基于数字PCR的沙门氏菌健康高通量分析竞争指数

摘要

这种基于分子的确定细菌适应性的方法,使用通过数字PCR量化的独特基因组DNA条形码,有助于精确、准确地检测微生物。该协议描述了计算沙门氏菌菌株的竞争指数;然而,该技术很容易适应需要绝对定量任何基因可塑性有机体的协议。

摘要

竞争指数是一种常用方法,用于评估细菌的适应性和/或毒性。这种方法的效用体现在其易于执行和标准化许多菌株对野生型生物体的适用性的能力。然而,该技术受限于可用的型型标记和可同时评估的菌株数量,因此需要进行大量的复制实验。在进行大量实验的同时,基于型状标记对细菌进行量化的人工和材料成本并非微不足道。为了克服这些消极方面,同时保留积极方面,我们开发了一种基于分子的方法,在将基因标记工程到细菌染色体上后,直接量化微生物。独特的是 , 25 个碱基对 DNA 条形码入在野生型和突变菌株的染色体上的无害位点。 体外竞争实验使用由池菌株组成的接种。比赛结束后,使用数字PCR量化了每个菌株的绝对数量,并计算了每种菌株的竞争指数。我们的数据表明,这种量化沙门氏菌的方法对于检测高度丰富(高适应性)和稀有(低适应性)微生物具有极其灵敏、准确和精确的检测方法。此外,这种技术很容易适应几乎任何具有染色体的有机体能够修改,以及各种需要绝对定量微生物的实验设计。

引言

评估致病微生物的适应性和毒性是微生物学研究的一个基本方面。它允许在菌株之间或突变的生物体之间进行比较,使研究人员能够确定特定条件下某些基因的重要性。传统上,毒性评估利用动物感染模型使用不同的细菌菌株,并观察受感染动物的结果(例如,传染性剂量50,致命剂量50,死亡时间,症状严重程度,缺乏症状等)。 这个程序提供了宝贵的毒性描述,但它需要菌株导致结果相当大的差异,以检测从野生类型的变化。此外,结果是半定量的,因为虽然疾病进展和症状严重性可以随着时间的推移主观量化,但与野生类型相比,对毒性的解释更定性(即更多、更少或同样具有毒性)。执行动物感染性测定的一种常见替代方法是生成竞争指数(CIs),该值直接将菌株的适应性或毒性与混合^感染1中的野生型对应物进行比较。与传统的动物感染模式相比,该技术具有许多优点,通过标准化对野生型菌株的毒性,并确定可量化的值以反映衰减程度。这项技术还可以通过确定取消的竞争指数(COI)2来调整,以分析细菌的基因相互作用。计算一组突变生物的COI,使研究人员能够确定两个基因是否独立地导致发病机制,或者它们是否参与同一毒治途径并相互依赖。此外,计算 CI 需要对细菌进行枚举,从而对生物体的发病机制提供有价值的见解。CIs 和 COIs 还允许研究人员评估不会导致临床疾病但仍在健身方面存在差异的阿维鲁特菌株。这种技术受到使用传统抗生素耐药性标记来识别菌株的限制,从而将输入菌株的数量限制在一次只有一两个。由于这种限制,需要大量的实验组和复制,这除了增加劳动力和材料成本外,还增加了实验条件变异的机会和不准确的结果。(有关使用混合感染研究毒性、适应性和基因相互作用的好处和应用的透彻回顾,请参阅 C.R. Beuzón 和 D.W. Holden ¹)

已经尝试克服这一限制,例如使用荧光标记的细胞量化通过流细胞学3,4,5。此技术使用标记的抗体对细胞进行量化,以表示型状标记或 2) 内分泌产生的荧光蛋白。使用标记抗体的检测量限制在1000个细胞/mL,因此需要大量细胞来分析3。表达荧光蛋白的细胞生理变化,易受高蛋白^表达6引起的健身变化的影响。这两种方法都受使用流式细胞测定可检测的荧光标记的数量的限制。分子定量的进步是通过开发一种微阵列技术实现的,该技术在120个菌株中检测到120个菌株的衰减,最初混合感染了1000多个菌株,在鼠模型7中。该技术利用了突变菌株对RNA的微阵列分析,导致结果具有相当大的变异性。 然而,它确定,大量的混合感染池可以是一个有用的工具,并且通过利用敏感的检测技术,可以识别细菌毒性的差异。随着下一代测序的发展,Tn-seq扩展了转波龙突变的效用,为随机突变的8、9、10细菌提供了强有力的量化^{方法。 11}.最近开发了一种替代方案,消除了转座子的需要,而是使用DNA条形码更容易地识别和跟踪基因组变化及其对适应性12的影响。这项技术是一项重大进步,但基因组条形码的插入仍是一个随机的过程。为了克服以往实验的随机性,Yoon等人开发了一种利用插入^细菌13染色体精确位置的独特DNA条形码来计算沙门氏菌菌株的CIs的方法。使用基于 qPCR 的方法检测出独特的条形码菌株,该方法具有 SYBR 绿色和特定于每个唯一条形码的引油。该技术受到qPCR施加的限制,包括引漆效率和低灵敏度的差异,qPCR之前需要嵌套PCR就证明了这一点。然而,这种方法表明,靶向基因组修饰可用于检测和潜在量化多个细菌菌株池。

在下面的协议中,我们描述了一种新方法,用于使用大型混合接种池进行细菌竞争实验,然后使用高度敏感的数字PCR技术进行精确定量。该协议涉及基因标记的细菌菌株,在染色体的无害区域插入独特的DNA条形码。这种修饰允许使用现代分子技术快速准确地量化菌株,而不是传统的序列稀释、复制电镀和计数依赖表型标记的菌群形成单位(即抗生素耐药性)).这些修改允许在单个池接种中同时评估许多菌株,大大减少了实验变异的可能性,因为所有菌株都暴露在完全相同的条件下。此外,虽然这项技术是在沙门氏菌中开发的,但它对任何遗传可塑性有机体和几乎任何需要精确细菌计数的实验设计都具有很强的适应性,提供了新的工具,以提高微生物实验室的准确性和产量,不受以前方法的限制。

方案

1. 将独特的DNA条形码纳入含有等位交换必要成分的质粒中

注:与现有的pKD13等位体交换质粒相比,创建了一种新的质粒,名为pSKAP,具有较高的拷贝数和更高的转换效率。这在步骤 1.1-1.12 中描述 (图 1.包含唯一DNA条形码和等位交换成分的最终质粒可通过质粒库(材料表)获得。

1. 使用商业质粒小提具套件,纯化 pKD13¹⁴和 pPCR 脚本凸轮 SK^–从在卢里亚-贝尔塔尼 (LB) 培养的隔夜细菌培养物中辅以 50 μg/mL 卡那霉素或 25 μg/mL 氯霉素 (用于 pKD13 和 pPCR 脚本凸轮)SK+,分别) (表 1.
2. 根据制造商的规格,使用商业限制酶 HindIII 和 BamHI 对两种质粒进行限制消化。
3. 去除限制性酶,从pPCR脚本Cam SK⁺反应中去除限制性酶,并根据制造商的规格,使用市售的DNA清理试剂盒,纯化3,370碱基对(bp)质粒主干。
4. 使用电泳室将片段从pKD13限制消化分离到1%的甘蔗凝胶上。
5. 使用蓝光透射器可视化带,并从凝胶中去除 1,333 bp 片段(图 1C)。
   注:该片段包含染色体等位基因置换所需的FRT侧皮卡那霉素抗基因。
6. 使用商业凝胶提取试剂盒从步骤 1.5 中纯化已切除的 DNA。
7. 要创建 pSKAP,根据制造商的规格,使用商用 T4 DNA 连带将纯化片段从 pKD13(从步骤 1.6)到 pPCR 脚本凸轮 SK⁺ (从步骤 1.3 起)。
8. 按照制造商的协议,使用带质的pSKAP质粒转化具有化学能力的DH5+细胞(表1)。
9. 将转化剂扩散到LB琼脂板上,辅以50μg/mL卡那霉素,并在37°C孵育过夜。
10. 从板中挑选一个菌落,并将其条纹在一个新的LB琼脂板上,辅以50μg/mL卡那霉素,并在37°C孵育过夜。从这个盘子里挑选一个菌群,用50μg/mL卡那霉素补充的LB肉汤接种。在37°C下,持续搅拌,在一夜之间孵育培养。
11. 使用商业质粒小提具套件从隔夜细菌培养中纯化pSKAP。
12. 根据制造商的规格,使用 Hind III 和 Bam HI 从步骤 1.11 执行对质粒的诊断限制消化。如步骤 1.4-1.5 中的步骤 1.4-1.5 中那样,在 1% 的甘蔗凝胶上可视化片段。
    注:pSKAP 的总大小应为 4,703 bp. 步骤 1.12 之后的碎片应为 3,370 bp 和 1,333 bp。
13. 设计PCR引物,用于插入位点定向诱变(SDM)(表2和S1),以便在pSKAP位置725处插入独特的25基对DNA序列(图2)。
    注:条形码 DNA 入到 FRT 侧皮卡那霉素抗基因外的质粒中 , 因此条形码在随后去除卡那霉素抗卡带时不会丢失。如果生成新的条形码序列,请使用在线工具确保荧光标记的目标特定 PCR 探头(以下简称"探针")将有效地绑定到新序列。表 2和S1提供了迄今为止设计的插入序列以及创建它们所需的引注。
14. 使用商业高保真DNA聚合酶、所需的引物对(表2)和pSKAP模板制备SDM反应。设置热循环器以执行以下操作:1) 98 °C 表示 30 秒,2) 98 °C 表示 10 秒,56°C 为 15 秒,72°C 为 2 分钟,3) 重复步骤 2、24 次、4) 72°C 为 5 分钟,5) 在 4°C 保持。
15. PCR 完成后,通过在反应中添加限制性酶 Dpn I 来耗尽 pSKAP 模板。在37°C孵育20分钟。
    注:PCR 的产品应在胶凝剂凝胶上可视化,以验证产品的大小和纯度。由未修改的pSKAP模板组成的对照Dpn I消化可以执行,并在后续步骤中使用,以确保模板DNA被完全消化。
16. 使用步骤 1.15 中 5 μL 的产品,根据制造商的建议转换 100 μL 的商业化学能力 DH5+ 细胞。
17. 将转化剂扩散到LB琼脂板上,辅以25微克/mL氯霉素,并在37°C孵育过夜。
18. 从过夜板中选择菌落(或菌落)并条纹到单个 LB 琼脂板上,辅以 25 μg/mL 氯霉素,并在 37°C 孵育过夜。从隔夜板中选择一个菌群,使用接种5 mL的LB肉汤,辅以25微克/mL氯霉素。在37°C下孵育文化,持续搅拌。
19. 使用商业质粒小试剂盒从过夜培养中纯化质粒。
20. 桑格使用M13正向测序引基(表2)测序纯化质粒。将突变区域与原始质粒进行比较,并评估SDM插入精度。
21. 确认条形码插入和准确性后,为每个条形码和质粒指定一个名称。
    注:迄今生成的条形码已分配两个字母名称:AA、AB、AC、...、BA、BB、BC 等。条形码质粒表示为 pSKAP_AA、pSKAP_AB、pSKAP_AC、...、pSKAP_BA、pSKAP_BB、pSKAP_BC 等。
22. 重复步骤 1.14-1.21 以生成所需的 DNA 条形码数量。

2. 将DNA条形码引入S染色体。 蒂奇穆里

注:将DNA条形码插入S.Typhimurium染色体是通过使用达琴科和万^纳14描述的等位交换方法实现的,该方法已被修改用于S。打字人。

1. 确定S上的轨迹。分型基因组,在其中插入DNA条形码(图3)。
   注:选择染色体的大、基因间区域。避免产生非编码RNA的区域。本研究利用了Put P的下游位点,在残留物1,213,840和1,213,861之间(从基因组组装GCA_000022165.1)确定。该区域以前曾被基因操纵用于^基因15的转补。或者,DNA条形码可以引入,同时破坏感兴趣的基因。这样做需要对该协议进行最少的修改并简化突变的创建。
2. 设计PCR引源,以放大步骤1.21(表2)中所需的pSKAP条形码中独特的条形码和FRT侧皮卡那霉素抗素基因。将40个核苷酸延伸添加到步骤2.1中选定的区域,到每个引源的5'端(表2)。
3. 使用商业高保真聚合酶、步骤 2.2 中的引物以及所需的包含质粒的 pSKAP 条形码作为模板执行扩增。设置热循环器以执行以下操作:1) 98 °C 表示 30 秒,2) 98 °C 表示 10 秒,3) 56 °C 为 15 秒,4) 72°C 为 60 秒,重复步骤 2-4 29 次,5) 72 °C 为 5 分钟,6) 在 4°C 保持。
4. PCR 完成后,使用 DpnI 耗尽模板 DNA,如步骤 1.15 所述。根据制造商的规格,使用商业DNA清理试剂盒净化和浓缩DNA。
5. 请参阅前面发布的在S中生成突变体的协议。来自PCR产品14、16、17、18的Typhimurium菌株14028s。
   注:从染色体中去除卡那霉素抗性基因并非必要。然而,切除该基因对细菌染色体的破坏性最小,因为它会导致129 bp的疤痕,从而将潜在的下游基因留在框架中。建议保留含有卡那霉素抗基因的菌株,因为它可用于通过P22介导转导在菌株之间移动条形码。
6. 重复步骤 2.3 = 2.5,使用适当的条形码创建所需的应变。
   注:条形码可以引入到野生型 S中。然后可以进行进一步基因操作的Typhimurium,或者条形码可以引入到以前基因改变的菌株中。

3. 细菌生长条件和体外竞争测定

1. 从细菌库存,条纹所需的S。 Typhimurium 菌株,每个含有一个独特的DNA条形码到LB琼脂板。在37°C下孵育板过夜。
2. 从每个菌株中选择一个菌落,接种 5 mL 的 LB 肉汤。在37°C下孵育20小时,持续搅拌。
   注:使用隔夜培养,继续步骤3.5从每个条形码菌株收集纯基因组DNA(gDNA)。对于第 6 节中的后续验证和控制实验,这是必要的。
3. 对于每个竞争测定,将每个隔夜培养的等量转移到适当大小的无菌管中。通过大力涡旋至少5s将菌株彻底混合在一起。
   注:每个隔夜培养的传输量应足以满足每种条件和复制,以及隔离 gDNA 以量化输入。虽然并非完全有必要测量培养物的光学密度,因为输入微生物的绝对数量将使用数字 PCR 进行量化,但每种菌株的输入细菌数量应大致相等,以避免瓶颈或在实验的早期,不平等的竞争。该协议中的代表性竞争测定同时比较了8个菌株的增长率。对于单个实验设计,可能需要增加或更少的菌株。
4. 将混合接种的100 μL转移到4.9 mL无菌LB肉汤中。在37°C下孵育所需时间或达到所需光学密度。
5. 通过在 >12,000 x g处离心,将 500 μL 的接种量收获 1 分钟。取出并丢弃上清液。立即使用单元格转到第 4 节。
6. 在所需时间点,通过+gt;12,000 x g的离心,去除500 μL等分培养和收获细胞,1分钟。去除并丢弃上清液。
   注:如果在多个时间点收集等分,在 -20°C 冷冻颗粒,或在每个收集后立即执行步骤 4.1。

4. 从S收集和量化 gDNA 。Typhimurium(来自步骤3.5和3.6)

1. 使用商业gDNA纯化试剂盒从细胞中收获gDNA。如果可用,执行可选的 RNA 耗尽步骤。
   注:RNA耗尽是不必要的;然而,RNA的存在将人为地增加DNA浓度,导致后续步骤中的异常计算。如果使用商业 gDNA 纯化试剂盒,请遵循制造商的建议,以确保该柱不会超载 DNA。如果样本在后续步骤中可量化,则不需要最低DNA浓度。
2. 使用分光光度计对每个样品中的DNA进行量化。
   注:DNA可以用任何可靠的方法进行量化。
3. 使用以下公式基于细菌基因组大小计算 gDNA 拷贝数:X 是 ng 中的 DNA 量,N 是双链 DNA 分子的长度(基因组大小)。
   
   注:660克/摩尔用作1个DNAbp的平均质量。根据生物体的核苷酸组成,可能存在小的变化。有许多计算器可以在线执行计算。

5. 设计引子和探针,用于通过dDigital PCR定量检测DNA条形码

1. 设计引体以放大S的条形码区域。putP下游的 Typhimurium 染色体 (图 3C和表 2)。
   注:引物和探头设计可以通过许多在线程序(材料表)促进。如果条形码都插入在同一位点,则所有条形码都通用一组放大底漆。
2. 设计基于 6 卡博氟辛 (FAM) 和/或六氯氟素 (HEX) 的探头,特定于每个条形码(表 2和S1)。
   注:本实验中使用的滴读器能够在多路反应中同时检测基于FAM和HEX的探头。设计 1/2 的探头,以利用 FAM 和 1/2 利用 HEX。这不是一个必要的步骤,但将减少试剂的使用和实验成本,如果实施。
3. 制作 20x 底漆探针主混合物,每个正向和反向放大底漆包含 1) 20 mM,单个 FAM 探头 2) 10 mM,单个 HEX 探头 3) 10 mM(如果多路复用)。

6. 使用数字PCR验证每个基因组条码的每个Pprimer探针集的灵敏度和特异性

注:此协议使用验证八个唯一条形码和八个唯一的探测器作为示例。使用的条形码数量可以增加或减少,以适应各种实验设计。

1. 创建包含除条形码以外的每个条形码的 gDNA 池。使用此池作为稀释剂,使用包含单个剩余条形码的 gDNA 执行稀释系列(如图4所示, 样本稀释方案)。
   注:使用池化gDNA作为稀释剂可确保在确定灵敏度时保持一致的背景。使用步骤 4.3 中确定的拷贝编号,将 gDNA 稀释到推荐的数字 PCR 范围内的副本数(每 20 μL 反应 1-100,000 份)。请记住,范围是为每个唯一目标(条形码)设置的,而不是总 gDNA。
2. 根据制造商关于使用数字 PCR 超混合设计用于基于探头的化学的建议,为数字 PCR 制备重复的反应。使用步骤 6.1 中的混合物作为模板 DNA。使用步骤 5.3 中的 20x 底漆探针主混合物,其中包含步骤 6.1 中稀释条形码的探针。
3. 根据制造商关于使用数字 PCR 超混合用于基于探头的化学的建议,为数字 PCR 准备复制控制反应。每个探针组合的控制反应必须包括 1) 无模板控件 (NTC)、2) 负控件和 3) 正控制。
   注:复制控制反应的最小数量为两个。此示例协议为每个条形码使用四个 NTC、六个负控件和六个正控制。负控制应包含带有每个条形码的 gDNA,但与所测试的探测器对应的条形码除外。这将验证每个探测器的特异性。
4. 重复步骤 6.1-6.3 为每个条形码 gDNA 样品创建数字 PCR 反应。图5给出了样品板布置。
   注:此步骤和后续步骤基于利用液滴和基于流的技术的特定数字 PCR 平台进行描述。使用基于芯片技术的替代数字 PCR 平台可以很容易地通过对该协议稍作修改来替代。步骤 6.4 可能需要多个 96 孔板来验证所有引漆集。与 qPCR 相比,通过数字 PCR 分析的单独板可以轻松比较,而无需在板之间使用标准化参考孔。
5. 根据制造商的说明,使用液滴发生器为每个反应条件生成液滴。
6. 将新创建的液滴转移到适当的 96 孔板中。在 5-50 μL 多通道移液器上使用 200 μL 移液器。
   注:移液液滴时,移液器缓慢而平稳!数字 PCR 设备制造商建议仅使用特定制造商(例如 Ranin)的移液器和移液器提示。这些移液器吸头具有平滑的开口,没有微小的塑料碎片,可以破坏液滴或损坏液滴读取器的微流体。许多品牌的提示被检查和观察,有一系列的制造质量。使用移液器尖端替代品取得了同等的结果;但是,在偏离制造商的建议时,应小心谨慎。
7. 生成并转移所有液滴后,用箔板密封器密封板。
8. 使用制造商推荐的热循环器执行以下循环条件:1) 94 °C 10 分钟;2) 94°C 1分钟,斜坡速率设定为1°C/s;3) 55°C 2分钟,斜坡速率设定为1°C/s;4) 重复步骤 2 和 3 49 次;5) 98 °C 10 分钟;6) 保持在 4 °C 至 24 小时。
   注:液滴反应中的热传递与标准 PCR 不同。反应条件可能需要修改。
9. 执行热循环时,使用板设置信息(如样品名称、实验类型(绝对定量)、使用的超级混合、目标 1 名称(FAM 条形码名称)、目标 1 类型(NTC、正控制、负控制,或未知),目标2名称(HEX条形码名称),目标2类型(空白、正控制、负控制或未知)。最终板设置信息如图5所示。
10. 热循环完成后,将已完成的反应转移到滴片读取器,然后根据制造商的说明开始读取过程。

7. 在竞争指数实验中量化细菌数量

1. 稀释gDNA从第4节分离和量化到上述适当的浓度。
2. 根据制造商关于使用适当超级混合的建议,准备数字 PCR 的反应。使用步骤 7.1 中的 DNA 作为模板。使用一个包含探头的 20x 底漆-探针主混合物(如果同时检测 FAM 和 HEX,则使用探头)来检测实验中可能存在的条形码。
3. 准备额外的数字PCR反应,如步骤7.2使用不同的20x底漆探针主混合物,直到可以检测到实验设计中使用的所有条形码。
4. 包括 6.3 中所述的每个条件的控件。这包括 1) 没有模板控件 (NTC),2) 负控件,3) 正控件。
5. 继续执行步骤 6.5-6.10 中描述的协议。

8. 分析数字 PCR 数据并计算绝对拷贝数

1. 读取所有井并完成运行后,使用数据分析软件打开 .qlp 数据文件。
   注:此处描述的文件类型和数据分析过程特定于一个数字 PCR 制造商。如果使用替代数字 PCR 平台,文件类型和数据分析过程将特定于所使用的平台,并且应根据制造商的建议规范执行。
2. 选择使用同一引体-探针主混合物的所有井。
3. 在"液滴"选项卡上,检查每个孔中分析的液滴数(正液滴和负液滴)。从分析中排除总液滴少于 10,000 口的任何井。
4. 移动到1D 振幅选项卡并检查正液滴和负液滴的振幅。确保它们由两个不同的种群组成。
5. 在软件中,使用阈值功能对所使用的每个探头的正液滴和负液滴进行截止(图6)。
   注:步骤 5.3 中使用相同底漆-探针主混合物的所有井应具有相同的阈值。
6. 一旦对所有油井应用了适当的阈值,软件将计算每个反应中的DNA拷贝数。将数据导出到电子表格,以便进一步分析。
   注:数据分析软件使用适合泊森分布的正负液滴数来确定拷贝数。
7. 使用步骤 8.6 中的值,计算样本中每个唯一基因组条形码的初始拷贝数。确定负对照反应中的平均假阳性率,并从实验反应中获得的值中减去此值。根据需要根据设置每个实验时执行的稀释法将值相乘(表 3)。

9. 通过计算基于数字 PCR 的条形码菌株的 CI 或 COI,确定生物体的相对适应性

1. 使用以下公式计算条码菌株的 CI:_输出是给定时间点条码菌株的绝对量化,WT_输出是条形码野生型细菌的绝对量化时点,A_输入是条码菌株输入接种的绝对定量,WT_输入是条形码野生型细菌输入接种的绝对定量,X_输出是所有菌株的总和。同一时间点,X_输入是所有条形码菌株的总输入接种的总和。

注:有关每个公式的优点、缺点和最适当的用处,请参阅讨论。

2. 在所有时间点对每个条形码应变重复步骤 9.1。
3. 如果适用,使用以下公式计算 COI:_输出是给定时间点具有突变基因A的条码菌株的绝对量化,AB_输出是条形码应变的绝对量化与突变基因A和B在同一时间点,A_输入是具有突变基因A的条形码菌株输入接种的绝对定量,AB_输入是输入接种的绝对定量突变基因A和B的条码应变,B_输出是在给定时间点与突变基因B的条码应变的绝对定量,B_输入是输入的绝对量化带有突变基因B的条形码菌株的接种。

和/或

结果

使用这种方法需要执行适当的控制反应,以验证用于识别目标DNA的每个探针的敏感性和特异性。在这个具有代表性的实验中,我们验证了8个独特的DNA条形码与8个相应的探针进行鉴定。所有八个探针在NTC和阴性对照反应中的假阳性率都很低(表3),即使在高度相似的DNA序列中,也突出了它们的特异性。为了评估每种情况的敏感性,包含唯一条形码的 gDNA 在包含其余七个条形码序列的 gDNA 的恒定背景中被序列稀释。通过上述方法,数字PCR在近2,000,000个类似DNA序列的背景中可以分辨到多达2个gDNA拷贝(表3)。

除了确定每个探针和DNA条形码序列的灵敏度和特异性外,验证研究中执行的稀释功能还使我们能够从结果数据中计算模拟的竞争指数。虽然此实验没有真正的输入或输出,但可以像执行竞争实验一样对数据进行分析。为此,我们将序列稀释中的每个混合物视为稀释条形码的输出(A 输出),而每个

讨论

准确量化微生物的能力对微生物研究至关重要,从最初的混合种群中列举独特菌株的能力已被证明是评估微生物的适应性和毒性特征的宝贵工具。细菌。然而,实现这一目的的技术并没有随着分子生物学的现代发展而进步。该技术可轻松修改许多细菌的染色体,包括S.Typhimurium,已经可用了近20^年14,然而这种能力很少用于分子标记菌株与独特的DNA序列。通过利用基于插入细菌染色体的独特、破坏性最小的DNA条形码,以及最先进的技术来检测和量化这些分子标识符的能力,创建易于识别的菌株(即数字PCR),我们创建了一个系统,提供精细的灵敏度,特异性,准确性和精度,以轻松量化不同细菌种群中的单个菌株。

如上所述,计算 C 和 COIs 取决于对细菌染色体进行适当修改的能力。所有修改都应通过 Sanger 测序进行验证,以确保不会发生随机突变。使用高保真聚合酶将最大限度地减少这些错误,但任何此类突变都会损害检测菌株的能力,这是该协议的另一个关键方面。尽管我们已经证明,数字 PCR 在近 200 万个背景中可以检测到多达两个 gDNA 拷贝,但超出...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	22600028	从任何制造商处采购
16 mL 培养管	MidSci	8599	从任何制造商处采购
5-200 μL 移液器吸头	RAININ	30389241	根据制造质量谨慎购买替代吸头品牌
5-50 &μ;L 多通道移液器	RAININ	17013804	谨慎使用替代的多通道移液器
琼脂糖	ThermoFisher Scientific	BP160-500	从任何制造商处购买
BLAST Analysis	NCBI	N/A	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch 热循环仪，带 96 深孔反应模块	Bio Rad	1851197	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 用品。目前尚无替代品。
化学感受态 DH5α	Invitrogen	18258012	从任何制造商处采购或自行准备
氯霉素	ThermoFisher Scientific	BP904-100	从任何制造商处购买
Cytation5 酶标仪	BioTek	CYT5MF	从任何制造商处购买，使用任何能够准确定量 DNA
数据分析的系统 软件（QuantaSoft 和 QuantaSoft Data Analysis Pro）	Bio Rad	N/A	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 耗材。目前尚无替代品。
ddPCR 96 孔板	Bio Rad	12001925	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 耗材。
ddPCR 微滴读取器油	Bio Rad	1863004	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 耗材。
用于探针的 ddPCR 超混合液（无 dUTP）	Bio Rad	1863024	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 备件。
用于 QX200/QX100 微滴发生器	Bio Rad	1864008	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 耗材。
用于 QX200/QX100 液滴发生器	Bio Rad	1863009	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 备件。
用于探针的液滴生成油	Bio Rad	1863005	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 用品。
卡那霉素	ThermoFisher Scientific	BP906-5	从任何制造商处采购
Luria-Bertani 琼脂	ThermoFisher Scientific	BP1425-2	从任何制造商处采购或自己用琼脂、胰蛋白胨、酵母消化物和 NaCl 制成
Luria-Bertani 肉汤	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	从任何制造商处购买或自己用胰蛋白胨、酵母消化物和 NaCl 制成
PCR 板热封、铝箔、可刺穿	Bio Rad	1814040	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 耗材。
PCR 管	Eppendorf	951010022	从任何制造商处购买
培养皿	ThermoFisher Scientific	FB0875712	从任何制造商处购买
pPCR 脚本凸轮 SK+	Stratagene/Agilent	211192	不再市售
引物/探针设计	IDT	N/A	https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP 和 pSKAP_Barcodes	Addgene	质粒编号 122702-122726	www.addgene.org
PX1 PCR 板封口机	Bio Rad	1814000	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 用品。
QX200 微滴发生器	Bio Rad	1864002	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 耗材。
QX200 微滴检测仪	Bio Rad	1864003	必须从 Bio Rad 购买 ddPCR 耗材。目前尚无替代品。
鼠伤寒沙门氏菌菌株 ATCC 14028s	ATCC	14028s	www.atcc.org
Take3 微量检测板	BioTek	TAKE3	从任何制造商处购买，使用任何能够准确定量 DNA
的系统 Thermo Scientific FastDigest BamHI	ThermoFisher Scientific	FERFD0054	从任何制造商处购买
Thermo Scientific FastDigest DpnI	ThermoFisher Scientific	FERFD1704	从任何制造商处采购
Thermo Scientific FastDigest HindIII	ThermoFisher Scientific	FERFD0504	从任何制造商处采购
Thermo Scientific GeneJet 凝胶提取和 DNA 纯化微量试剂盒	Thermo Fisher Scientific	FERK0832	从任何制造商处采购
Thermo Scientific GeneJet 小量制备试剂盒	ThermoFisherScientific	FERK0503	从任何制造商处采购
Thermo Scientific Phusion 高保真 DNA 聚合酶	ThermoFisher Scientific	F534L	从任何制造商处采购
Thermo Scientific T4 DNA 连接酶	ThermoFisher Scientific	FEREL0011	从任何制造商处采购
Thermocycler	Bio Rad	1861096	从任何制造商
处采购UVP 可见蓝色透射仪	ThermoFisher Scientific	UV95043301	或其他允许 DNA 可视化的透射仪
水、分子生物学级	ThermoFisher Scientific	BP28191	从任何制造商处购买