通过尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）对蛋白质进行表征

摘要

本方案描述了尺寸排阻色谱与多角度光散射联用技术（SEC-MALS），用于溶液中蛋白质及其复合物的绝对表征。SEC-MALS 可测定纯化蛋白质、天然寡聚体、异源复合物以及糖蛋白等修饰蛋白质的分子量和尺寸。

摘要

分析型尺寸排阻色谱法（SEC）常用于测定溶液中蛋白质及蛋白质-蛋白质复合物的分子量，是一种相对技术，依赖于待测物的洗脱体积来估算分子量。当蛋白质并非球状分子或在色谱柱中发生非理想相互作用时，基于蛋白质标准品建立的校准曲线将不再适用，由此通过洗脱体积确定的分子量也会出现错误。多角度光散射（MALS）是一种绝对测量技术，可通过基本物理方程直接测定溶液中待测物的分子量。将SEC用于分离与MALS用于分析相结合，构成了一种多功能且可靠的手段，可用于表征含有一种或多种蛋白质组分的溶液，包括单体、天然寡聚体或聚集体以及异源复合物。由于该测量在每一个洗脱体积下均可进行，SEC-MALS能够判断洗脱峰是否均一，并可区分固定的分子量分布与动态平衡状态。该方法还可用于分析修饰蛋白（如糖蛋白或脂蛋白）以及偶联物（如去垢剂增溶的膜蛋白）。因此，对于需要确认用于生物学或生物技术研究的分子之生物物理性质和溶液行为的蛋白质化学研究者而言，SEC-MALS是一项关键工具。本SEC-MALS实验方案用于分析纯化蛋白质单体及其聚集体的分子量和尺寸。所获得的数据可为后续更复杂的SEC-MALS分析（如复合物、糖蛋白及表面活性剂结合的膜蛋白分析）奠定基础。

引言

对溶液中蛋白质的分子量（MW）进行可靠分析是生物分子研究中的关键环节^1,2,3,4。分子量分析可帮助科研人员判断是否成功表达目标蛋白质，并确定其是否适用于后续实验^5,6。正如蛋白质研究网络P4EU⁷和ARBRE-Mobieu⁸网站所述，蛋白质质量控制不仅需要评估终产物的纯度，还需对其寡聚状态、均一性、身份、构象、结构、翻译后修饰及其他特性进行表征。

在非变性溶液中进行的分子量测定可确定蛋白质在水环境中存在的形式，即单体或寡聚体。尽管对于许多蛋白质而言，目标是获得其单体形式，但对于另一些蛋白质来说，特定的天然寡聚体形式才是其生物学活性的关键^9,10,11,12。其他非天然的寡聚体或聚集体会影响实验结果，导致X射线晶体学、核磁共振（NMR）或小角X射线散射等结构解析方法出现偏差，也会在功能检测中引发假象或误差，例如在等温滴定量热法或表面等离子共振技术用于定量分析结合能力时产生不准确结果^2,13。

对于单克隆抗体（mAbs）等生物治疗药物而言，基于溶液的分子量分析在质量控制和产品表征方面具有类似的重要作用。过量的聚集体和片段表明产品不稳定，不适合用于人体。监管机构不仅要求对治疗用分子进行细致表征，还要求对最终产品中可能存在的潜在降解产物进行充分分析^14,15,16,17。

分析蛋白质分子量（MW）最常用的方法包括十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、毛细管电泳（CE）、天然PAGE、质谱法（MS）、尺寸排阻色谱（SEC）和分析型超速离心（AUC）。其中，SDS-PAGE、CE和MS并非在蛋白质天然状态下进行，通常会导致寡聚体和聚集体解离，因此不适合用于确定天然寡聚状态或定量聚集体。尽管天然PAGE理论上可保持蛋白质的天然构象，但根据我们的经验，该方法对许多蛋白质难以优化，结果可靠性较差。AUC无论是通过沉降速度还是沉降平衡方式，均可实现定量分析，并能基于第一性原理确定分子量，但操作十分繁琐，需要大量人工操作、较高的数据分析专业知识、较长的实验时间以及昂贵的仪器设备。

分析型尺寸排阻色谱（SEC）是一种定量、相对稳健且简便的方法，可在大分子流经填充柱时实现分离。尺寸排阻色谱的原理与应用已在多篇综述^18，19，20以及手册《尺寸排阻色谱：原理与方法》²¹中得到充分阐述。保留时间的差异源于不同分子在从柱末端洗脱前，扩散进入并离开固定相孔隙所花费的时间不同。这种差异（理论上）源于分子的相对大小及其扩散系数²²。通过一系列参考分子构建校准曲线，将分子的分子量（MW）与洗脱体积关联起来。对于蛋白质而言，参考分子通常为行为良好的球状蛋白质，其不会通过电荷或疏水性表面残基与色谱柱发生相互作用。洗脱体积通过紫外（UV）吸光度检测器测定。若已知UV消光系数（通常由序列计算得出），也可对蛋白质峰的总质量进行定量。

值得注意的是，通过尺寸排阻色谱法（SEC）分析分子量（MW）依赖于对被测蛋白质的两个关键假设：1）它们与参考标准品具有相同的构象和比容（即扩散性质与分子量之间的关系相同）；2）与参考标准品类似，它们除了通过空间位阻效应外，不会以其他方式与色谱柱发生相互作用——即不会通过电荷或疏水相互作用吸附到色谱柱填料上。若偏离这些假设，校准曲线将失效，导致分子量测定结果错误。例如，内在无序蛋白质由于含有大量无结构区域，其斯托克斯半径较大^23,24；又如非球形或线性寡聚组装体¹⁰，均不符合上述假设。糖基化蛋白质的斯托克斯半径通常大于非糖基化形式，即使在考虑了所添加碳水化合物质量的情况下也是如此¹⁹。去垢剂增溶的膜蛋白的洗脱行为不同于校准用蛋白质，因为其在SEC中的洗脱取决于多肽-去垢剂-脂质复合物的总体尺寸，而非蛋白质的寡聚状态和摩尔质量^25,26。色谱柱的化学性质、pH值和盐浓度均会影响带有带电或疏水性表面残基的蛋白质的洗脱体积^27,28。

当尺寸排阻色谱（SEC）与多角度光散射（MALS）和差示折光指数（dRI）检测器联用时，其在分子量（MW）测定方面的适用性和可靠性显著提高^{3,4,11,29,30,31,32}。dRI 检测器通过检测分析物存在引起的溶液折光指数变化来确定其浓度。MALS 检测器则测量分析物相对于入射激光束在多个角度上的散射光比例。这种联用技术统称为 SEC-MALS，其测定分子量不依赖于洗脱时间，因为分子量可直接根据基本原理通过公式 1 计算得出，

  (1)

其中，M 为分析物的分子量，R(0) 为MALS检测器测定并外推至零角度的约化瑞利比（即分析物散射光强相对于激光强度的比值），c 为UV或dRI检测器测定的质量浓度，dn/dc 为分析物的折射率增量（本质上是分析物与缓冲液之间折射率的差值），K 为光学常数，其值取决于系统参数，如波长和溶剂的折射率²⁹。

在SEC-MALS中，SEC色谱柱仅用于分离溶液中的不同组分，使它们依次单独进入MALS和浓度检测器的流通池。实际保留时间对分析本身并无意义，其作用仅在于对蛋白质组分的分辨效果。仪器的校准独立于色谱柱，且不依赖于参考标准品。因此，SEC-MALS被视为基于基本物理方程的分子量（MW）测定的“绝对”方法。如果样品具有异质性且未能被色谱柱完全分离，则在每个洗脱体积下所得数值将代表流经流通池的每段时间切片（约75 μL）中各洗脱体积内分子的重量平均值。

通过分析散射强度的角度变化，多角度光散射（MALS）还可测定几何半径大于约12.5 nm的生物大分子和纳米颗粒的尺寸（均方根回转半径，R_g）²⁹。对于单体蛋白和寡聚体等较小的物质，可在MALS仪器上加装动态光散射（DLS）模块，以测量低至0.5 nm及以上的流体力学半径³³。

尽管紫外（UV）或示差折光（dRI）浓度分析均可用于获得公式1中的c值，但优先选择dRI出于两个原因：1）dRI是一种通用浓度检测器，适用于分析糖类或多糖等不含紫外发色团的分子³⁴；2）几乎所有纯蛋白在水相缓冲液中的浓度响应dn/dc值在1%至2%范围内相同（0.185 mL/g）³⁵，因此无需知晓其紫外消光系数。

SEC-MALS 在蛋白质研究中的应用非常广泛。最常见的用途是确定纯化后的蛋白质是单体还是寡聚体、其寡聚化程度，以及评估聚集体^{3,10,11,17,31,36,37,38}。对于无法通过传统方法表征的去垢剂溶解的膜蛋白，SEC-MALS 尤其具有重要价值，已有相关详细实验方案发表^{31,39,40,41,42,43}。其他常见应用包括确定糖蛋白、脂蛋白及类似偶联物的翻译后修饰程度和多分散性^{4,31,44,45,46,47}；检测异源复合物（如蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸及蛋白质-多糖复合物）的形成（或未形成）及其绝对化学计量（而非化学计量比）^{24,46,48,49,50,51,52}；测定单体-二聚体平衡解离常数^49,53,54；以及评估蛋白质构象^55,56。除蛋白质外，SEC-MALS 在肽段^57,58、高度异质性的天然聚合物（如肝素⁵⁹和壳聚糖^60,61）、小型病毒⁶²以及大多数类型的合成或加工聚合物^63,64,65,66的表征中也具有不可替代的价值。广泛的参考文献可参见相关文献⁶⁷及在线资源（网址：http://www.wyatt.com/bibliography）。

本文介绍了一种进行和分析SEC-MALS实验的标准方案。以牛血清白蛋白（BSA）为例，演示蛋白质单体和寡聚体的分离与表征。该BSA方案可确定某些系统常数，为后续的SEC-MALS分析（包括复合物、糖蛋白以及表面活性剂结合的膜蛋白）提供基础。

我们注意到，SEC-MALS 可使用来自多家供应商的标准高效液相色谱（HPLC）或快速蛋白液相色谱（FPLC）设备进行。本方案描述了一种在从事蛋白质研发的实验室中常见的 FPLC 系统的使用方法（参见材料表）。在运行本方案之前，应已完成 FPLC 系统、MALS 和 dRI 检测器的安装，并根据制造商的说明安装相应的控制、数据采集和分析软件，同时将必要的校准常数或其他设置参数输入软件中。应在泵和进样器之间安装一个带有亲水性、孔径为 0.1 µm 滤膜的在线过滤器。

方案

1. 系统的准备

1. 将MALS和dRI检测器连接在FPLC的UV检测器下游。绕过pH和电导检测器，因为它们会显著增加UV检测器与MALS检测器之间的检测器间体积。使用内径为0.25 mm的毛细管将色谱柱连接至各检测器之间，检测器出口则使用内径为0.75 mm的毛细管连接至废液或组分收集器。
2. 确保FPLC与各检测器之间的必要信号连接已建立，包括将UV检测器的模拟输出连接至MALS的模拟输入端口，以及通过FPLC的I/O盒将FPLC的数字输出连接至MALS的Autoinject接口。
3. 安装一根适用的分析型SEC色谱柱，其分离范围至少覆盖20 kDa至500 kDa。查阅产品信息，确认该色谱柱是否适用于样品及流动相的分子量范围、pH值及其他理化性质。

2. 缓冲液的配制、系统过夜冲洗及清洁度检查

1. 使用高效液相色谱级试剂，配制含 50 - 100 mM NaCl 的 1 L 磷酸盐缓冲液。使用瓶顶式聚醚砜滤器或类似装置将缓冲液过滤至 0.1 µm。先将前 50-100 mL 缓冲液过滤至废液瓶中并弃去，以去除干燥滤器中的颗粒物，然后将剩余缓冲液过滤至已用过滤去离子水彻底清洗并加盖以防止灰尘进入的洁净无菌瓶中。
   注意：如果需要分析在其他溶剂中溶解性更优的蛋白质，可使用 Tris 缓冲液等其他流动相溶剂。
2. 以 0.5 mL/min 的流速过夜冲洗，或按照色谱柱制造商的建议进行冲洗，使色谱柱在缓冲液中充分平衡并去除颗粒物。使用 FPLC 的连续流模式，并确保在所有 SEC-MALS 运行完成前流速不中断。
   1. 在过夜冲洗期间，将 dRI 流通池置于清洗模式。在开始样品进样前关闭清洗功能。
   2. 开始冲洗时，应逐步升高流速，以防止因色谱柱内压力突变导致的"柱脱屑"现象（或颗粒释放）。
   3. 若系统已知稳定且无颗粒，且已与目标流动相达到平衡，可用较短的 2-3 小时冲洗替代过夜冲洗。
3. 通过轻敲柱后端管路以释放积聚的颗粒，并观察 MALS 仪器前面板显示器上 90° 检测器的信号，检查系统清洁度。确认峰-峰值噪声不超过 50 -100 µV。
4. 进行一次“空白”进样，以确认进样器无颗粒污染。“空白”样品即为新配制于洁净无菌小瓶中的运行缓冲液。
   1. 若颗粒峰体积不超过 1 mL，且峰高不超过基线以上 5 mV，则系统已准备就绪可进行样品分析。否则，需重复进行空白进样直至系统清洁，或执行维护操作以清洁进样器。

3. 样品的制备与上样

1. 在SEC缓冲液中配制至少200 µL、浓度为1-2 mg/mL的BSA溶液。
   注意：为防止沉淀，切勿将BSA溶解于纯水中。
2. 使用注射器滤器将蛋白溶液过滤至0.02 µm。
3. 弃去滤液的前几滴，以去除干燥滤器中的颗粒物。
4. 或者，将样品在10,000 × g 条件下离心15分钟，使不溶性聚集体及其他大颗粒沉淀。
5. 将100 µL BSA溶液注入进样环。
   注意：此为推荐上样量，可根据样品的稳定性或可获得性适当增减。每次进样所需的蛋白量与其分子量成反比——若蛋白分子量为33 kDa（即BSA分子量的一半），则所需蛋白质量应为BSA的两倍。

4. MALS 软件的准备

1. 在 MALS 软件菜单的 方法 中打开 新建 | 实验，然后从 光散射 系统方法文件夹中选择 在线 方法。如果存在 DLS 检测器，请从 光散射 | 含 QELS 文件夹中选择 在线 方法。
2. 在 配置 部分，设置样品和流动相的参数。
   1. 在 通用泵 视图中，将流速设置为 FPLC 中使用的流速。
   2. 在 通用泵 视图的 溶剂 分支的 名称 字段中，选择 PBS。
   3. 在 进样器 视图的 样品 分支中，将 名称 输入为 BSA，并设置 dn/dc = 0.185（未修饰蛋白质的标准值），A2 = 0，紫外消光系数 = 0.667 mL/(mg-cm)。
      注：对于其他蛋白质，可在文献中查找其在 UV₂₈₀ nm 处的消光系数，或使用各种公共软件工具根据其序列进行计算。
3. 在 程序 部分的 基本采集 视图中，勾选 自动进样触发 复选框，并将运行时长设置为 70 分钟，以便在整个洗脱过程中采集数据，直至达到 SEC 柱的总渗透体积。
   注：所需时间可能因色谱柱和流速而异——对于一根标准的 7.8 mm × 300 mm HPLC-SEC 柱，在 0.5 mL/min 流速下需要采集 35 分钟。
4. 在 MALS 软件中点击 运行 按钮以启动实验。系统将在通过 MALS 检测器接收到 FPLC 仪器的脉冲信号后开始读取数据。
5. 点击仪器前面板上的 自动调零 按钮，对 dRI 信号进行调零。

5. FPLC 软件的准备

1. 在 FPLC 软件中，进入手动 | 执行手动指令 | 设置标记，输入蛋白名称和运行编号。
2. 在流路 | 进样阀下，将进样阀从手动上样切换至进样。
3. 在I/O 模块 | 脉冲数字输出中插入一个 0.5 秒的脉冲信号，以触发 MALS 软件中的数据采集。

6. 将样品注入进样环。在FPLC软件中点击“执行”以开始实验运行。

7. SEC-MALS BSA 数据分析

1. 在 MALS 软件的 Procedures 部分中，逐步执行分析。
   1. 通过检查 Basic Collection 视图，确认在 UV、MALS 和 RI 中的峰出现在大约相同的洗脱体积处。
   2. 在 Baseline 视图中，为所有信号（所有 LS 检测器、UV 和 dRI）定义基线。基线应指示纯溶剂的水平，最好从样品峰的一侧延伸至另一侧。
   3. 在 Peaks 视图中，通过单击并拖动鼠标来定义要分析的峰。选择每个峰的中心 50% 区域。首先选择单体峰（“Peak 1”），然后选择二聚体峰（“Peak 2”）。验证 BSA 在每个峰下的 dn/dc = 0.185 和 UV 280 nm 消光系数 = 0.667 的值是否正确。
2. 执行峰对齐、峰展宽校正和归一化操作。
   注：通常，SEC-MALS 方法会定期使用一种均分散蛋白（如 BSA 单体）进行校准，以实现峰对齐、峰展宽校正以及将角度检测器相对于 90° 检测器进行归一化，该蛋白的回转半径 R_g < 10 nm。在本示例中，BSA 既作为校准分子，也是分子量分析的对象。
   1. 在 Procedures | Alignment 视图中，通过单击并拖动鼠标选择峰的中心区域，点击 Align Signals，然后点击 OK。
   2. 在 Procedures | Band Broadening 视图中，选择单体峰的中心 50% 区域。确保将 RI 检测器指定为 Reference Instrument，然后点击 Perform Fit 和 Apply，以使 UV 和 LS 信号与 RI 信号匹配。
      1. 放大峰区域，确认它们在中心 50–70% 范围内高度重叠，然后点击 OK。
      2. 如果重叠不完全，可能需要再次执行拟合并 "Apply" 一到两次，直到重叠效果良好。
   3. 在 Procedures | Normalization 视图中，选择 Peak 1，输入 3.0 nm 作为 R_g 值，点击 Normalize，然后点击 OK。
   4. 在 Procedures | Molar Mass and Rg from MALS 视图中，查看数据以确定哪些检测角度由于噪声过大应从分析中取消选择。通常，这些是低角度方向，其中灰尘颗粒散射出相对高强度的光。从右侧图中选择峰内的单个片段，并在左侧图中查看逆约化瑞利比的角依赖性。如果最低（有时也包括最高）角度持续显著偏离拟合曲线，则从视图底部的列表中取消选择这些角度。
3. 在 EASI Graph 视图中查看结果图。从窗口顶部的 Display 下拉菜单中选择 Molar Mass。使用 Ctrl + 单击并拖动以放大峰区域。
4. 在 Results | Report (summary) 视图下的 Peak Results | Molar mass moments (g/mol) | Mw 中查看单体和二聚体峰的最终加权平均分子量结果。纯度信息位于 Peak Results | Mass fraction(%) 下。
   注：其他分子量矩也已显示；这些通常适用于异质聚合物，而不适用于具有离散尺寸的蛋白质。软件生成的许多其他结果也可包含在报告中，例如质量回收率百分比（通过浓度检测器洗脱的蛋白占注入量的比例）、峰统计值、多分散性、R_g 和 R_h 矩等。当提供不确定性度量时，其反映的是基于测量序列内噪声对所引用数值的精密度，不应视为代表准确性。报告值的真实准确性取决于多种因素，例如提供的 dn/dc 和消光系数值的准确性、仪器校准等。
5. 从 File 菜单中选择 Save as Method，将已分析的 BSA 数据保存为未来所有类型蛋白质测量的标准方法。针对 BSA 确定的归一化和峰展宽参数将在后续分析中沿用。

结果

图 1a、b 显示，BSA 的三种寡聚形式（单体、二聚体和三聚体）在 200 Å 孔径的色谱柱上实现了良好分离，其中单体与二聚体达到基线分离；而 图 2a 显示，在 75 Å 孔径色谱柱上的分离未能实现良好的单体-二聚体分辨。后一示例被纳入以说明一种“较差”的结果；根据制造商提供的分离范围，这两种色谱柱在分离效果上的差异实际上是可预期的。三聚体与二聚体未能完全分离，更高阶的寡聚体之间以及与三聚体之间也未能良好分离。图 2b 是一个光散射信号噪声较大且在整个色谱图中存在颗粒物的示例，这阻碍了分子量的准确测定。

此后，我们将重点关注 图 1b单体在13.8分钟时洗脱，表现出重均摩尔质量 M_w 64.1 ± 0.4 kDa（通过MALS测定）及流体动力学半径 R_h 3.54 ± 0.01 nm。这些结果与牛血清白蛋白（BSA）的序列质量（66.4 kDa）和已知的流体动力学半径（3.5 nm）相符。⁶⁸，通常在SEC-MALS的5%误差范围内^3,69二聚体在12分钟时洗脱，表现出 M_w 127 ± 1 kDa（通过MALS测定，与实验精度范围内的单体分子量的两倍相符） R_h 5.68 ± 0.06 nm。三聚体峰还在11分钟时被观察到 M_w 由MALS测定为194 ± 9 kDa，约为单体分子量的三倍，与预期一致，在实验精度范围内。 R_h 由于DLS信号强度较低，无法确定三聚体的尺寸。

在整个单体峰范围内计算的摩尔质量点之间差异在2-5%以内，表明样品均一。常可观察到拖尾肩峰，其摩尔质量范围为38-50 kDa，对应于牛血清白蛋白（BSA）片段⁷⁰。二聚体和三聚体峰的摩尔质量点不均一，表明存在异质性。二聚体峰的异质性部分源于少量三聚体渗入二聚体峰，而三聚体峰的异质性则是由于未能很好分离的更高阶寡聚体共洗脱所致。

在所有三个信号中，单体峰的信噪比均相当理想，超过100:1，二聚体峰的信噪比也达到40:1，符合要求。色谱图中除蛋白峰以外的区域基线平坦，仅在LS信号中靠近全排阻（空体积）处出现由颗粒物引起的峰，以及在dRI信号中靠近全渗透体积处出现一个（正向）盐峰和一个（负向）溶解空气峰。这些峰已在图1a中指出。

纯度水平也可通过SEC-MALS实验进行计算：报告中单体峰的质量分数代表单体形式的纯度百分比。对于BSA单体，计算得到的纯度为88%。

图 1：使用 200 Å 孔径的尺寸排阻色谱柱对牛血清白蛋白（BSA）进行 SEC-MALS 分析。色谱图曲线已相对于单体峰归一化，并为清晰起见进行了偏移。（A）指出了可忽略的常见伪影，包括光散射信号起始处附近的颗粒峰，以及折射率信号在总渗透体积附近出现的盐峰和溶解空气峰。（B）色谱图显示出优异的单体-二聚体-三聚体分离效果，且光散射信号具有高信噪比。单体和二聚体的分子量值表现出高度均一性。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：低质量 SEC-MALS 分析示例。 色谱图曲线已相对于单体峰归一化，并为清晰起见进行偏移。（A） 在孔径为 75 Å 的尺寸排阻色谱柱上分离效果不佳；8–9 分钟之间的颗粒峰与蛋白质峰未充分分离。（B） 光散射（LS）信号中明显表现出信噪比不足，且在蛋白质附近存在大量颗粒。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

SEC-MALS 实验实现了单体、二聚体和三聚体的良好分离，并对每个峰的摩尔质量及流体力学尺寸提供了定量结果。这进而能够清晰地鉴定和表征每一种存在的组分，同时量化其纯度。通常，所获得的结果准确度在 5% 以内，精密度和重复性在 1–2% 以内^3,69。如此高的精密度和重复性使得我们能够可靠地区分分子量相近的组分，只要它们在 SEC 中得以分离（即使在同一峰内存在部分重叠）。该方法在蛋白质质量控制和基础生物物理表征方面的优势显而易见。

验证无颗粒物存在对于灵敏且可重复的SEC-MALS测量至关重要。颗粒物峰通常表现为较大的MALS信号，而无相应的UV或RI信号。应仔细制备流动相和样品，以消除此类颗粒。建议使用HPLC级或更高级别的试剂，将流动相和稀释缓冲液过滤至0.1 - 0.2 µm（使用前先冲洗滤膜，以去除干膜表面始终存在的颗粒），为SEC-MALS专用准备超洁净的流动相瓶及其他玻璃器皿，并在流动条件下延长色谱柱平衡时间（以去除在流速停止或色谱柱未使用期间可能积聚的颗粒物和聚集体）。样品应过滤至不截留目标物质的最小孔径，通常不超过0.1 µm，若条件允许，应使用0.02 µm。若滤膜迅速堵塞，可对样品进行离心处理、采用逐级递减孔径的多步过滤，和/或重新纯化。当系统始终使用高质量、新鲜且经过过滤的流动相，避免色谱柱受到冲击，样品保持洁净且不吸附于色谱柱时，测量结果将不会出现上述颗粒物噪声，并可获得高质量数据。

MALS 对蛋白质常用的 SEC 缓冲液无特殊要求；除 PBS 外，还可使用多种其他缓冲体系，包括多种辅料，以优化分离效果和稳定性⁷¹MALS 对具体色谱柱的选择不敏感，色谱柱应根据最佳分离效果和回收率进行选择。对于辅料而言，分析中的主要关注点是其折射率的显著变化，这会导致特定折射率增量的改变。 dn/dc，以及在需要紫外分析时会吸收280 nm波长的辅料。例如，精氨酸是一种常见的减少聚集的辅料，可能显著影响 dn/dc 典型蛋白质的，甚至使其进入负值范围（一种具有负值的蛋白质） dn/dc 如果仍可通过SEC-MALS进行分析 dn/dc 由经验确定，但如果 dn/dc = 0 时，蛋白质散射的光强度将为零，分子量分析将无法进行）。关于该主题的 dn/dc 关于蛋白质的值，赵 et al. 进行了广泛讨论。³⁵ 其中显示，对于标准水性缓冲液，绝大多数未经修饰的蛋白质的数值在标准值（在 = 660 nm 时为 0.185 或 0.186 mL/g）的 2–3% 范围内，但分子量低于约 10 kDa 的蛋白质变异性较大，且有少数种类可能高达 0.21 mL/g。

在所提供的数据中，BSA 单体和二聚体峰的分子量（MW）分布均表现出高度均一性，偏差在 2% 或以内，表明为单一分散的物种。峰内分子量数值不均匀可能源于样品异质性或分析不当。特别是，若 BSA 的分子量分布呈凹形（“微笑”状）或凸形（“皱眉”状），可能是由于未正确应用峰展宽校正所致。对于其他蛋白质，凸形分布也可能源于单体与寡聚体之间的动态平衡，此时单体与寡聚体的比例——以及因此表现出的表观分子量值——依赖于峰内浓度（BSA 不表现出此行为，常被用作对照样品以验证峰展宽参数的正确性）。若分子量分布从峰前沿到峰拖尾存在变化，且不随样品浓度改变，则通常表明存在分子量物种的分布，这些物种在尺寸排阻色谱（SEC）中仅被部分分离。通过注入不同总量的蛋白质，可轻易区分动态平衡与其他导致表观非均一性分布的原因：在动态平衡情况下，分布会随进样量变化，而在固定分布或峰展宽校正错误的情况下则不会变化。

根据上述限制，SEC-MALS 不适用于多种任务。它不适合分析粗提样品；样品应通过标准的亲和层析和精细纯化方法进行充分纯化。该方法的准确性和分辨能力不足以识别质量相同或非常接近的蛋白质或单克隆抗体（mAb）的突变体和变体，也不能用于在SEC柱上不洗脱或无法分离的分析物。不过，最近已有研究表明，可将离子交换色谱或反相色谱与MALS联用，以分离和表征SEC无法分辨的物质^72,73,74。当蛋白质样品量严重受限时，SEC-MALS可能不可行，因为该方法通常需要10 - 200 µg³的样品量，而在内径大于0.25 mm的FPLC系统中可能需要更多样品；然而，使用UHPLC-SEC-MALS可分析更少量的样品。对于在接触流动相后易于聚集的高度不稳定蛋白质，SEC-MALS也不适用，但通过离线动态光散射优化缓冲液条件，可能克服这一问题⁷⁵。

尽管SEC-MALS需要额外的操作步骤，但它在蛋白质研究中具有不可估量的价值，已被学术界和生物制药领域广泛使用。除了表征单体、寡聚体和聚集体（如上述实验方案所述）之外，SEC-MALS还可用于表征修饰蛋白，例如糖蛋白（分别测定蛋白质和糖链组分的分子量）、经表面活性剂或脂质增溶的膜蛋白（分别测定蛋白质和增溶剂组分的分子量）、病毒样颗粒等蛋白质组装体、蛋白质-蛋白质复合物和蛋白质-核酸复合物、多糖、蛋白质-多糖偶联物、多肽以及许多其他生物大分子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	快速蛋白液相色谱仪（FPLC）
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC 控制软件
ASTRA	Wyatt Technology		多角度光散射（MALS）数据采集与分析软件
牛血清白蛋白（纯度 >97%）	Sigma	A1900	分析物
DAWN 或 miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 或 WTREOS	多角度光散射（MALS）检测器
Increase 200 10/300	GE Healthcare		尺寸排阻色谱柱，200 Å 孔径，内径 10 mm，长度 300 mm
Optilab	Wyatt Technology	WTREX	差示折光指数（RI）检测器
氯化钠 NaCl	Sigma	71382	高效液相色谱级 NaCl
Stericup 瓶顶滤器 聚醚砜 0.1 µm 1000 mL	Millipore	SCVPU11RE	流动相过滤器
Whatman Anotop 10 注射器滤器 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	样品过滤器
Whatman Anotop 10 针头式滤器，0.1 µm 孔径，直径 10 mm	GE Healthcare	6809-1012	样品过滤器
Whatman Anotop 25 注射器滤器 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	流动相过滤器
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	动态光散射检测器