体内内皮细胞RNA分离的核糖体亲和纯化（TRAP）技术

摘要

我们介绍一种通过在核糖体中特异性地对血管内皮细胞（ECs）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）进行基因标记，并结合RNA纯化方法，直接从小鼠脑、肺和心脏组织中纯化核糖体结合的mRNA的技术。

摘要

许多研究局限于使用体外细胞实验，或从动物体内分离特定细胞类型，进而通过qPCR和RNA测序对转录组和基因表达进行体外分析。针对复杂组织和器官中特定细胞类型的全面转录组与基因表达分析，对于理解基因调控的细胞与分子机制及其与组织稳态和器官功能之间的关联至关重要。本文以动物肺部血管内皮细胞为例，展示一种直接在活体（in vivo）条件下分离核糖体结合RNA的技术方法。本文将详细描述组织处理和RNA纯化的具体材料与操作步骤，包括RNA质量与得率的评估，以及用于促动脉生成基因检测的实时qPCR分析。该方法被称为翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）技术，可广泛应用于在复杂组织中直接对特定细胞类型进行活体基因表达和转录组分析。

引言

在哺乳动物脑、心脏和肺等复杂组织中，细胞的高度异质性使得基于全组织样本获得的基因表达数据的分析变得复杂。为了在体内观察特定细胞类型的基因表达谱，近年来开发出一种新方法，可对任意遗传学定义的细胞类型中全部正在翻译的mRNA进行检测。该方法被称为翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）技术^1,2。当该技术与在动物体内遗传操控其他血管生成相关基因的方法相结合时，成为研究内皮细胞生物学和血管生成的有力工具。

我们已证明，促血管生成的PKD-1信号通路以及促血管生成基因CD36的转录对内皮细胞（EC）的分化和功能性血管生成至关重要^3,4,5,6。为了阐明促血管生成和代谢信号在基因转录及内皮细胞转分化中的分子机制，我们基于TRAP技术构建了基因工程化的TRAP小鼠，特异性地删除了促血管生成相关基因^1,2。此外，在我们的TRAP....

方案

对于动物实验，本文所述所有方法均已获得威斯康星医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 准备试剂

1. 配制裂解缓冲液，使其含有 10 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl₂、0.5 mM DTT、100 µg/mL 环己酰亚胺、蛋白酶抑制剂以及重组 RNase 抑制剂，各成分浓度如下所述。
   1. 将以下试剂加入 500 mL 无 RNase 的去离子水中：1.19 g HEPES、5.59 g KCl、0.24 g MgCl₂、35 mg DTT、0.5 mL 环己酰亚胺，根据需要加入 NaOH 调节 pH 至 7.4，再加入无 EDTA 的蛋白酶抑制剂（每 10 mL 加一片小片剂）和 RNase 抑制剂（10 µL/mL）。
   2. 置于 4 °C 冰箱中保存，可保存长达 1 个月。
2. 配制高盐多聚核糖体洗涤缓冲液，使其含有 10 mM HEPES（pH 7.4）、350 mM KCl、5 mM MgCl₂、1% vol/vol CA-630、0.5 mM DTT 和 100 µg/mL 环己酰亚胺。
   1. 将以下试剂加入 500 mL 无 RNase 的去离子水中：1.19 g HEPES、13.05 g KCl、0.24 g MgCl_2<....

结果

我们之前的研究^4,7表明，CD36可能通过LPA/PKD-1信号通路发挥调节微动脉分化和毛细血管动脉化的作用。为了研究LPA/PKD-1-CD36信号轴是否在体内动脉生成过程中至关重要，我们建立了新型的TRAP小鼠品系，这些品系不仅具有全身性cd36缺失或内皮特异性cd36或pkd-1缺失，还可通过GFP特异性分离cre标记细胞谱系中与核糖体结合的RNA，并可用作cre激活的荧光报告系统²。

通过基因分型分析，我们观察到在内皮特异性 cd36 基因敲除小鼠中，cd36 基因在全身或血管内皮中被完全删除（数据未显示），同时 pkd-1 基因也在血管内皮中被删除。图1 展示了构建成功的全身性 cd36 TRAP 小鼠或内皮特异性 pkd-1 TRAP 小鼠品系的代表性结果。利用免疫荧光显微镜，我们证实了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在体内被遗传标记至内皮细胞的核糖.......

讨论

血管生成是一个复杂的多步骤过程，其中内皮细胞（EC）特异性的血管生成相关基因的转录与表达在EC分化及血管生成重编程中起着至关重要的作用^3,4。为了克服细胞多样性及结构复杂性带来的障碍，从而更深入地在活体水平上从分子层面理解哺乳动物血管系统的功能，我们利用Pu实验室开发的通用型floxed TRAP小鼠模型或EGFP-TRAP小鼠²，结合其他基因工程小鼠品系，构建了EC特异性的TRAP小鼠模型，并进一步获得了EC特异性的cd36缺失、EC特异性的pkd-1缺失或全身性的cd36缺失小鼠。该模型可在活体条件下，针对EC特异性的pkd-1缺失或全身性cd36基因表达缺失情况，检测完整组织中血管内皮细胞全部翻译中的mRNA谱系⁸，这对于研究与生理性和病理性血管生成相关的基因转录具有重要意义⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
使用纳米芯片和皮升芯片的2100电泳生物分析仪	Agilent	G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
细胞刮刀	Sarstedt	83.1832
匀浆器	Fisher Scientific	K8855100020
磁力架（Dynamag-2）	Invitrogen	123-21D	取决于纯化规模；1.5 mL离心管中的样品可使用DynaMag-2进行浓缩
微型离心机	Fisher Scientific	05-090-100
NanoDrop 2000C分光光度计	Thermo Scientific	ND-2000C
制冷离心机	Eppendorf	5430R	配备适用于1.5 mL微量离心管的转子
无RNase的1.5 mL微量离心管	Applied Biosystems	AM12450
无RNase的50 mL锥形管	Applied Biosystems	AM12501
无RNase的1000-μL滤芯吸头	Rainin	RT-1000F
无RNase的200-μL滤芯吸头	Rainin	RT-200F
无RNase的20-μL滤芯吸头	Rainin	RT-20F
匀浆器用转子	Yamato	LT-400D
Tube rotator，Labquake品牌	Thermo Fisher	13-687-12Q