基于数字PCR的竞争指数用于高通量分析细菌适应性 沙门菌

摘要

这种基于分子的方法通过量化独特的基因组DNA条形码，可精确且准确地检测微生物，从而评估细菌的适应性。该方案描述了计算沙门氏菌（Salmonella）菌株竞争指数的方法；然而，该技术可轻松适用于需要对任何遗传上可改造的生物体进行绝对定量的各种实验方案。

摘要

竞争指数是一种用于评估细菌适应性及/或毒力的常用方法。该方法的优势在于操作简便，并能够将多种菌株的适应性标准化至野生型生物体。然而，该技术受限于可用的表型标记以及可同时检测的菌株数量，因而需要进行大量重复实验。伴随实验数量的增加，基于表型标记对细菌进行定量所耗费的人力与材料成本也不容忽视。为了在保留该方法优点的同时克服上述缺点，我们开发了一种基于分子生物学的方法，通过在细菌染色体上构建遗传标记，实现对微生物的直接定量。独特的25个碱基对DNA条形码被插入到野生型和突变型沙门氏菌（Salmonella）染色体的非必需位点。体外竞争实验采用混合菌株组成的接种物进行。竞争结束后，利用数字PCR对每种菌株的绝对数量进行定量，并据此计算各菌株的竞争指数。我们的数据表明，该方法在定量沙门氏菌（Salmonella）时具有极高的灵敏度、准确性和精确性，能够有效检测高丰度（高适应性）和稀有（低适应性）的微生物。此外，该技术可轻松适用于几乎所有染色体可被修饰的生物体，以及需要对微生物进行绝对定量的多种实验设计。

引言

评估病原体的适应性与毒力是微生物学研究的基本方面。它能够对不同菌株或突变体之间进行比较，使研究人员得以确定特定条件下某些基因的重要性。传统上，毒力评估采用动物感染模型，通过使用不同细菌菌株并观察感染动物的结果（例如感染剂量₅₀, 致死剂量₅₀死亡时间、症状严重程度、无症状 等等）。该方法可提供有关毒力的宝贵信息，但需要待测菌株在感染结果上与野生型产生显著差异，才能检测出其变异。此外，该方法的结果为半定量性质，因为尽管疾病进展和症状严重程度可随时间进行主观量化，但与野生型相比的毒力评估仍以定性为主（即毒力更强、更弱或相当）。进行动物感染实验的一种常见替代方法是构建竞争指数（competitive indices, CIs），该数值通过混合感染直接比较待测菌株与其野生型对应菌株的适应性或毒力。¹该技术通过将毒力标准化至野生型菌株并确定可量化的减毒程度指标，在诸多方面优于传统的动物感染模型。此外，该技术还可通过测定抵消竞争指数（COI）来分析细菌中的基因相互作用。²计算一组突变生物体的协同感染指数（COI），可帮助研究人员判断两个基因是独立地参与致病过程，还是共同参与同一条毒力通路并相互依赖。此外，竞争指数（CI）的计算需要对细菌进行计数，这能够为微生物的致病机制提供有价值的见解。CI 和 COI 还使研究人员能够评估那些不引起临床疾病的无毒力菌株，尽管其不致病，但仍可能存在适合度....

方案

1. 将独特的DNA条形码整合到含有等位基因交换所需组分的质粒上

注意： 与现有的 pKD13 等位基因交换质粒相比，新构建了一种名为 pSKAP 的质粒，其拷贝数更高，转化效率也有所提升。该过程详见步骤 1.1–1.12（图 1）。包含独特 DNA 条形码及等位基因交换元件的最终质粒可通过质粒库获取（材料表）。

1. 使用商业质粒小提试剂盒纯化 pKD13¹⁴ 和 pPCR Script Cam SK⁺ 来自在补充了的Luria-Bertani（LB）肉汤中培养的过夜细菌培养物 50 μg/mL 卡那霉素或 25 μg/mL 氯霉素（分别用于 pKD13 和 pPCR Script Cam SK+）(表 1).
2. 使用商品化的限制性内切酶HindIII和BamHI，按照生产商的说明书对两种质粒进行限制性酶切消化。
3. 从 pPCR Script Cam SK 中去除限制性内切酶和切除的 DNA⁺ 反应并使用市售 DNA 纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化 3,370 碱基对（bp）的质粒骨架。
4. 使用电泳槽在1%琼脂糖凝胶上分离pKD13限制性消化后的片段。....

结果

使用该方法需要进行适当的对照反应，以验证用于识别目标 DNA 的每种探针的灵敏度和特异性。在此代表性实验中，我们使用八种相应的探针对八种独特的 DNA 条形码进行了验证。所有八种探针在非模板对照（NTC）和阴性对照反应中均表现出较低的假阳性率（表 3），表明即使在高度相似的 DNA 序列中也具有良好的特异性。为了评估每种条件的灵敏度，将含有独特条形码的基因组 DNA（gDNA）在含有其余七种条形码序列之一的恒定背景 gDNA 中进行连续稀释。采用上述方法，数字 PCR 能够在近 2,000,000 条相似 DNA 序列的背景下，准确区分低至 2 个拷贝的 gDNA（表 3）。

除了确定每种探针和DNA条形码序列的灵敏度与特异性外，验证研究中进行的系列稀释还允许我们根据所得数据计算模拟的竞争指数。尽管本实验并无真实意义上的输入或输出，但可将数据视为竞争实验的结果进行分析。为此，我们将每个.......

讨论

准确量化微生物的能力对微生物学研究至关重要，而从初始混合种群中计数特定菌株的能力已被证明是评估细菌适应性与毒力特征的宝贵工具。然而，实现这一目标的技术发展速度并未跟上分子生物学领域的现代进展。对包括伤寒沙门菌（S. Typhimurium）在内的多种细菌染色体进行简便修饰的技术已有近二十年的历史¹⁴，但该技术极少被用于通过独特的DNA序列对菌株进行分子标记。通过利用在细菌染色体上插入独特且干扰极小的DNA条形码，从而构建出易于识别的菌株，并结合最先进的分子标识物检测与定量技术（即数字PCR），我们建立了一套系统，可在复杂的细菌种群中对单个菌株进行高灵敏度、高特异性、高准确性和高精确度的简便定量。

如上所述，计算竞争指数（CI）和竞争输出指数（COI）依赖于能够准确地对细菌染色体进行相应的修饰。所有修饰均应通过Sanger测序进行验证，以确保未发生随机突变。使用高保真聚合酶可将此类错误降至最低，但任何发生的突变都会影响对该菌株的检测能力，这是本实验方案的另一个关键方面。尽管我们已证明数字PCR能够在近200万的背景中检.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	22600028	可从任意制造商处采购
16 mL 培养管	MidSci	8599	可从任意制造商处采购
5–200 μL 移液器吸头	RAININ	30389241	更换其他品牌吸头时需谨慎，应基于制造质量进行评估
5–50 μL 多通道移液器	RAININ	17013804	使用其他多通道移液器时需谨慎
琼脂糖	ThermoFisher Scientific	BP160-500	可从任意制造商处采购
BLAST 分析	NCBI	N/A	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch 梯度PCR仪配备96孔深孔反应模块	Bio Rad	1851197	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
化学感受态 DH5α	Invitrogen	18258012	可从任意制造商处采购，或自行制备
氯霉素	ThermoFisher Scientific	BP904-100	可从任意制造商处采购
Cytation5 微孔板读板仪	BioTek	CYT5MF	可从任意制造商处采购，使用任何能够准确量化DNA的系统
数据分析软件（QuantaSoft 和 QuantaSoft 数据分析 Pro）	Bio Rad	N/A	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
ddPCR 96孔板	Bio Rad	12001925	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
ddPCR 微滴生成仪用油	Bio Rad	1863004	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
探针法 ddPCR 超混合液（不含 dUTP）	Bio Rad	1863024	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
QX200/QX100 微滴生成仪用 DG8 羧基胶条	Bio Rad	1864008	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
QX200/QX100 微滴生成仪用 DG8 垫圈	Bio Rad	1863009	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
探针法微滴生成油	Bio Rad	1863005	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
卡那霉素	ThermoFisher Scientific	BP906-5	可从任意制造商处采购
LB 琼脂	ThermoFisher Scientific	BP1425-2	可从任意制造商处采购，或自行配制（成分包括琼脂、胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl）
LB 肉汤	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	可从任意制造商处采购，或自行配制（成分包括胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl）
PCR 板热封膜，铝箔，可穿刺型	Bio Rad	1814040	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
PCR 管	Eppendorf	951010022	可从任意制造商处采购
培养皿	ThermoFisher Scientific	FB0875712	可从任意制造商处采购
pPCR Script Cam SK+	Stratagene/Agilent	211192	已不再商业化供应
引物/探针设计工具	IDT	N/A	https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP 和 pSKAP_Barcodes	Addgene	质粒编号 122702–122726	www.addgene.org
PX1 PCR 板封膜仪	Bio Rad	1814000	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
QX200 微滴生成仪	Bio Rad	1864002	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
QX200 微滴读取仪	Bio Rad	1864003	必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品
Salmonella typhimurium 菌株 ATCC 14028s	ATCC	ATCC 14028s	www.atcc.org
Take3 微体积检测板	BioTek	TAKE3	可从任意制造商处采购，使用任何能够准确量化DNA的系统
Thermo Scientific FastDigest BamHI	ThermoFisher Scientific	FERFD0054	可从任意制造商处采购
Thermo Scientific FastDigest DpnI	ThermoFisher Scientific	FERFD1704	可从任意制造商处采购
Thermo Scientific FastDigest HindIII	ThermoFisher Scientific	FERFD0504	可从任意制造商处采购
Thermo Scientific GeneJet 凝胶回收与DNA纯化微量试剂盒	ThermoFisher Scientific	FERK0832	可从任意制造商处采购
Thermo Scientific GeneJet 质粒小提试剂盒	ThermoFisher Scientific	FERK0503	可从任意制造商处采购
Thermo Scientific Phusion 高保真DNA聚合酶	ThermoFisher Scientific	F534L	可从任意制造商处采购
Thermo Scientific T4 DNA 连接酶	ThermoFisher Scientific	FEREL0011	可从任意制造商处采购
PCR 仪	Bio Rad	1861096	可从任意制造商处采购
UVP Visi-Blue 凝胶成像系统	ThermoFisher Scientific	UV95043301	或其他可用于DNA可视化观察的透射仪
分子生物学级水	ThermoFisher Scientific	BP28191	可从任意制造商处采购