人类囊胚活检与玻璃化冷冻

摘要

囊胚活检和玻璃化冷冻对于高效开展胚胎植入前遗传学检测至关重要。该方法在授精后第5至7天，依次打开透明带并获取7-8个滋养层细胞，可最大限度减少所需操作次数，并降低胚胎暴露于非最佳环境条件下的风险。

摘要

囊胚活检用于在进行胚胎植入前遗传学检测的体外受精周期中获得可靠的遗传学诊断。随后，理想的流程应包括安全且高效的玻璃化冷冻方案，以适应诊断技术的周转时间，并在后续自然周期中将筛选出的胚胎移植至生理状态的子宫内膜。一种包含依次打开透明带并获取5-10个滋养层细胞（理想为7-8个）的活检方法，可最大限度减少所需操作步骤以及胚胎暴露于非最佳环境条件的时间。经过适当培训后，不同操作者在活检耗时（约8分钟，根据每皿活检胚胎数量，范围为3-22分钟）、获得明确诊断率（约97.5%）以及冷冻-解冻后整倍体囊胚移植后的活产率（>40%）方面均能实现技术的可重复性。活检后经玻璃化冷冻及解冻的胚胎存活率高达99.8%。解冻后1.5小时的再扩张率达到97%，该指标在很大程度上取决于活检与玻璃化冷冻之间的时间间隔（理想情况下≤30分钟）、囊胚形态学质量以及活检时所处的发育天数。通常建议冷冻已塌陷的囊胚；因此，在非PGT周期中，可采用激光辅助人工收缩技术，以在冷冻保存前诱导胚胎塌陷。最具前景的未来发展方向是在囊胚培养后对体外受精培养液进行非侵入性分析，以获取潜在的胚胎DNA来源。然而，这一前沿技术仍处于研究阶段，尚需建立并验证可靠的实验方案。

引言

现代人类胚胎学的主要目标是最大化每个促排卵周期的活产婴儿数量，并降低实现妊娠所需的成本、时间和精力。为实现这一目标，应采用经过验证的胚胎筛选方法，以在体外受精（IVF）周期中获得的一组胚胎内识别出具有生殖能力的胚胎。根据最新的证据，囊胚培养¹结合全面染色体检测以及冷冻-解冻后的整倍体胚胎移植（ET），是提高IVF效率的最有效策略²。显然，染色体非整倍性检测需要获取胚胎样本，目前主要通过从滋养外胚层（TE）取出少量细胞获得，即囊胚中在妊娠期间发育为胚胎附属结构（如胎盘）的部分。除了核型分析外，还可通过对TE活检样本进行单基因突变检测，作为称为胚胎植入前遗传学检测（PGT；-A代表非整倍体，-SR代表染色体结构重排，-M代表单基因病）的临床策略的一部分。在过去几十年中，其他卵母细胞/胚胎活检方法也被提出并应用于临床，主要包括极体活检和卵裂球活检。然而，由于这些方法在操作上的缺点（例如工作量较大及对生殖潜力的潜在影响）以及诊断上的局限性（例如单细胞分析存在的问题），其当前应用已显著减少，因其在成本、风险与收益之间难以实现充分平衡（详见综述³）。

本文详细描述了滋养层细胞活检（TE活检）的主要操作方案之一，以及后续所需的玻璃化冷冻、复温和移植步骤。此处概述的工作流程非常适合工作量较大的胚胎植入前遗传学检测（PGT）实验室。

方案

本文所述的人类囊胚活检方案遵循G.EN.E.R.A.人类研究伦理委员会的指导原则。

注意：所需材料请参见材料表。其他必需材料包括实验室用鞋及服装、外科口罩、头套、外科手套、永久性无毒记号笔、镊子和消毒剂。为防止污染风险，必须穿戴手术服、一次性外科手套、口罩和头套。所有工作区域以及操作过程中涉及的设备在开始任何步骤前，必须使用实验室消毒剂（例如 Oosafe）彻底清洁。所有使用的耗材和培养基应为无菌且单独包装或分装。建议使用专用的工作站进行活检和套管操作，并仅限参与该操作的人员（胚胎学家和见证人）进入该区域。

1. 活检手术前一天的准备工作

1. 准备活检后培养皿。
   1. 在IVF培养皿中放置6滴20 µL的IVF培养基（材料表），并覆盖6 mL预热的用于胚胎培养的矿物油（材料表）。
   2. 向每滴中再添加10 µL IVF培养基。在37 °C、控制气体环境（5% O₂，6% CO₂）中孵育过夜。
2. 准备一个4孔IVF培养板，用于囊胚活检后的清洗。
   1. 在前两个孔中....

结果

图6 展示了活检操作所有可能结果的示意图，可用于标准化操作流程并监测每位操作人员的表现。主要的操作结果是完成单次或多轮活检所需的时间；主要的技术结果是遗传检测后所得图谱的质量，其结果可能为明确诊断或无法明确诊断，后者需要对未确诊的囊胚进行再次活检；主要的生物学结果是解冻后囊胚的冷冻存活率与再扩张率相对于退化率；最后，主要的临床结果是经玻璃化冷冻-解冻后囊胚移植的活产率。在之前的三项研究中，我们已报告了本中心针对技术、生物学和临床结果所定义的关键绩效指标（KPI）^11,13,16。本文则重点报告活检时间这一KPI是如何定义的。此外，还探讨了活检与玻璃化冷冻之间的时间间隔对整倍体囊胚解冻后行为的潜在影响。

在2年.......

讨论

只有完成培训期且经验丰富的熟练胚胎学家才能进行滋养层细胞活检（TE活检）和囊胚玻璃化冷冻。此外，操作过程中必须有见证人监督，以确保以下步骤的可追溯性：i）活检后囊胚从活检培养皿（补充图1）转移至活检后培养皿（补充图1），再转移至玻璃化冷冻板（补充图1），最后转移至玻璃化冷冻载体（补充图1）；ii）将活检所得的滋养层细胞从活检培养皿转移至PCR管（补充图1）；iii）诊断完成后的复苏和移植步骤。有关所有见证步骤的详细说明，请参见先前发表的失效模式与影响分析（FMEA）¹⁴。

本文所描述的所有方法均遵守当地法规（意大利法律40/2004）。根据该法律，夫妇可要求获知其在体外受精周期中所产生胚胎的健康状况。为此，双方必须签署一份关于胚胎植入前遗传学检测（PGT）的详细知情同意书。

本文介绍了如何在繁忙的实验室日常工作中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
冷冻管架	Biocision	XTPCR96
电子移液器控制器	Fisher Scientific	710931
Flexipet 可调节手柄套装	Cook	G18674	剥除针固定器
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF 电子核对系统	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART 管理系统
倒置显微镜	Nikon	Eclipse TE2000-U
层流罩	IVF TECH		A级气流
激光物镜	RI	Saturn 5
显微注射仪	Nikon Narishige	NT-88-V3
PCR管用小型离心机	Eppendorf	CSLQSPIN	适用于0.2 mL PCR管
体视显微镜	Leica	Leica M80
恒温箱	Panasonic	MCO-5AC-PE
三气培养箱	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
耗材
活检移液管	RI	7-71-30FB35720	内径30 µm，平口，35 °C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM 完全培养基	Irvine Scientific	90165	添加HSA的IVF培养液
胚胎移植导管	Cook	G17934
Flexipet 移液管	Cook	G26712	140µm 剥除针头
Flexipet 移液管	Cook	G46020	300µm 剥除针头
固定移液管	RI	7-71-IH35/20	内径30 µm，平口，35 °C
人血清白蛋白	Irvine Scientific	9988
IVF 单孔培养皿	Falcon	353653
胚胎培养用矿物油	Irvine Scientific	9305
改良HTF培养基	Irvine Scientific	90126	HEPES缓冲液
Nuclon Delta 表面培养皿	Thermofisher scientific	176740	带滑动盖的4孔IVF培养皿
Primaria 细胞培养皿	Corning	353802	60 mm x15 mm
Reproplate	Kitazato	83016
血清移液管	Falcon	357551	10ml
无菌一次性Gilson吸头	Eppendorf	0030 075.021	200 µL
管路套件	由遗传实验室提供		PCR管（0.2 mL）、上样液、活检洗涤液
玻璃化冷冻液	Kitazato	VT801	平衡液和玻璃化冷冻液
复温液	Kitazato	VT802	解冻液和稀释液