我们介绍一种通过在核糖体中特异性地对血管内皮细胞（ECs）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）进行基因标记，并结合RNA纯化方法，直接从小鼠脑、肺和心脏组织中纯化核糖体结合的mRNA的技术。
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本文内容
摘要
摘要
许多研究局限于使用体外细胞实验，或从动物体内分离特定细胞类型，进而通过qPCR和RNA测序对转录组和基因表达进行体外分析。针对复杂组织和器官中特定细胞类型的全面转录组与基因表达分析，对于理解基因调控的细胞与分子机制及其与组织稳态和器官功能之间的关联至关重要。本文以动物肺部血管内皮细胞为例，展示一种直接在活体（in vivo）条件下分离核糖体结合RNA的技术方法。本文将详细描述组织处理和RNA纯化的具体材料与操作步骤，包括RNA质量与得率的评估，以及用于促动脉生成基因检测的实时qPCR分析。该方法被称为翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）技术，可广泛应用于在复杂组织中直接对特定细胞类型进行活体基因表达和转录组分析。
引言
在哺乳动物脑、心脏和肺等复杂组织中，细胞的高度异质性使得基于全组织样本获得的基因表达数据的分析变得复杂。为了在体内观察特定细胞类型的基因表达谱，近年来开发出一种新方法，可对任意遗传学定义的细胞类型中全部正在翻译的mRNA进行检测。该方法被称为翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）技术1,2。当该技术与在动物体内遗传操控其他血管生成相关基因的方法相结合时，成为研究内皮细胞生物学和血管生成的有力工具。
我们已证明，促血管生成的PKD-1信号通路以及促血管生成基因CD36的转录对内皮细胞（EC）的分化和功能性血管生成至关重要3,4,5,6。为了阐明促血管生成和代谢信号在基因转录及内皮细胞转分化中的分子机制，我们基于TRAP技术构建了基因工程化的TRAP小鼠，特异性地删除了促血管生成相关基因1,2。此外，在我们的TRAP动物模型中，不仅在血管内皮中特异性缺失pkd-1或cd36基因或全身性缺失cd36基因，而且还将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在遗传上标记至内皮细胞的翻译核糖体上。TRAP技术可实现从靶组织血管内皮中直接亲和纯化与核糖体结合的mRNA，从而能够在体内条件下直接分析基因表达，并鉴定与内皮细胞分化和血管生成相关的新转录组。我们已成功从这些基因工程动物的内皮细胞中分离出与核糖体结合的RNA。所纯化的RNA可用于进一步表征调控内皮细胞分化与功能的促血管生成或促动脉生成基因。本方案提供了在体内直接从内皮细胞中分离mRNA的TRAP技术的逐步操作指南。
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方案
对于动物实验，本文所述所有方法均已获得威斯康星医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 准备试剂
- 配制裂解缓冲液，使其含有 10 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM DTT、100 µg/mL 环己酰亚胺、蛋白酶抑制剂以及重组 RNase 抑制剂，各成分浓度如下所述。
- 将以下试剂加入 500 mL 无 RNase 的去离子水中：1.19 g HEPES、5.59 g KCl、0.24 g MgCl2、35 mg DTT、0.5 mL 环己酰亚胺，根据需要加入 NaOH 调节 pH 至 7.4，再加入无 EDTA 的蛋白酶抑制剂（每 10 mL 加一片小片剂）和 RNase 抑制剂（10 µL/mL）。
- 置于 4 °C 冰箱中保存，可保存长达 1 个月。
- 配制高盐多聚核糖体洗涤缓冲液，使其含有 10 mM HEPES（pH 7.4）、350 mM KCl、5 mM MgCl2、1% vol/vol CA-630、0.5 mM DTT 和 100 µg/mL 环己酰亚胺。
- 将以下试剂加入 500 mL 无 RNase 的去离子水中：1.19 g HEPES、13.05 g KCl、0.24 g MgCl2、5 mL 非离子型非变性去垢剂、5 管 7.7 mg 的 DTT 和 0.5 mL 环己酰亚胺，根据需要加入 NaOH 调节 pH 至 7.4。
- 置于 4 °C 冰箱中保存，可保存长达 1 个月。
- 在开始实验前，将抗 GFP 抗体与 Protein G 磁珠结合。
- 将 10 µg 抗 GFP 抗体溶于 200 µL PBS 中，加入 Protein G 磁珠。
- 室温下以翻转混匀方式孵育 10 分钟。
- 将磁珠置于磁力架上，吸除上清液。
- 用 200 µL PBS 重悬磁珠，置于 4 °C 冰箱中保存，可保存长达 1 周。
- 配制含 100 µg/mL 环己酰亚胺的冰冻 PBS。
- 将 1 体积环己酰亚胺溶液（100 mg/mL）加入 999 体积的冰冻 PBS 中。
2. 分离并裂解目标组织
- 通过腹腔注射戊巴比妥（500 mg/kg体重）和赛拉嗪（10 mg/kg体重）处死小鼠，并分离所需组织（例如心脏、肺）。立即进行下一步操作。
- 将所需组织放入含有环己酰亚胺（100 µg/mL）的500 µL冰浴PBS中。
- 使用电动匀浆器或小间隙玻璃匀浆器将组织研磨成细胞悬液。若使用电动匀浆器，匀浆时间应限制在1分钟以内，且保持低频率（<15,000 Hz），以避免RNA变性。
- 通过反复吹吸，用200 µL裂解缓冲液重悬细胞沉淀。随后在小间隙玻璃匀浆器中进行10次抽吸，或在电动匀浆器中以低频率（<15,000 Hz）匀浆15秒，进一步均质化细胞悬液。
- 在4 °C条件下，以2,000 × g离心10分钟，沉淀细胞核和大颗粒细胞碎片，保留上清液。
- 向上清液中加入非离子性、非变性去污剂至终浓度1%（v/v），并加入DHPC至终浓度30 mM。冰上孵育5分钟。
- 以16,000 × g离心10分钟，沉淀不溶性物质。转移并保留15%澄清裂解液作为输入样本，用于后续步骤。
3. 分离核糖体/mRNA 复合物
- 向细胞裂解物上清液中加入 50 µL 抗体结合的磁珠，并在 4 °C 下以翻转旋转方式孵育 30 分钟。在此步骤中，抗 GFP 抗体将结合 GFP 标记的核糖体，从而允许我们进一步分离这些核糖体中的 RNA。
- 将磁珠置于磁力架上收集，并用高盐多聚核糖体洗涤缓冲液洗涤 5 次。
- 当磁珠吸附至管壁一侧后，吸出并弃去液体。随后用移液器反复吹打 200 µL 高盐多聚核糖体洗涤缓冲液数次。重复此步骤 5 次，最后一次洗涤后弃去全部缓冲液。立即进入下一步操作。
4. 分离 mRNA
- 将珠子放入RLT缓冲液中。以下步骤直接来自RNeasy mini试剂盒说明书，未作任何扩展。
注意：RLT缓冲液含有胍盐；切勿与漂白剂混合。 - 在4 °C条件下，以13,000 rpm或16,000 g离心裂解液3分钟。用移液器小心吸取350 µL上清液，并转移至新的微量离心管中。后续步骤中仅使用此上清液（裂解液）。
- 向微量离心管中加入等体积的70%乙醇。
- 将最多700 µL样品（包括可能形成的任何沉淀）转移至置于2 mL收集管中的离心柱中。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去穿流液。
- 向离心柱中加入350 µL RW1缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去穿流液，并在下一步中重复使用该收集管。
注意：RW1缓冲液含有胍盐；切勿与漂白剂混合。 - 向离心柱中加入350 µL RW1缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒。弃去穿流液。
- 向离心柱中加入500 µL RPE缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心15秒，以洗涤离心柱膜。弃去穿流液。
- 向离心柱中加入500 µL RPE缓冲液。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心2分钟，以洗涤离心柱膜。然后小心地将离心柱从收集管中取出，确保柱子不接触穿流液。
- 将离心柱放入一个新的2 mL收集管中，并丢弃含有穿流液的旧管。轻轻盖上盖子，并在最大转速下离心1分钟，以去除残留缓冲液。
- 将离心柱放入一个新的1.5 mL收集管中。直接向离心柱膜上加入30–50 µL无RNase水。轻轻盖上盖子，并在≥8,000 × g条件下离心1分钟，以洗脱RNA。
- 若预期RNA产量>30 µg，则使用另30–50 µL无RNase水重复步骤4.10，或使用步骤4.10的洗脱液（如需高浓度RNA）。重复使用步骤4.10中的收集管。
- 将纯化的RNA用于下游分析，如RNA测序或实时定量PCR，或将溶解于无RNase H2O中的RNA在-80 °C保存最多1年。
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结果
我们之前的研究4,7表明，CD36可能通过LPA/PKD-1信号通路发挥调节微动脉分化和毛细血管动脉化的作用。为了研究LPA/PKD-1-CD36信号轴是否在体内动脉生成过程中至关重要，我们建立了新型的TRAP小鼠品系，这些品系不仅具有全身性cd36缺失、内皮细胞特异性cd36缺失或pkd-1缺失，还可通过GFP特异性分离cre标记细胞谱系中与核糖体结合的RNA，并可用作cre激活的荧光报告系统2。
通过基因分型分析，我们观察到在内皮特异性 cd36 基因敲除小鼠中，cd36 基因在全身或血管内皮中被完全删除（数据未显示），同时 pkd-1 基因也在血管内皮中被删除。图1 展示了构建成功的全身性 cd36 TRAP 小鼠或内皮特异性 pkd-1 TRAP 小鼠品系的代表性结果。利用免疫荧光显微镜，我们证实了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在体内被遗传标记至内皮细...
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讨论
血管生成是一个复杂的多步骤过程，其中内皮细胞（EC）特异性的血管生成相关基因的转录与表达在EC分化及血管生成重编程中起着至关重要的作用3,4。为了克服细胞多样性及结构复杂性带来的障碍，从而更深入地在活体水平上从分子层面理解哺乳动物血管系统的功能，我们利用Pu实验室开发的通用型floxed TRAP小鼠模型或EGFP-TRAP小鼠2，结合其他基因工程小鼠品系，构建了EC特异性的TRAP小鼠模型，并进一步获得了EC特异性的cd36缺失、EC特异性的pkd-1缺失或全身性的cd36缺失小鼠。该模型可在活体条件下，针对EC特异性的pkd-1缺失或全身性cd36基因表达缺失情况，检测完整组织中血管内皮细胞全部翻译中的mRNA谱系8，这对于研究与生理性和病理性血管生成相关的基因转录具有重要意义4
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
Ren博士的研究工作得到了美国心脏协会（13SDG14800019；BR）、Ann's Hope基金会（FP00011709；BR）、美国癌症协会（86-004-26；MCW癌症中心至BR）以及美国国立卫生研究院（HL136423；BR）的资助；Jordan Palmer得到了2018年MCW CTSI 500 Stars实习项目的资助；P. Moran得到了美国国家心肺血液研究所机构研究培训基金（5T35 HL072483-34）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 使用纳米芯片和皮升芯片的2100电泳生物分析仪 | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| 细胞刮刀 | Sarstedt | 83.1832 | |
| 匀浆器 | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| 磁力架（Dynamag-2） | Invitrogen | 123-21D | 取决于纯化规模；1.5 mL离心管中的样品可使用DynaMag-2进行浓缩 |
| 微型离心机 | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C分光光度计 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| 制冷离心机 | Eppendorf | 5430R | 配备适用于1.5 mL微量离心管的转子 |
| 无RNase的1.5 mL微量离心管 | Applied Biosystems | AM12450 | |
| 无RNase的50 mL锥形管 | Applied Biosystems | AM12501 | |
| 无RNase的1000-μL滤芯吸头 | Rainin | RT-1000F | |
| 无RNase的200-μL滤芯吸头 | Rainin | RT-200F | |
| 无RNase的20-μL滤芯吸头 | Rainin | RT-20F | |
| 匀浆器用转子 | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator，Labquake品牌 | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
参考文献
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
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重印与许可
