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人类囊胚活检与玻璃化冷冻

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DOI：

10.3791/59625

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2019年7月26日

 ,  ,  ,  , 
1G.EN.E.R.A. Centers for Reproductive Medicine, 2DAHFMO, Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome

本文内容

摘要

囊胚活检和玻璃化冷冻对于高效开展胚胎植入前遗传学检测至关重要。该方法在授精后第5至7天，依次打开透明带并获取7-8个滋养层细胞，可最大限度减少所需操作次数，并降低胚胎暴露于非最佳环境条件下的风险。

摘要

囊胚活检用于在进行胚胎植入前遗传学检测的体外受精周期中获得可靠的遗传学诊断。随后，理想的流程应包括安全且高效的玻璃化冷冻方案，以适应诊断技术的周转时间，并在后续自然周期中将筛选出的胚胎移植至生理状态的子宫内膜。一种包含依次打开透明带并获取5-10个滋养层细胞（理想为7-8个）的活检方法，可最大限度减少所需操作步骤以及胚胎暴露于非最佳环境条件的时间。经过适当培训后，不同操作者在活检耗时（约8分钟，根据每皿活检胚胎数量，范围为3-22分钟）、获得明确诊断率（约97.5%）以及冷冻-解冻后整倍体囊胚移植后的活产率（>40%）方面均能实现技术的可重复性。活检后经玻璃化冷冻及解冻的胚胎存活率高达99.8%。解冻后1.5小时的再扩张率达到97%，该指标在很大程度上取决于活检与玻璃化冷冻之间的时间间隔（理想情况下≤30分钟）、囊胚形态学质量以及活检时所处的发育天数。通常建议冷冻已塌陷的囊胚；因此，在非PGT周期中，可采用激光辅助人工收缩技术，以在冷冻保存前诱导胚胎塌陷。最具前景的未来发展方向是在囊胚培养后对体外受精培养液进行非侵入性分析，以获取潜在的胚胎DNA来源。然而，这一前沿技术仍处于研究阶段，尚需建立并验证可靠的实验方案。

引言

现代人类胚胎学的主要目标是最大化每个促排卵周期的活产婴儿数量，并降低实现妊娠所需的成本、时间和精力。为实现这一目标，应采用经过验证的胚胎筛选方法，以在体外受精（IVF）周期中获得的一组胚胎内识别出具有生殖能力的胚胎。根据最新的证据，囊胚培养1结合全面染色体检测以及冷冻-解冻后的整倍体胚胎移植（ET），是提高IVF效率的最有效策略2。显然，染色体非整倍性检测需要获取胚胎样本，目前主要通过从滋养外胚层（TE）取出少量细胞获得，即囊胚中在妊娠期间发育为胚胎附属结构（如胎盘）的部分。除了核型分析外，还可通过对TE活检样本进行单基因突变检测，作为称为胚胎植入前遗传学检测（PGT；-A代表非整倍体，-SR代表染色体结构重排，-M代表单基因病）的临床策略的一部分。在过去几十年中，其他卵母细胞/胚胎活检方法也被提出并应用于临床，主要包括极体活检和卵裂球活检。然而，由于这些方法在操作上的缺点（例如工作量较大及对生殖潜力的潜在影响）以及诊断上的局限性（例如单细胞分析存在的问题），其当前应用已显著减少，因其在成本、风险与收益之间难以实现充分平衡（详见综述3）。

本文详细描述了滋养层细胞活检（TE活检）的主要操作方案之一，以及后续所需的玻璃化冷冻、复温和移植步骤。此处概述的工作流程非常适合工作量较大的胚胎植入前遗传学检测（PGT）实验室。

正如我们课题组先前已报道的4,5，该操作包括依次打开完全扩张囊胚的透明带，并移除少量滋养层细胞（平均7-8个）。与第3天激光辅助孵化为基础的囊胚活检方法相比6，该操作可能有助于减轻体外受精（IVF）中心每日的工作安排压力，因为在IVF中心中，囊胚活检和玻璃化冷冻等精细操作必须在特定时间点及时完成。一旦囊胚达到完全扩张状态，即可选择待移除的滋养层细胞进行活检，从而避免内细胞团（ICM）疝出的风险，否则将使操作变得困难。文献中还描述了第三种囊胚活检方案，即在胚胎已发育至囊胚阶段后数小时、活检前实施激光辅助孵化5,7。然而，这种方法更为耗时，主要适用于仅由经验有限的操作人员开展滋养层活检、且每日工作量中等或偏低的IVF中心。

如果旨在进行体外受精（IVF）中的遗传学分析，胞浆内单精子注射（ICSI）8 应成为一项成熟的技术。同样，建立一个合适的培养体系，以安全地将胚胎培养至囊胚阶段，对于实施滋养层活检策略至关重要。为此，充足的培养箱数量以及采用低氧张力环境是关键前提，以避免影响囊胚形成率9。同时，还需要一个高效的胚胎冷冻保存程序，以安全地管理一次植入前遗传学检测（PGT）周期。在过去十年中，玻璃化冷冻技术的应用使胚胎冷冻复苏存活率提高至>99%10,11。这为遗传学检测提供了充足的时间，并可将胚胎移植推迟至下一个月经周期，在未进行激素刺激且可能更具容受性的子宫内膜环境中进行12。

滋养层细胞活检和玻璃化冷冻均为技术要求较高的操作，需要严格的技术能力，且不同经验水平的操作者之间其效果可能存在差异。因此，在允许每位操作者正式开展临床操作前，应进行专门的培训；此外，应通过定期监测冷冻保存和活检操作的关键绩效指标（KPI）来评估操作者技能的持续保持情况。各辅助生殖中心应为此设立内部KPI，且这些指标应接近国际协作组公布的标准和/或权威实验室发表的结果。

本单位已验证了滋养层细胞活检、玻璃化冷冻-复温及见证程序，这些技术已在所有相关操作人员中实现标准化，相关结果此前已在三篇出版物中报道11,13,14。

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方案

本文所述的人类囊胚活检方案遵循G.EN.E.R.A.人类研究伦理委员会的指导原则。

注意：所需材料请参见材料表。其他必需材料包括实验室用鞋及服装、外科口罩、头套、外科手套、永久性无毒记号笔、镊子和消毒剂。为防止污染风险，必须穿戴手术服、一次性外科手套、口罩和头套。所有工作区域以及操作过程中涉及的设备在开始任何步骤前，必须使用实验室消毒剂（例如 Oosafe）彻底清洁。所有使用的耗材和培养基应为无菌且单独包装或分装。建议使用专用的工作站进行活检和套管操作，并仅限参与该操作的人员（胚胎学家和见证人）进入该区域。

1. 活检手术前一天的准备工作

  1. 准备活检后培养皿。
    1. 在IVF培养皿中放置6滴20 µL的IVF培养基（材料表），并覆盖6 mL预热的用于胚胎培养的矿物油（材料表）。
    2. 向每滴中再添加10 µL IVF培养基。在37 °C、控制气体环境（5% O2，6% CO2）中孵育过夜。
  2. 准备一个4孔IVF培养板，用于囊胚活检后的清洗。
    1. 在前两个孔中各加入600 µL IVF培养基，并覆盖300 µL预热的用于胚胎培养的矿物油。
    2. 在37 °C、控制气体环境（5% O2，6% CO2）中孵育过夜。
  3. 将1.5 µL的上样溶液（材料表）分装至每个用于滋养外胚层细胞收集的PCR管中，离心后置于4 °C保存。

2. 活检手术当日的准备工作

  1. 准备活检培养皿。
    1. 在IVF培养皿中依次放置3滴10 µL HEPES缓冲液（添加人血清白蛋白）（材料表）。
    2. 根据可用囊胚数量重复步骤1.1.1（每皿最多4个囊胚），并覆盖6 mL预热的矿物油用于胚胎培养。
    3. 在进行活检操作前，将培养皿于37 °C孵育至少1小时。

3. 囊胚筛选与评级

  1. 根据囊胚的扩张程度以及内细胞团（ICM）和滋养层（TE）的形态学特征对囊胚进行评级（图1）。
    注意：     评级标准参考 Gardner 和 Schoolcraft15 的方法，并已由 Capalbo 等人和 Cimadomo 等人先前描述过4,11。
    1. 定义囊胚大小和扩张等级：A 表示完全孵化的囊胚，B 表示正在孵化的囊胚，C 表示完全扩张的囊胚，D 表示未扩张的囊胚（此类胚胎仅在发育至第7天仍未进一步扩张时进行活检）。
    2. 定义 ICM 等级：1 级表示具有多个紧密排列细胞的明显内细胞团；2 级表示可识别，但细胞数量较多且排列松散；3 级表示难以分辨，仅含极少数低质量细胞。
    3. 定义 TE 等级如下：1 级表示结构良好、细胞数量较多的上皮层；2 级表示结构松散、细胞较少的上皮层；3 级表示细胞稀少和/或存在少量大而低质量的细胞。

4. 滋养层活检

  1. 对所有存活的完全扩张囊胚进行滋养外胚层（TE）活检（建议囊胚大小和扩张程度为C级）。
  2. 每次活检操作前设置好持卵和活检吸管。活检吸管的推荐参数如下：内径30 µm，弯曲角度35°，尖端至弯曲处距离0.75 mm。
  3. 在活检培养皿上标注患者信息（女性姓名、姓氏、出生日期和身份证号），并用胚胎编号和周期编号标记每个液滴。使用无毒的永久性记号笔。
  4. 使用300 µm剥取吸管将囊胚转移至活检培养皿的第一个液滴中，清洗以去除多余的培养基，然后将囊胚移至活检培养皿的第二个液滴中。
  5. 将培养皿移至倒置显微镜下，并从活检培养皿的第三个液滴中吸取少量培养基，以预充活检吸管。
  6. 在20倍放大倍数下，调整囊胚方向，使其内细胞团（ICM）清晰可见。当ICM位于7点钟位置（与拟去除TE细胞的区域相对）时，用持卵吸管固定胚胎（图2a）。
  7. 聚焦于透明带，确认活检吸管、持卵吸管和囊胚处于同一焦平面。
  8. 切换至激光物镜（脉冲时间0.3 ms，光斑直径6.5 µm），将激光光点定位在透明带中与ICM相对的一侧。通过2−3次激光脉冲在透明带上打孔（图2b）。
  9. 轻轻将活检吸管抵住透明带，并通过破口吹入少量培养基，使TE细胞从其内表面脱离，促进囊胚塌陷（图2c）。
  10. 当TE细胞脱离后（图2d），通过孔洞进入（如有需要，可用最后一次激光脉冲扩大孔径），轻柔抽吸少量TE细胞（理想数量为7−8个13,16）进入活检吸管（图2e）。
  11. 在施加适度负压的同时，轻微向后移动活检吸管，拉伸目标细胞（图2f）。
  12. 将激光对准吸出细胞中最薄的部位，在细胞间连接处发射2−5次激光脉冲，以将目标细胞从胚胎本体上分离（图2g）。激光脉冲的时序和次数可根据囊胚质量进行调整，但应尽量减少以避免细胞裂解。
  13. 在TE片段与囊胚分离后（图2h），将其释放至同一活检液滴中远离囊胚的位置。此举可防止其再次被吸入活检吸管（图2i）。
  14. 从持卵吸管释放囊胚，并迅速抬高两根吸管，防止片段粘附其上。
  15. 拍摄活检片段图像，用于质量控制（图3）。
    注意：若每次操作需对多个囊胚进行活检（每培养皿最多四个），应更换为新的活检吸管，以防止胚胎间交叉污染。
  16. 重复步骤4.1−4.13。
  17. 将活检培养皿移回超净工作台。
  18. 在活检后培养皿上标注夫妇编号，并为每个液滴标注胚胎编号和周期编号。
  19. 在见证人存在的情况下，用清洁的IVF培养基清洗囊胚，最后将其转移至活检后培养皿中对应的液滴内。
  20. 将活检后培养皿移入培养箱，在受控气氛中（37 °C，6% CO2，5% O2）保存直至玻璃化冷冻。建议在活检后30分钟内完成玻璃化冷冻，以防止囊胚重新扩张。

5. 导管

注意：整个操作过程必须在见证人在场的情况下，于室温下的生物安全柜中进行。操作过程中，将PCR管置于冰上的冷藏管架中（补充图1）。

  1. 使用永久性无毒标记笔标记PCR管。
    注意：标记应按照遗传学实验室的要求进行。通常包括患者姓名和姓氏（首字母缩写）、夫妇编号、胚胎编号及周期编号（例如：JD 12345 1.2，表示夫妇编号为12345的Jane Doe的第2个周期中的第1个胚胎）。胚胎编号还应以字母形式标注在管体上。
  2. 在60 mm × 15 mm培养皿（取样皿）的盖子上标记活检胚胎的编号（补充图1），并在其中制备两滴10 µL的活检洗涤液（材料表）。
  3. 用取样皿中第二滴洗涤液对140 µm剥离移液管（补充图1）进行预润。
  4. 将活检皿置于体视显微镜下，以便清晰观察滋养外胚层（TE）片段。
  5. 轻轻将部分活检洗涤液释放至TE片段上方，然后将其吸入剥离移液管中。
  6. 将TE片段转移至取样皿中的第二滴活检洗涤液中，并仔细冲洗2−3次。
  7. 用加样液将TE片段转移至PCR管底部（此前已标记），注意避免剥离移液管尖端接触管壁。
  8. 对每个TE片段重复步骤5.3至5.7，注意每次使用新的毛细管。
  9. 完成取样操作后，将所有PCR管放入微型离心机中，短暂离心数秒。
  10. 将样本储存于-20 °C，直至运送至指定遗传学实验室进行检测。

6. 胚泡玻璃化冷冻

  1. 在滋养外胚层活检后30分钟内对塌陷的囊胚进行玻璃化冷冻，以防止其重新扩张。
  2. 在玻璃化冷冻板上标注女性的个人信息及需要冷冻的囊胚编号。
  3. 在玻璃化冷冻载体上标注女性的姓名、姓氏、夫妻编号、将要加载的胚胎编号以及操作日期。需使用特殊的冷冻标签，此类标签即使在极低温度（-196 °C）下也能保持完整。
  4. 在室温下，为每个将要玻璃化冷冻的囊胚分配0.3 mL的平衡液（ES）（材料表）。
  5. 在见证人存在的情况下，使用300 µm剥离吸管将囊胚转移至ES中。
  6. 将囊胚置于ES中13−15分钟。在经历初始体积收缩后，可观察到其逐渐重新扩张。
  7. 在小型冷却架中加入液氮（LN2），并将其放置于超净工作台下方。
  8. 在第二孔中加入300 μL玻璃化冷冻液（VS）（材料表）。待囊胚完全重新扩张后，将其转移至VS溶液中1分钟，并进行冲洗以稀释ES。
  9. 在见证人存在的情况下，将囊胚加载至玻璃化冷冻载体上，并注意去除多余的VS。囊胚周围应保留一层薄薄的溶液膜。
  10. 迅速将玻璃化冷冻载体浸入LN2中，并用力晃动，以降低样品附近形成气泡的风险。
  11. 在保持玻璃化冷冻载体浸没于LN2中的同时，安装保护帽。
  12. 在见证人存在的情况下，将玻璃化冷冻载体转移至长期储存用的LN2储存罐中。

7. 非活检囊胚的人工收缩

  1. 若不进行滋养层活检，则在玻璃化冷冻前立即人工塌陷囊胚（图4）。
    1. 将培养皿从培养箱转移至倒置显微镜下，聚焦于选定的胚胎。
    2. 切换至激光物镜（预设脉冲参数：0.3 ms，6.5 μm），将靶点定位在内细胞团（ICM）对侧的透明带处，然后在远离内细胞团的安全距离下，对滋养层细胞间的连接处施加1–2次激光脉冲。囊胚应在5分钟内塌陷。
  2. 按照第6节所述步骤对塌陷后的囊胚进行玻璃化冷冻。

8. 可移植囊胚解冻

  1. 移植日当天，通过在每个孔中加入600 µL预平衡的IVF培养基来准备ET 4孔板。在进行囊胚复温的同时，将该板置于37 °C、控制气体环境（5% O2，6% CO2）的培养箱中孵育。
  2. 在复温培养皿上标记女性的姓名、姓氏、夫妇编号以及将要复温的胚胎编号。
  3. 将1 mL解冻液（TS）（材料表）加入一个IVF单孔培养皿中（补充图1），并在开始操作前将其置于恒温器中加热至37 °C，至少预热1小时。
  4. 用液氮（LN2）填充一个小的冷却支架，并将其放置在超净工作台内靠近操作区域的位置。
  5. 操作开始前，核对玻璃化冷冻支架上标注的囊胚信息。所有编号必须与遗传学报告一致，且所选复温的囊胚应为可移植的胚胎。操作过程中需有见证人在场。
  6. 将含有已预热TS的单孔培养皿从恒温器中取出，并置于体视显微镜下的加热载物台上。
  7. 使用镊子在液氮（LN2）中移除保护帽。
  8. 迅速将玻璃化冷冻支架的尖端浸入37 °C的TS中。
  9. 在显微镜下观察，轻轻移动玻璃化冷冻支架，直至囊胚从尖端释放。
  10. 让囊胚在TS中停留总共1分钟，注意保持其位于TS液滴底部。
  11. 在室温下，将200 μL稀释液（DS）（材料表）加入玻璃化冷冻板的第一个孔中。
  12. 将囊胚转移至DS中，并将其置于孔底，同时在上方释放少量TS，以形成一定的浓度梯度。静置3分钟。
  13. 在两个不同的孔中分别加入200 μL洗涤液（WS）（WS1和WS2）。
  14. 将囊胚转移至WS1，并将其置于孔底，同时在上方释放少量DS。随后将囊胚转移至WS2，并静置1分钟，期间避免扰动。
  15. 在复温后的ET培养板上标记女性的姓名、姓氏、夫妇编号以及将要培养的胚胎编号。
  16. 在见证人在场的情况下，将复温后的囊胚转移至复温后ET板中已预平衡的培养基中。
  17. 在ET板的第一个孔中冲洗囊胚，然后将其移至第二个孔中。
  18. 将复温后的培养皿转移至培养箱中，在控制气体环境（37 °C，6% CO2，5% O2）下培养至少1.5小时，之后检查囊胚的存活情况及再扩张程度。
    注意： 图5展示了退化、冷冻后存活但未再扩张以及冷冻后存活且完全再扩张的囊胚示例。

9. 胚胎移植

  1. 进行胚胎移植（ET）时，将培养皿置于超净台的加热台上，使胚胎在低倍显微镜下可见。
  2. 吸取约 0.4 mL 的体外受精（IVF）培养液。将注射器针头牢固插入内导管的接收端，然后推出培养液至 0.1 mL 刻度处。
  3. 吸取培养液，直至在导管中观察到胚胎进入（培养液最小量：10−15 μL）。
  4. 将导管放回塑料保护套中，移至手术室，再将内导管插入外引导管中。
  5. 到达子宫后，推动注射器活塞以释放胚胎。缓慢推出培养液，直至活塞刻度显示为 0.1 mL。
  6. 将导管送回实验室，在显微镜下检查确认胚胎已完全移出。

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结果

图6 展示了可用于标准化操作流程并监控每位操作人员表现的活检操作各项结果的示意图。主要的操作结果是完成单次或多重复活检所需的时间；主要的技术结果是遗传检测后所获得图谱的质量，其结果可能为明确诊断或无法确诊，后者需对未确诊的囊胚进行再次活检；主要的生物学结果是囊胚在解冻后复苏与重新扩张的比率，相对于退化的情况；最后，主要的临床结果是经玻璃化冷冻-解冻后囊胚移植的活产率。在之前三项研究中，我们已报告了本中心（或多个中心）所定义的技术、生物学和临床结果的关键绩效指标（KPI）11,13,16。本文则进一步说明如何定义活检操作耗时这一KPI。此外，还探讨了活检与玻璃化冷冻之间的时间间隔对整倍体囊胚解冻后行为的潜在影响。

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讨论

只有完成培训期且经验丰富的熟练胚胎学家才能进行滋养层细胞活检（TE活检）和囊胚玻璃化冷冻。此外，操作过程中必须有见证人监督，以确保以下步骤的可追溯性：i）活检后囊胚从活检培养皿（补充图1）转移至活检后培养皿（补充图1），再转移至玻璃化冷冻板（补充图1），最后转移至玻璃化冷冻载体（补充图1）；ii）将活检所得的滋养层细胞从活检培养皿转移至PCR管（补充图1）；iii）诊断完成后的复苏和移植步骤。有关所有见证步骤的详细说明，请参见先前发表的失效模式与影响分析（FMEA）14。

本文所描述的所有方法均遵守当地法规（意大利法律40/2004）。根据该法律，夫妇可要求获知其在体外受精周期中所产生胚胎的健康状况。为此，双方必须签署一份关于胚胎植入前遗传学检测（PGT）的详细知情同意书。

本文介绍了如何在繁忙的实验室日常工作中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

AG 和 RM 收集了数据并起草了手稿。DC 分析了数据，撰写了代表性结果部分，进行了统计分析，并对手稿进行了修改。FMU 和 LR 对结果及整篇手稿提出了关键性讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
冷冻管架BiocisionXTPCR96
电子移液器控制器Fisher Scientific710931
Flexipet 可调节手柄套装CookG18674剥除针固定器
Gilson PipetmanGilson66003p20
IVF 电子核对系统CooperSurgical Fertility & Genomic SolutionsRI Witness ART 管理系统
倒置显微镜NikonEclipse TE2000-U
层流罩IVF TECHA级气流
激光物镜RISaturn 5
显微注射仪Nikon NarishigeNT-88-V3
PCR管用小型离心机EppendorfCSLQSPIN适用于0.2 mL PCR管
体视显微镜LeicaLeica M80
恒温箱PanasonicMCO-5AC-PE
三气培养箱PanasonicMCO-5M-PE02/CO2
耗材
活检移液管RI7-71-30FB35720内径30 µm，平口，35 °C
CryolockCryolockCL-R-CT
CSCM 完全培养基Irvine Scientific90165添加HSA的IVF培养液
胚胎移植导管CookG17934
Flexipet 移液管CookG26712140µm 剥除针头
Flexipet 移液管CookG46020300µm 剥除针头
固定移液管RI7-71-IH35/20内径30 µm，平口，35 °C
人血清白蛋白Irvine Scientific9988
IVF 单孔培养皿Falcon353653
胚胎培养用矿物油Irvine Scientific9305
改良HTF培养基Irvine Scientific90126HEPES缓冲液
Nuclon Delta 表面培养皿Thermofisher scientific176740带滑动盖的4孔IVF培养皿
Primaria 细胞培养皿Corning35380260 mm x15 mm
ReproplateKitazato83016
血清移液管Falcon35755110ml
无菌一次性Gilson吸头Eppendorf0030 075.021200 µL
管路套件由遗传实验室提供PCR管（0.2 mL）、上样液、活检洗涤液
玻璃化冷冻液KitazatoVT801平衡液和玻璃化冷冻液
复温液KitazatoVT802解冻液和稀释液

参考文献

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