株设置12种诱导剂浓度，并在四个时间点进行测量。

1. 提前配制1 L生物测定缓冲液（BA）：将0.5 g胰蛋白胨、0.3 mL甘油、5.8 g NaCl、50 mL 1 M MgSO₄、1 mL 10×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和950 mL双蒸水（DDW）混合。对BA缓冲液进行高压灭菌或无菌过滤。
2. 在48孔板中，于37 °C、250 rpm振荡条件下，在1.5 mL LB培养基中培养双转化菌株，加入适当抗生素（卡那霉素终浓度为25 μg/mL，氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL），培养18小时（过夜）。
3. 早晨进行以下准备工作。
   1. 诱导剂板。在洁净的96孔板中，于37 °C培养箱中准备含半贫培养基（SPM）的孔，SPM由95% BA和5% LB²⁶组成。孔的数量应与所需诱导剂浓度数量一致。向诱导剂板中将含有最高诱导剂浓度（218 nM）的孔中加入C4-HSL。
   2. 编程机器人将每个最高浓度孔中的培养基依次稀释至23个较低浓度，浓度范围为0至218 nM。每种诱导剂稀释液的体积应足以满足所有菌株（包括重复样本）的需要。
   3. 在进行诱导剂稀释的同时，将96孔板中的180 μL SPM于37 °C培养箱中预热。
   4. 将步骤2.2中过夜培养的菌液按100倍稀释：首先在48孔板中将100 μL菌液与900 μL SPM混合，进行10倍稀释；然后在适合荧光检测的96孔板中，取20 μL上述稀释液加入180 μL预热的SPM中，再次稀释10倍。
   5. 根据最终浓度要求，将诱导剂板中的稀释诱导剂加入含有稀释菌液的96孔板中。
4. 将96孔板在37 °C下振荡培养6小时，每隔30分钟使用酶标仪测定光密度（OD₅₉₅）、mCherry（560 nm/612 nm）和mCerulean（460 nm/510 nm）的荧光值。为归一化目的，同时测定未接种细胞的SPM生长背景值。

3. 初步结果分析

1. 针对实验的每一天，根据测得的生长曲线，在线性生长期与稳定期之间选择一个对数生长期的时间区间（T₀，T_final）。选取大约6−8个时间点，同时舍弃第一个和最后一个测量值，以避免因指数生长检测不准确而引入误差（见图2A，上图）。
   注意：若菌株表现出异常的生长曲线，或无法检测到对数生长期，则应舍弃该菌株并重复实验。
2. 根据每种诱导剂浓度下mCerulean和mCherry荧光的原始数据，计算mCerulean的平均归一化荧光值以及mCherry的生成速率（图2A）。
   1. 按以下公式计算归一化的mCerulean：
      
      其中，blank(mCerulean) 表示仅含培养基时的mCerulean水平 [a.u.]，blank(OD) 表示仅含培养基时的光密度值，mCerulean 和 OD 分别表示mCerulean荧光值和光密度值。
   2. 对不同时间点的mCerulean进行平均（图2B，上两个图），公式如下：
      
      其中，#Time points 表示所纳入的时间点数量，T₀ 表示指数生长期开始的时间，T_final 表示指数生长期结束的时间。
   3. 按以下方式计算mCherry的生成速率（图2B，下两个图）：
      
      其中，mCherry(t) 表示时间 t 时的mCherry水平 [a.u.]，OD 表示光密度值，T₀ 表示指数生长期开始的时间，T_final 表示指数生长期结束的时间。
3. 最后，以mCerulean为横坐标，绘制mCherry生成速率的函数图，从而得到作为RBP-mCerulean融合蛋白荧光函数的剂量-响应曲线（图2C）。此类图示表示报告基因的生成速率随细胞内RBP存在量的变化关系。

4. 剂量反应函数拟合流程及K_RBP提取

1. 假设核糖体在结合RBP后的翻译速率保持恒定，将mCherry的产生速率建模如下（参见 图 2D，绿色线条）：
   
   其中 [x] 是根据公式 2 计算得到的归一化平均 mCerulean 荧光值，mCherry 生成速率为根据公式 3 计算得到的数值，K_RBP 是相对结合亲和力 [a.u.]，K_未结合 是RBP未结合时核糖体的翻译速率，n是协同因子，C是基础荧光强度［a.u.］。C，n，K_未结合的，以及 K_RBP 通过将 mCherry 产生速率数据拟合到模型（公式 4）中得出。
2. 使用数据分析软件，对描述 mCherry 产生速率随平均 mCerulean 变化的关系图（步骤 3.3）进行拟合分析，并根据公式（方程 4）提取拟合参数。
   注意： 仅包含 R 值的拟合结果² > 0.6 被纳入考虑。对于这些拟合，K_RBP 误差主要在 K 的 0.5% 到 20% 范围内_RBP 值，对应于0.67置信区间，而那些具有较高K的_RBP 错误也可以通过肉眼进行验证。
3. 标准化 K_RBP 将每个剂量-反应函数的平均mCerulean值除以其各自的最大值。
   
   其中 K_RBP 在[a.u.]中为从公式4的拟合过程提取的值，max（平均mCerulean）为当前菌株观察到的最大平均mCerulean信号[a.u]。
   注意： 归一化通过消除对特定RBP最大表达水平的依赖，从而促进在不同菌株间对调控效应进行正确比较。

结果

本方法利用RNA结合蛋白（RBP）与核糖体在mRNA分子上的结合竞争（图1）。随着诱导剂浓度增加，RBP-mCerulean的表达量上升，导致mCherry水平相应下降，反映出上述竞争关系。若mCerulean荧光增强，而mCherry无显著变化，则推断RBP未发生结合。图中展示了阳性菌株与阴性菌株的代表性实验结果（图2）。在图2A中，OD、mCherry和mCerulean信号随时间及诱导剂浓度的变化在4小时范围内呈现，其中T₀ = 1 h，T_final = 3.5 h。在图2B中，展示了两个示例菌株的平均mCerulean荧光强度（上图）和mCherry生成速率（下图）随诱导剂浓度的变化。如图所示，阳性菌株的mCherry生成速率表现出明显的下调效应（

讨论

本文所述方法可实现对大肠杆菌（E. coli）细胞内RNA结合蛋白与RNA结合亲和力的定量体内测量。该实验方案相对简便，无需使用复杂仪器，且数据分析过程直接。此外，结果可立即获得，无需等待下一代测序（NGS）通常所需的较长时间。

该方法的一个局限性在于其仅适用于细菌细胞。然而，先前一项研究¹²已证明，在哺乳动物细胞中使用类似方法对L7AE RNA结合蛋白（RBP）同样可实现抑制效应。该方法的另一局限性在于，将结合位点插入mCherry起始区域可能会抑制mCherry的基础表达水平。结合位点的结构复杂性或高稳定性可能干扰核糖体的起始过程，即使在不存在RBP的情况下也会导致mCherry基础水平降低。若基础表达水平过低，则随着RBP浓度增加所带来的额外抑制效应将无法被观察到。在此情况下，建议设计结合位点盒时仍将结合位点置于起始区域，但靠近起始区域向延伸区域过渡的边界处（δ值在12−15 bp范围内^10,29

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素钠盐	SIGMA	A9518
硫酸镁（MgSO4）	ALFA AESAR	33337
48孔板	Axygen	P-5ML-48-C-S
8通道板	Axygen	RESMW8I
96孔板	Axygen	P-DW-20-C
用于酶标仪的96孔板	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
结合位点序列	Gen9 Inc. 和 Twist Bioscience		见表1
E. coli TOP10细胞	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
甘油	BIO LAB	071205
培养箱	TECAN	liconic incubator
硫酸卡那霉素	SIGMA	K4000
KpnI-HF	NEB	R0142
连接酶	NEB	B0202S
液体处理机器人系统	TECAN	EVO 100, MCA 96通道
Matlab分析软件	Mathworks
8通道多通道移液器	Axygen	BR703710
N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL）	cayman	K40982552 019
PBS缓冲液	Biological Industries	020235A
酶标仪	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart聚合酶	NEB	M0493
RBP序列	Addgene	27121 & 40650	见表2
氯化钠（NaCl）	BIO LAB	190305
SV凝胶和PCR纯化系统	Promega	A9281
胰蛋白胨	BD	211705