这种基于分子的方法通过量化独特的基因组DNA条形码，可精确且准确地检测微生物，从而评估细菌的适应性。该方案描述了计算沙门氏菌（Salmonella）菌株竞争指数的方法；然而，该技术可轻松适用于需要对任何遗传上可改造的生物体进行绝对定量的各种实验方案。
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摘要
摘要
竞争指数是一种用于评估细菌适应性及/或毒力的常用方法。该方法的优势在于操作简便，并能够将多种菌株的适应性标准化至野生型生物体。然而，该技术受限于可用的表型标记以及可同时检测的菌株数量，因而需要进行大量重复实验。伴随实验数量的增加，基于表型标记对细菌进行定量所耗费的人力与材料成本也不容忽视。为了在保留该方法优点的同时克服上述缺点，我们开发了一种基于分子生物学的方法，通过在细菌染色体上构建遗传标记，实现对微生物的直接定量。独特的25个碱基对DNA条形码被插入到野生型和突变型沙门氏菌（Salmonella）染色体的非必需位点。体外竞争实验采用混合菌株组成的接种物进行。竞争结束后，利用数字PCR对每种菌株的绝对数量进行定量，并据此计算各菌株的竞争指数。我们的数据表明，该方法在定量沙门氏菌（Salmonella）时具有极高的灵敏度、准确性和精确性，能够有效检测高丰度（高适应性）和稀有（低适应性）的微生物。此外，该技术可轻松适用于几乎所有染色体可被修饰的生物体，以及需要对微生物进行绝对定量的多种实验设计。
引言
评估病原体的适应性与毒力是微生物学研究的基本方面。它能够对不同菌株或突变体之间进行比较，使研究人员得以确定特定条件下某些基因的重要性。传统上，毒力评估采用动物感染模型，通过使用不同细菌菌株并观察感染动物的结果（例如感染剂量50, 致死剂量50死亡时间、症状严重程度、无症状 等等）。该方法可提供有关毒力的宝贵信息，但需要待测菌株在感染结果上与野生型产生显著差异，才能检测出其变异。此外，该方法的结果为半定量性质，因为尽管疾病进展和症状严重程度可随时间进行主观量化，但与野生型相比的毒力评估仍以定性为主（即毒力更强、更弱或相当）。进行动物感染实验的一种常见替代方法是构建竞争指数（competitive indices, CIs），该数值通过混合感染直接比较待测菌株与其野生型对应菌株的适应性或毒力。1该技术通过将毒力标准化至野生型菌株并确定可量化的减毒程度指标，在诸多方面优于传统的动物感染模型。此外，该技术还可通过测定抵消竞争指数（COI）来分析细菌中的基因相互作用。2计算一组突变生物体的协同感染指数（COI），可帮助研究人员判断两个基因是独立地参与致病过程，还是共同参与同一条毒力通路并相互依赖。此外，竞争指数（CI）的计算需要对细菌进行计数，这能够为微生物的致病机制提供有价值的见解。CI 和 COI 还使研究人员能够评估那些不引起临床疾病的无毒力菌株，尽管其不致病，但仍可能存在适合度上的差异。该技术受限于传统抗生素抗性标记的使用，从而将可同时分析的输入菌株数量限制为仅一至两个。由于这一限制，实验需设置大量分组和重复，这不仅增加了人力和材料成本，也加大了实验条件变异和结果不准确的风险。（有关利用混合感染研究毒力、适合度及基因互作的优势与应用的全面综述，参见 C.R. Beuzón 和 D.W. Holden） 1)
人们已尝试通过多种方法克服这一局限性，例如使用流式细胞术定量荧光标记的细胞3,4,5。该技术通过以下两种方式之一对细胞进行定量：1）针对表型标志物的标记抗体，或 2）内源性表达的荧光蛋白。使用标记抗体的检测下限为 1,000 个细胞/mL，因此需要大量细胞才能进行分析3。表达荧光蛋白的细胞其生理状态会发生改变，并且由于高水平蛋白表达而容易引起适应性变化6。这两种方法均受限于流式细胞术可检测的荧光标记数量。在分子定量方面的一项进展是开发出一种微阵列技术，在小鼠模型中，该技术能够从最初混合感染的 1,000 多个菌株中检测出 120 个菌株的毒力减弱情况7。该技术通过对突变菌株的 RNA 进行微阵列分析，但由此导致结果存在较大变异性。 尽管如此，该研究证实了混合感染的大规模菌株库是一种有效的工具，并且通过使用高灵敏度的检测技术，可以识别细菌毒力的差异。随着下一代测序技术的发展，Tn-seq 扩展了转座子突变的应用，成为一种强大的方法，可用于定量随机突变的细菌8,9,10,11。最近开发出一种替代性方案，无需使用转座子，而是利用 DNA 条形码更简便地识别和追踪基因组变化及其对适应性的影响12。该技术是一项重大进步，但基因组条形码的插入仍是一个随机过程。为了克服以往实验的随机性，Yoon 等人开发了一种方法，通过将独特的 DNA 条形码插入沙门菌（Salmonella）菌株染色体上的特定位点，来计算其竞争指数（CI）13。该方法采用基于 SYBR Green 和针对每种独特条形码的特异性引物的 qPCR 技术来检测带有独特条形码的菌株。然而，该技术受限于 qPCR 本身的技术限制，包括引物扩增效率的差异以及灵敏度较低，这一点从 qPCR 前需进行巢式 PCR 即可证明。尽管如此，该方法表明，可通过靶向基因组修饰来检测甚至可能定量多种细菌菌株的混合群体。
在以下实验方案中，我们描述了一种新颖的方法，用于开展包含大量混合接种物的细菌竞争实验，并通过高灵敏度的数字PCR技术进行精确量化。该方案涉及利用插入染色体无害区域的独特DNA条形码对细菌菌株进行遗传标记。这种改造使得菌株能够借助现代分子技术实现快速而准确的定量，而无需依赖表型标记（如抗生素抗性）的传统方法，例如连续稀释、影印平板及菌落形成单位计数。该改造允许在单个混合接种物中同时评估多个菌株，显著降低了实验变异性，因为所有菌株均暴露于完全相同的实验条件下。此外，尽管本技术最初在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）血清型中开发，但其高度适用于任何可进行遗传操作的生物体，以及几乎所有需要精确细菌计数的实验设计，为微生物学实验室提供了一种新工具，可在摆脱先前方法限制的同时提高检测准确性和通量。
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方案
1. 将独特的DNA条形码整合到含有等位基因交换所需组分的质粒上
注意： 与现有的 pKD13 等位基因交换质粒相比，新构建了一种名为 pSKAP 的质粒，其拷贝数更高，转化效率也有所提升。该过程详见步骤 1.1–1.12（图 1）。包含独特 DNA 条形码及等位基因交换元件的最终质粒可通过质粒库获取（材料表）。
- 使用商业质粒小提试剂盒纯化 pKD1314 和 pPCR Script Cam SK+ 来自在补充了的Luria-Bertani（LB）肉汤中培养的过夜细菌培养物 50 μg/mL 卡那霉素或 25 μg/mL 氯霉素（分别用于 pKD13 和 pPCR Script Cam SK+）(表 1).
- 使用商品化的限制性内切酶HindIII和BamHI，按照生产商的说明书对两种质粒进行限制性酶切消化。
- 从 pPCR Script Cam SK 中去除限制性内切酶和切除的 DNA+ 反应并使用市售 DNA 纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化 3,370 碱基对（bp）的质粒骨架。
- 使用电泳槽在1%琼脂糖凝胶上分离pKD13限制性消化后的片段。
- 使用蓝光透射仪观察条带，并从凝胶中切下1,333 bp的片段（图1C).
注意： 该片段包含用于染色体等位基因替换的FRT侧翼卡那霉素抗性基因。 - 使用商品化的凝胶回收试剂盒纯化步骤1.5中切下的DNA。
- 为了构建pSKAP，将来自pKD13（步骤1.6）的纯化片段连接至pPCR-Script Cam SK中+ 根据制造商说明，使用商用T4 DNA连接酶。
- 按照制造商的说明，将连接后的 pSKAP 质粒转化至化学感受态 DH5α 细胞中（表1).
- 将转化子涂布于添加有 50 μg/mL 卡那霉素，并在 37 °C 过夜。
- 从平板上挑取一个菌落，并将其划线接种于添加有 50 μg/mL 卡那霉素，并在 37 °C 过夜培养。从此平板上挑取一个菌落，用于接种含有补充物的LB肉汤培养基 50 μg/mL 卡那霉素。将培养物在37°C下过夜培养 37 °C 持续振荡。
- 使用商业质粒小提试剂盒从过夜培养的细菌培养物中纯化pSKAP。
- 使用 Hind III 和 Bam HI 对步骤 1.11 中的质粒进行诊断性限制性酶切，具体操作根据制造商说明书进行。按照步骤 1.4–1.5 的方法，在 1% 琼脂糖凝胶上观察酶切片段。
注意： pSKAP 的总大小应为 4,703 bp。步骤 1.12 之后的片段大小应为 3,370 bp 和 1,333 bp。 - 设计用于插入式定点突变（SDM）的 PCR 引物表 2 和 S1) 以在 pSKAP 的第 725 位点插入一段独特的 25 个碱基对的 DNA 序列的方式图2).
注意： 条形码DNA被插入到质粒中，位置位于FRT侧翼的卡那霉素抗性基因之外，因此在后续去除卡那霉素抗性盒时不会丢失条形码。若需设计新的条形码序列，应使用在线工具确保荧光标记的靶标特异性PCR探针（下文简称为“探针”）能够有效结合新序列。迄今所设计的插入序列及用于构建这些序列所需的引物均提供于 表 2 和 S1. - 使用商业高保真DNA聚合酶和所需的引物对配制SDM反应体系表 2），以及 pSKAP 模板。将 PCR 仪设置为执行以下程序：1） 98 °C 30 秒，2） 98 °C 10 秒 56 °C 15 秒 72 °C 2分钟，3）重复步骤2共24次，4） 72 °C 5分钟，5）保持 4 °C.
- PCR 完成后，通过向反应体系中加入限制性内切酶 Dpn I 以降解 pSKAP 模板。孵育于 37 °C 20 分钟
注意： PCR 产物应在琼脂糖凝胶上进行电泳，以验证产物的大小和纯度。可对未修饰的 pSKAP 模板进行 Dpn I 酶切作为对照，该对照可用于后续步骤，以确保模板 DNA 被完全消化。 - 用途 5 μL 步骤1.15产物的转化 100 μL 按照制造商的说明对商业化的化学感受态DH5α细胞进行操作。
- 将转化子涂布于添加有 25 μg/mL 氯霉素，并在 37 °C 过夜。
- 从过夜培养的平板中挑选单个（或多个）菌落，并划线接种至含有补充物的单个 LB 琼脂平板上 25 μg/mL 氯霉素，并在 37 °C 过夜。从过夜培养的平板上挑取单菌落，用于接种5 mL添加有 25 μg/mL 氯霉素。将培养物在过夜培养 37 °C 持续振荡。
- 使用商业质粒小提试剂盒从过夜培养物中纯化质粒。
- 使用 M13 正向测序引物对纯化的质粒进行 Sanger 测序表 2将突变区域与原始质粒进行比较，评估定点突变（SDM）插入的准确性。
- 在确认条形码插入和准确性后，为每个条形码和质粒命名。
注意： 迄今为止生成的条形码已被赋予两个字母的标识：AA、AB、AC、……、BA、BB、BC等。带有条形码的质粒表示为pSKAP_AA、pSKAP_AB、pSKAP_AC、……、pSKAP_BA、pSKAP_BB、pSKAP_BC等。 - 重复步骤 1.14–1.21 以生成所需数量的 DNA 条形码。
2. 将DNA条形码引入染色体的 沙门菌 Typhimurium
注意：通过使用 Datsenko 和 Wanner14 描述的等位基因交换方法并针对 S. Typhimurium 进行改良，可将 DNA 条形码插入 S. Typhimurium 染色体中。
- 确定在 S. Typhimurium 基因组中插入DNA条形码的位点（图3）。
注意：选择染色体上较大的非编码区，避免产生非编码RNA的区域。本研究使用了位于putP下游、基因组组装GCA_000022165.1中第1,213,840至1,213,861位点之间的区域。该区域此前已被用于基因的反式互补实验15。或者，也可在同时破坏目标基因的情况下引入DNA条形码。这样做仅需对该方案进行少量修改，并可简化突变株的构建过程。 - 设计PCR引物，用于从第1.21步中所需的含条形码pSKAP质粒中扩增出独特的条形码及两侧带有FRT位点的卡那霉素抗性基因（表2）。在每条引物的5’端添加40个核苷酸的延伸序列，该序列应与第2.1步中选定区域同源（表2）。
- 使用商业高保真DNA聚合酶、第2.2步的引物以及含条形码的pSKAP质粒作为模板进行扩增反应。将PCR仪程序设置如下：1）98 °C预变性30秒；2）98 °C变性10秒；3）56 °C退火15秒；4）72 °C延伸60秒；重复步骤2–4共29个循环；5）72 °C终延伸5分钟；6）4 °C保存。
- PCR完成后，参照第1.15步的方法使用DpnI酶降解模板DNA。根据试剂盒生产商的说明，使用商业DNA纯化试剂盒对产物进行纯化和浓缩。
- 参考已发表的利用PCR产物在S. Typhimurium 14028s菌株中构建突变体的实验方案14,16,17,18。
注意：卡那霉素抗性基因是否从染色体上切除并非必需。然而，切除该基因对细菌染色体的干扰最小，因其仅留下129 bp的疤痕序列，可确保下游潜在基因保持正确的阅读框。建议保留含有卡那霉素抗性基因的菌株，以便通过P22介导的转导将条形码转移至其他菌株。 - 重复第2.3–2.5步，构建含有相应条形码的目标菌株。
注意：条形码可引入野生型S. Typhimurium菌株，随后对其进行进一步的遗传操作；也可直接引入已进行过遗传改造的菌株中。
3. 细菌培养条件与体外竞争实验
- 从细菌菌种中，将各含有独特 DNA 条形码的目标 S. Typhimurium 菌株划线接种至 LB 琼脂平板上。在 37 °C 条件下培养过夜。
- 从每种菌株中挑取单个菌落，接种于 5 mL LB 液体培养基中。在 37 °C 条件下持续振荡培养 20 小时。
注意：利用过夜培养物，继续进行步骤 3.5，以从每种条形码菌株中提取纯基因组 DNA（gDNA）。此步骤对于后续第 6 节中的验证和对照实验是必需的。 - 针对每次竞争实验，将等体积的各过夜培养物转移至适当大小的无菌试管中。通过剧烈涡旋至少 5 秒，充分混匀各菌株。
注意：转移的每种过夜培养物体积应足以满足每个条件和重复实验的需求，以及用于分离 gDNA 以量化输入量。尽管由于将使用数字 PCR 绝对定量输入微生物的数量，因此并非必须测定培养物的光密度，但仍应使每种菌株的输入细菌数量大致相等，以避免实验早期出现瓶颈效应或竞争不均。本方案中的代表性竞争实验同时比较了 8 种菌株的生长速率。根据具体实验设计，可能需要增加或减少菌株数量。 - 取 100 μL 混合接种物加入 4.9 mL 无菌 LB 液体培养基中。在 37 °C 条件下培养至所需时间或达到目标光密度。
- 通过在 >12,000 x g 条件下离心 1 分钟，收集 500 μL 接种物。弃去上清液并丢弃。立即进入第 4 节处理细胞。
- 在所需时间点，取出 500 μL 培养物等分试样，并在 >12,000 x g 条件下离心 1 分钟以收集细胞。弃去上清液并丢弃。
注意： 若在多个时间点采集等分试样，可将沉淀在 -20 °C 冷冻保存，或在每次采集后立即进行步骤 4.1。
4. 从gDNA的收集与定量 S. Typhimurium（来自步骤 3.5 和 3.6）
- 使用商业基因组DNA纯化试剂盒从细胞中提取基因组DNA。如有条件，进行可选的RNA去除步骤。
注意：RNA去除并非必需；然而，RNA的存在会人为地增加DNA浓度，导致后续步骤中的计算出现偏差。如果使用商业基因组DNA纯化试剂盒，请遵循制造商的建议，确保柱子未被过量DNA加载。只要样本在后续步骤中可被定量，对DNA浓度无最低要求。 - 使用分光光度计对每个样本中的DNA进行定量。
注意：可采用任何可靠方法对DNA进行定量。 - 根据细菌基因组大小，使用以下公式计算基因组DNA拷贝数，其中：X为DNA的量（单位为ng），N为双链DNA分子（即基因组大小）的长度（单位为bp）。
注意：此处使用660 g/mole作为1个DNA碱基对的平均分子质量。具体数值可能因生物体的核苷酸组成不同而略有差异。目前已有多种在线计算器可用于完成该计算。
5. 通过数字PCR定量检测DNA条形码的引物和探针设计
- 设计引物以扩增条形码区域的 S. Typhimurium 染色体下游 putP (图 3C 以及 表2).
注意： 引物和探针的设计可借助多种在线程序完成材料表如果条形码均插入相同的位点，则单组扩增引物可通用于所有条形码。 - 设计针对每种条形码的6-羧基荧光素（FAM）和/或六氯荧光素（HEX）特异性探针表 2 和 S1).
注意： 本实验所用的液滴读取仪能够在多重反应中同时检测基于FAM和HEX的探针。设计探针时，可将一半用于FAM，另一半用于HEX。此步骤并非必需，但若实施，可减少试剂使用量并降低实验成本。 - 配制20倍引物-探针预混液，包含：1）每种正向和反向扩增引物各20 mM，2）单一FAM探针10 mM，以及3）单一HEX探针10 mM（如进行多重检测）。
6. 使用数字PCR验证每种基因组条形码的每对引物-探针的灵敏度和特异性
注意：本方案以使用八种独特探针验证八种独特条形码为例。可根据不同的实验设计增加或减少所使用的条形码数量。
- 创建一个包含除一个以外所有条形码的gDNA混合物。使用此混合物作为稀释液，对含有剩余单一条形码的gDNA进行系列稀释（样品稀释方案见图4）。
注意：使用混合gDNA作为稀释液可确保在确定检测灵敏度时具有稳定的背景。根据步骤4.3中确定的拷贝数，将gDNA稀释至数字PCR推荐范围内的拷贝数（每20 μL反应含1–100,000个拷贝）。请注意，该范围是针对每个独特目标（条形码）设定的，而非总gDNA量。 - 根据制造商关于使用专为探针化学设计的数字PCR超级混合液的建议，设置数字PCR反应，每个样本做两个重复。以步骤6.1中的混合物作为模板DNA。使用步骤5.3中含有所稀释条形码探针的20x引物-探针主混合液。
- 根据制造商关于使用专为探针化学设计的数字PCR超级混合液的建议，准备数字PCR的重复对照反应。每种探针混合物的对照反应必须包括：1）无模板对照（NTC）；2）阴性对照；3）阳性对照。
注意：对照反应的最少重复数为两个。本示例方案中，每种条形码使用四个NTC、六个阴性对照和六个阳性对照。阴性对照应包含除待测探针对应条形码外的所有条形码gDNA，以验证每个探针的特异性。 - 重复步骤6.1–6.3，为每个带条形码的gDNA样本建立数字PCR反应。样本板布局见图5。
注意：本步骤及后续步骤的描述基于一种使用液滴和流体技术的特定数字PCR平台。采用芯片技术的其他数字PCR平台也可轻松替代，仅需对本方案进行轻微调整。步骤6.4可能需要使用多个96孔板以验证所有引物组合。与qPCR不同，通过数字PCR分析的不同板之间可直接比较，无需在板间设置标准化参考孔。 - 按照制造商说明，使用液滴生成仪为每种反应条件生成液滴。
- 将新生成的液滴转移至相应的96孔板中。使用5–50 μL多通道移液器配合200 μL移液器吸头。
注意：移取液滴时，操作应缓慢且平稳！数字PCR设备制造商建议仅使用特定厂商（例如Ranin）的移液器和吸头。这些吸头开口光滑，无显微塑料碎片，可避免破坏液滴或损坏液滴读取仪的微流控系统。已测试多个品牌的吸头，发现其制造质量参差不齐。尽管使用其他吸头也可获得相当的结果，但在偏离制造商建议时应格外谨慎。 - 在所有液滴生成并转移完成后，使用铝箔板封膜密封反应板。
- 使用制造商推荐的热循环仪执行以下扩增程序：1）94 °C 预变性10分钟；2）94 °C 变性1分钟，升降温速率为1 °C/s；3）55 °C 退火2分钟，升降温速率为1 °C/s；4）重复步骤2和3共49次；5）98 °C 延伸10分钟；6）4 °C 保存最多24小时。
注意：液滴反应中的热传导与标准PCR不同，反应条件可能需要调整。 - 在热循环进行的同时，使用数据分析软件输入板布局信息，包括样本名称、实验类型（绝对定量）、所用超级混合液、目标1名称（FAM条形码名称）、目标1类型（NTC、阳性对照、阴性对照或未知）、目标2名称（HEX条形码名称）、目标2类型（空白、阳性对照、阴性对照或未知）。最终板布局信息见图5。
- 热循环完成后，将反应板转移至液滴读取仪，并按照制造商说明启动读取程序。
7. 定量竞争指数实验中的细菌数量
- 将从第4节中分离并定量的基因组DNA稀释至上述适当的浓度。
- 根据制造商推荐的方法配制数字PCR反应体系，使用相应的超级混合液（supermix）。以步骤7.1中的DNA作为模板。使用一种20倍浓度的引物-探针预混液，其中包含可检测实验中所有可能存在的条形码的探针（如果同时检测FAM和HEX，则包含两种探针）。
- 按照步骤7.2的方法，使用不同的20倍浓度引物-探针预混液配制额外的数字PCR反应，直至能够检测实验设计中使用的所有条形码。
- 按照6.3节所述，为每种条件设置对照，包括：1）无模板对照（NTCs），2）阴性对照，3）阳性对照。
- 继续按照6.5–6.10步骤所述的方案进行操作。
8. 分析数字PCR数据并计算绝对拷贝数
- 当所有孔均已读取且运行完成后，使用数据分析软件打开 .qlp 数据文件。
注意：此处描述的文件类型和数据分析流程仅适用于某一种数字 PCR 仪器制造商。若使用其他数字 PCR 平台，文件类型和数据分析流程将取决于所用平台，并应根据制造商推荐的操作规范进行。 - 选择使用相同引物-探针预混液的所有孔。
- 在 液滴 选项卡中，检查每个孔中分析的液滴总数（包括阳性与阴性液滴）。排除总液滴数少于 10,000 的任何孔，不纳入分析。
- 切换至 1D 振幅 选项卡，检查阳性与阴性液滴的振幅，确保其形成两个明显分离的群体。
- 在软件中使用阈值设定功能，为所用的每种探针分别划定阳性与阴性液滴的分界阈值（图6）。
注意：在步骤 5.3 中使用相同引物-探针预混液的所有孔，其阈值应保持一致。 - 在所有孔均应用适当的阈值后，软件将计算每个反应中的 DNA 拷贝数。将数据导出至电子表格，以便进行后续分析。
注意：数据分析软件通过将阳性与阴性液滴的数量拟合到泊松分布，以确定拷贝数。 - 根据步骤 8.6 所得数值，计算样品中每种独特基因组条形码的初始拷贝数。根据阴性对照反应确定平均假阳性率，并从实验反应所得数值中减去该值。根据各实验设置时所进行的稀释倍数，对数值进行相应倍数的乘法校正（表3）。
9. 通过基于数字PCR定量条形码菌株计算CI或COI来确定生物体的相对适合度
- 使用以下公式计算条形码菌株的竞争指数（CI），其中：AOutput 表示在特定时间点条形码菌株的绝对定量值，WTOutput 表示在同一时间点条形码野生型细菌的绝对定量值，AInput 表示条形码菌株接种物的绝对定量值，WTInput 表示条形码野生型细菌接种物的绝对定量值，XOutput 表示同一时间点所有菌株的总量，XInput 表示所有条形码菌株总接种物的总量。
注意：有关每个公式的优缺点及其最适用情况的讨论，请参见正文。
- 在所有时间点，对每个带有条形码的菌株重复步骤 9.1。
- 如适用，使用以下公式计算 COI，其中：AOutput 表示在给定时间点带有基因 A 突变的条形码菌株的绝对定量值，ABOutput 表示在相同时间点带有基因 A 和 B 突变的条形码菌株的绝对定量值，AInput 表示带有基因 A 突变的条形码菌株接种物的输入绝对定量值，ABInput 表示带有基因 A 和 B 突变的条形码菌株接种物的输入绝对定量值，BOutput 表示在给定时间点带有基因 B 突变的条形码菌株的绝对定量值，BInput 表示带有基因 B 突变的条形码菌株接种物的输入绝对定量值。
和/或
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结果
使用该方法需要进行适当的对照反应，以验证用于识别目标 DNA 的每种探针的灵敏度和特异性。在此代表性实验中，我们使用八种相应的探针对八种独特的 DNA 条形码进行了验证。所有八种探针在非模板对照（NTC）和阴性对照反应中均表现出较低的假阳性率（表 3），表明即使在高度相似的 DNA 序列中也具有良好的特异性。为了评估每种条件的灵敏度，将含有独特条形码的基因组 DNA（gDNA）在含有其余七种条形码序列之一的恒定背景 gDNA 中进行连续稀释。采用上述方法，数字 PCR 能够在近 2,000,000 条相似 DNA 序列的背景下，准确区分低至 2 个拷贝的 gDNA（表 3）。
除了确定每种探针和DNA条形码序列的灵敏度与特异性外，验证研究中进行的系列稀释还允许我们根据所得数据计算模拟的竞争指数。尽管本实验并无真实意义上的输入或输出，但可将数据视为竞争实验的结果进行分析。为此，我们将每个...
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讨论
准确量化微生物的能力对微生物学研究至关重要，而从初始混合种群中计数特定菌株的能力已被证明是评估细菌适应性与毒力特征的宝贵工具。然而，实现这一目标的技术发展速度并未跟上分子生物学领域的现代进展。对包括伤寒沙门菌（S. Typhimurium）在内的多种细菌染色体进行简便修饰的技术已有近二十年的历史14，但该技术极少被用于通过独特的DNA序列对菌株进行分子标记。通过利用在细菌染色体上插入独特且干扰极小的DNA条形码，从而构建出易于识别的菌株，并结合最先进的分子标识物检测与定量技术（即数字PCR），我们建立了一套系统，可在复杂的细菌种群中对单个菌株进行高灵敏度、高特异性、高准确性和高精确度的简便定量。
如上所述，计算竞争指数（CI）和竞争输出指数（COI）依赖于能够准确地对细菌染色体进行相应的修饰。所有修饰均应通过Sanger测序进行验证，以确保未发生随机突变。使用高保真聚合酶可将此类错误降至最低，但任何发生的突变都会影响对该菌株的检测能力，这是本实验方案的另一个关键方面。尽管我们已证明数字PCR能够在近200万的背景中检...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究的资助来自 George F. Haddix 校长教员研究基金以及美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所（NIH）的资助项目（编号 GM103427）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | 22600028 | 可从任意制造商处采购 |
| 16 mL 培养管 | MidSci | 8599 | 可从任意制造商处采购 |
| 5–200 μL 移液器吸头 | RAININ | 30389241 | 更换其他品牌吸头时需谨慎，应基于制造质量进行评估 |
| 5–50 μL 多通道移液器 | RAININ | 17013804 | 使用其他多通道移液器时需谨慎 |
| 琼脂糖 | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | 可从任意制造商处采购 |
| BLAST 分析 | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch 梯度PCR仪配备96孔深孔反应模块 | Bio Rad | 1851197 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| 化学感受态 DH5α | Invitrogen | 18258012 | 可从任意制造商处采购，或自行制备 |
| 氯霉素 | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | 可从任意制造商处采购 |
| Cytation5 微孔板读板仪 | BioTek | CYT5MF | 可从任意制造商处采购，使用任何能够准确量化DNA的系统 |
| 数据分析软件（QuantaSoft 和 QuantaSoft 数据分析 Pro） | Bio Rad | N/A | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| ddPCR 96孔板 | Bio Rad | 12001925 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| ddPCR 微滴生成仪用油 | Bio Rad | 1863004 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| 探针法 ddPCR 超混合液（不含 dUTP） | Bio Rad | 1863024 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| QX200/QX100 微滴生成仪用 DG8 羧基胶条 | Bio Rad | 1864008 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| QX200/QX100 微滴生成仪用 DG8 垫圈 | Bio Rad | 1863009 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| 探针法微滴生成油 | Bio Rad | 1863005 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| 卡那霉素 | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | 可从任意制造商处采购 |
| LB 琼脂 | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | 可从任意制造商处采购，或自行配制（成分包括琼脂、胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl） |
| LB 肉汤 | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | 可从任意制造商处采购，或自行配制（成分包括胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl） |
| PCR 板热封膜，铝箔，可穿刺型 | Bio Rad | 1814040 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| PCR 管 | Eppendorf | 951010022 | 可从任意制造商处采购 |
| 培养皿 | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | 可从任意制造商处采购 |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | 已不再商业化供应 |
| 引物/探针设计工具 | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP 和 pSKAP_Barcodes | Addgene | 质粒编号 122702–122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR 板封膜仪 | Bio Rad | 1814000 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| QX200 微滴生成仪 | Bio Rad | 1864002 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| QX200 微滴读取仪 | Bio Rad | 1864003 | 必须从 Bio Rad 采购 ddPCR 耗材，目前尚无替代产品 |
| Salmonella typhimurium 菌株 ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 微体积检测板 | BioTek | TAKE3 | 可从任意制造商处采购，使用任何能够准确量化DNA的系统 |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | 可从任意制造商处采购 |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | 可从任意制造商处采购 |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | 可从任意制造商处采购 |
| Thermo Scientific GeneJet 凝胶回收与DNA纯化微量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | 可从任意制造商处采购 |
| Thermo Scientific GeneJet 质粒小提试剂盒 | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | 可从任意制造商处采购 |
| Thermo Scientific Phusion 高保真DNA聚合酶 | ThermoFisher Scientific | F534L | 可从任意制造商处采购 |
| Thermo Scientific T4 DNA 连接酶 | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | 可从任意制造商处采购 |
| PCR 仪 | Bio Rad | 1861096 | 可从任意制造商处采购 |
| UVP Visi-Blue 凝胶成像系统 | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | 或其他可用于DNA可视化观察的透射仪 |
| 分子生物学级水 | ThermoFisher Scientific | BP28191 | 可从任意制造商处采购 |
参考文献
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303(2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767(2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308(2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
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