本文介绍了一种通过向兔眼眶泪腺系统的全部部位注射刀豆球蛋白A来诱导急性或慢性干眼病的方法。该方法优于已报道的其他方法，可建立可重复且稳定的干眼动物模型，适用于药理学药物的研究。
本文内容
摘要
摘要
干眼病（DED）是一种影响全球六分之一人类的眼表多因素炎症性疾病，对生活质量及医疗成本造成巨大影响。目前缺乏能够重现其关键特征的 informative 动物模型，这阻碍了针对 DED 新治疗药物的研发。现有的 DED 动物模型在可重复性和有效性方面均存在局限。本文介绍一种通过向兔眶内泪腺注射有丝分裂原刀豆蛋白 A（Con A）来诱导 DED 的模型。该模型的创新之处在于：采用超声（US）引导，确保 Con A 被准确且可重复地注射至下泪腺；对所有眶内泪腺进行 Con A 注射，以限制代偿性泪液分泌；以及通过周期性重复注射 Con A，可根据需要延长 DED 状态。通过一系列参数监测 DED 及其对测试药物的反应，这些参数包括泪液分泌量、泪膜稳定性以及角膜和结膜黏膜的状态，具体检测指标为泪液渗透压、泪膜破裂时间、Schirmer 泪液试验、玫瑰红染色和泪液乳铁蛋白水平。文中详细描述了 DED 的诱导方法及其各项参数的监测流程。该模型操作简便、稳定可靠、可重复性强且信息丰富，适用于泪液生理学、DED 发病机制的研究，以及 DED 治疗候选药物疗效与安全性的评估。
引言
干眼症（DED）是一种患病率高、致残性强的慢性疾病1,2,3,4。炎症在其发病机制中起关键作用5,6。DED 的病理生理学机制通常归因于泪液分泌不足或蒸发过强；前者亦称为水液缺乏型干眼症7。干燥综合征是 DED 典型且被广泛研究的病因之一，主要累及泪腺（LGs），显著体现了泪腺在 DED 发病机制中的重要性。临床上常使用人工泪液以提供暂时性缓解，或使用环孢素和利替格鲁特来抑制眼部炎症。目前所有可用于治疗 DED 的疗法均未达到理想效果，因此亟需开发新的治疗药物8,9。
DED 新治疗药物的研发受到三大挑战的阻碍：缺乏公认的可成药分子靶点，鉴于 DED 的病理生理复杂性，该靶点可能难以确定；有前景的候选药物匮乏；以及缺乏能够重现 DED 关键特征的动物模型。
与大多数药物研发过程一样，干眼病（DED）的动物模型是至关重要的研究工具，尽管存在一个公认的事实：没有任何动物模型能够完全重现人类疾病。目前最常用的DED动物模型包括小鼠、大鼠和兔模型，而犬和灵长类动物模型则较少使用10,11。迄今为止报道的12种以上兔DED模型中，大多数旨在通过切除泪腺（LGs）或干扰其功能来减少泪液分泌12,13,14,15,16。这些方法包括手术切除副泪腺（ILG）；闭合其排泄管；或通过放射照射，或注射以下物质之一来损害泪腺功能：活化淋巴细胞、有丝分裂原、肉毒杆菌毒素、阿托品或苯扎氯铵。这些方法的主要局限性在于结果不一致，且常常仅部分抑制泪液分泌。
刀豆蛋白A（Concanavalin A，Con A）是一种来源于植物的凝集素，可有效刺激T细胞亚群，在肝炎17和干眼病（DED）18的实验模型中已有应用。最初的基于Con A的模型被认为具有显著优势，包括操作相对简便；可诱导泪腺（LGs）中炎症细胞浸润，模拟如干燥综合征等疾病；促进促炎性细胞因子IL-1β、IL-8和TGF-β1的释放；通过检测泪液荧光素清除率和泪膜破裂时间（TBUT）可观察到泪液功能下降；且该模型对一种抗炎性皮质类固醇药物具有响应性。
当应用这一颇具前景的方法时，除了其优势之外，也发现了需要对该方法进行全面修订和重大改进的局限性。该方法的三个关键缺陷已被记录。第一，该模型为急性模型；诱导的干眼症（DED）在约1周后即消退。第二，动物的反应不一致。如所示，在 "盲法" 经皮注射至下颌下腺（ILG），Con A 仅随机递送至靶向腺体。对 ILG 解剖结构的详细研究发现，其大小可相差多达 4 倍19 进行此类注射 "命中或遗漏" 最后，即使注射了ILG，上部LG（SLG）也经常代偿性地增加泪液分泌，从而减弱了泪液流量的减少，使得该模型存在缺陷。
通过引入三种方法学改进，上述关键局限性得以克服，从而建立了一种更优越的干眼病（DED）动物模型。首先，在超声（US）引导下将刀豆球蛋白A（Con A）注射至下泪腺（ILG），以确保Con A进入腺体内部。注射成功与否通过获取注射后的超声图像进行确认，如图1所示。其次，为了消除副泪腺（SLG）的代偿性泪液分泌，对该腺体的睑叶和眶叶部分均注射Con A。最后，通过每7至10天重复注射Con A，将这一急性DED模型转化为慢性模型。在此类兔中，可轻松实现持续2个月的DED。该方法的成功已得到充分文献记录19。
如前所述，干眼病（DED）动物模型的一个重要应用是评估候选治疗药物的有效性和安全性。通过一项关于磷酸舒林达克（OXT-328）的研究验证了该模型的实用性，这是一种新型抗炎小分子20,21，以滴眼液形式给药。其有效性是基于一系列 DED 参数进行评估的19。该模型相对简单且信息丰富，因而能够将磷酸舒林达克与目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗 DED 的两种药物——环孢素和利替格拉斯特——进行平行比较，结果表明磷酸舒林达克在临床前研究中具有显著优势。
方案
所有动物实验均经石溪大学机构审查委员会批准，并依照眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明的规定进行。
1. 动物与饲养
- 获取体重为 2-3 kg 的新西兰白兔（NZW）。
- 将兔子单独饲养在笼中，严格控制温度（65 ± 5 °F）和湿度（45 ± 5%）。光照应保持 12 小时开、12 小时关的循环周期。
- 提供自由饮水和标准兔粮。避免使用饮食补充剂，因其可能含有影响眼睛的维生素 A。
- 在进行基线测量或诱导干眼症之前，至少让动物适应环境 2 周。
2. 麻醉与安乐死方法
注意：除 Con A 注射需要中度镇静外，所有操作均只需轻度镇静。
- 对于轻度镇静，使用26号针头在肩部上方皮下注射乙酰丙嗪（1 mg/kg）。轻度镇静的终点指标：动物保持头部放松姿势，耳叶不再完全直立。
注意：若未达到适当的终点，可追加一次乙酰丙嗪注射。动物应始终保持清醒，对胡须触碰有反应，且绝无呼吸减慢现象。 - 对于中度镇静，首先按上述方法给予动物乙酰丙嗪。达到终点后（见上述注释），使用带有氧气的气体面罩给予异氟烷2 流速设定为1 L/min，异氟烷输送浓度设定为5%（图2).
- 使用异氟烷麻醉，直至兔子的肌肉张力完全松弛，耳朵完全下垂。
注意：当动物侧卧时，不应出现代偿性肌肉运动；呼吸应始终保持自主状态。 - 自发恢复发生在2-5分钟内：表现包括自发的头部运动以及肌张力增加或恢复正常。在中度镇静的实验操作完成后，观察兔子约30分钟，或直至其行为恢复正常。
注意：在轻度或中度镇静过程中均无需使用眼用软膏。1）在轻度镇静下，动物仍保持清醒并具有眨眼反射；在中度镇静下，眨眼反射受到的抑制时间极短，不足以对眼表造成风险。2）在眼表使用眼用软膏会妨碍检测过程中对眼部结构的观察。 - 安乐死：使用过量静脉注射戊巴比妥（100 mg/kg）。
3. 瞬膜的切除
- 在适应期（通常为第一周）进行切除，以便对角膜进行完整且准确的评估。
- 向右侧瞬膜注射
注意：如果需要切除双眼的瞬膜，最简便的方法是在一次操作中完成。先从一只眼开始，并按以下步骤操作。为便于描述，本方法以右眼为例。- 将兔子放入合适尺寸的固定袋中。
- 按照步骤2.1所述方法进行轻度镇静。
- 使用微量移液器向右眼滴加25 μL无防腐剂的利多卡因。
- 将柔性金属眼睑拉钩置于上下眼睑之间。
- 使用0.3齿显微镊（或同等工具）夹住瞬膜顶端，并将其牵拉至角膜表面。
- 使用26号锐利针头，在瞬膜基底部的结膜下注射含1:100,000肾上腺素的1%利多卡因（图3A）。瞬膜表面应形成中等大小的结膜下水泡。
- 移除眼睑拉钩。
- 对左侧瞬膜进行完全相同的注射操作。
- 切除瞬膜
- 约5分钟后，将眼睑拉钩重新置入右眼。使用0.3齿显微镊（或类似工具）夹住瞬膜顶端并将其牵拉。
- 使用Westcott剪刀或同等器械，在瞬膜基底部将其完全剪除（图3B）。
注意：出血量通常很少，一般无需电凝止血。但为防需要额外止血，应始终在操作现场备有高温电池供电的电凝设备。 - 移除眼睑拉钩。
- 在眼部涂抹局部抗生素眼膏（例如新霉素、多粘菌素、杆菌肽和氢化可的松）。
- 保留哈德氏腺完整。当瞬膜被牵拉时，有时可见哈德氏腺。
注意：若在瞬膜切除后，于鼻侧或上方结膜下区域观察到较大的白色肿块或组织隆起，则表明瞬膜切除部位过于靠近基底部，导致哈德氏腺自发脱出。为避免后续操作中出现此情况，应在基底部保留更多瞬膜组织。 - 在进行进一步操作或开展眼表检测之前，应至少让眼表组织愈合1周。
4. 干眼参数的测量与泪液样本的采集
注意：根据研究方案的需求测量干眼症（DED）参数（例如，在基线及之后指定的时间点）。DED的测量应按以下顺序进行，并需严格努力确保每次测量的可重复性。所有动物应在每天大致相同的时间（±1小时）进行检测，以尽量减少昼夜节律变化的影响。这些测量通常需要两名研究人员组成的团队协作完成。
- 将兔子放入固定袋中，进行轻度镇静。
- 泪液渗透压22
- 手动眨眼5到10次，以均匀分布眼表的泪液层。
- 轻轻下拉下眼睑。
- 在下穹隆处，于瞬膜残端基部后方，睑结膜与球结膜交界处，使用 TearLab 渗透压计采集泪液样本。
- 使用 TearLab 渗透压测试仪，按照制造商的说明测量渗透压。
- 泪膜破裂时间 （泪膜破裂时间）
- 进行此检测时，将房间调暗。
- 将金属睑撑置于眼睑之间。
- 使用微量移液器在角膜表面滴加50 µL的0.2%荧光素钠溶液。若首次滴加未能使荧光素均匀分布于角膜表面，可再滴加第二滴。
- 立即启动计时器。
- 在蓝光下观察角膜前泪膜。TBUT 定义为荧光素膜出现黑色斑点、条纹或明显破裂所需的时间（图4）。如有需要，可使用提供+1.50倍放大倍率的手术放大镜，以更清晰地观察破裂的早期迹象。监测时间最长为1分钟；若按此定义的破裂在1分钟后才发生，则记录TBUT为60秒。
- 泪液分泌量测试（Schirmer） （STT）
- 在眼表滴加25 μL不含防腐剂的利多卡因。
- 将Weck细胞外科棉签置于下穹隆处，以吸收残留的利多卡因及任何泪液。必要时，可用下眼睑覆盖棉签的近端，以帮助固定其位置（图5A).
- 大约30秒后，移除Weck海绵。
- 立即将Schirmer泪液检测条插入下眼睑中点处角膜与睑结膜之间的间隙。
- 立即启动计时器（图5B).
- 5 分钟后，测量试纸湿润部分的长度，即为 STT 值。
- 以三个重复样本进行测量，并将三次读数的平均值作为STT值报告。
- 泪液样本采集
- 在记录5分钟时的STT值后，继续将试纸条保留在原位，直至湿润长度达到至少20 mm，以收集泪液样本用于检测其中多种分析物（如乳铁蛋白）的水平。
注意：如果在诱导干眼症（DED）后仍未出现充分湿润，可将试纸条进一步深入下穹隆，以在合理时间内达到该终点。 - 将湿润的条带剪下，立即放入含有490 µL预冷泪液收集缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物的PBS，其中含4% BSA、1M NaCl和0.1% Tween-20）的容器中。
- 将样品置于冰上保存，直至可储存于 -80 °C；样品应在 -80 °C 保存，直至进行检测。
- 在记录5分钟时的STT值后，继续将试纸条保留在原位，直至湿润长度达到至少20 mm，以收集泪液样本用于检测其中多种分析物（如乳铁蛋白）的水平。
- 玫瑰红B染色 (RBS)
- 使用微量移液器将50 µL 1%无防腐剂利多卡因滴于角膜。
- 30秒后，将25 µL的1%玫瑰红染料置于眼表，手动眨眼以使其均匀分布。
- 立即启动计时器。
- 在3.5分钟时，将金属丝环扩张器置于两层盖子之间。
- 在4.0分钟时，拍摄上方结膜和角膜表面的照片（图6).
注意：根据所使用的相机类型进行调整。典型设置：数码单反相机，光圈优先模式（光圈13或更高），ISO 6000，配备两个12.5 mm延长管的100 mm微距镜头，手动对焦模式，镜头调至最大放大倍率，照明采用支持TTL（通过镜头）模式的环形闪光灯，设置为自动输出。开启环形闪光灯的对焦辅助灯以帮助对准角膜。 - 在1分钟内完成双眼的所有拍照。
- 评估眼表染色 使用NEI方法23 修改如下. 不要对6个独立的结膜区域进行分级。仅对每只眼的上方结膜进行评分。该区域是结膜表面中无需移动眼球即可轻松拍摄的部分。操作眼球可能会人为改变眼表染色情况。
- 泪液乳铁蛋白水平 是反映泪腺泪液分泌的替代性指标。采用酶联免疫吸附试验检测上述收集的泪液中的乳铁蛋白。24 试剂盒，按照制造商的说明进行操作。
5. 干眼症的诱导与治疗
注意：需注射眶部泪腺系统的三个部分。
- 皮下注射0.2 mg/kg的乙酰丙嗪对兔子进行镇静。
- 剪除眼周及头皮区域的毛发，并使用Nair彻底清除残留毛发。保持皮肤完全光滑，以便更清晰地观察解剖标志，并进行超声引导下刀豆蛋白A（concanavalin A）注射图7).
- 按照上述方法诱导中度镇静。
- 上泪腺睑叶（PSLG）注射
注意：先进行 PSLG 的注射。- 使用微量移液器向适当的眼部滴加25 µL不含防腐剂的1%利多卡因。
- 翻转上眼睑，并对眶缘后部施加轻柔的内侧压力，直至看到标记腺体睑叶的突起。PSLG表现为上眼睑后部（颞侧）的一个小的结节状隆起。
注意：在学习过程中，若要观察腺体组织，可在该区域应用5%荧光素钠图8A）。可见泪液从膨大的 PSLG 中流出。Con A 给药时无需使用荧光素钠；使用荧光素钠仅出于图示目的，以显示腺体组织。 - 使用细齿镊子和结核菌素注射器上的27号针头，通过结膜入路直接穿刺腺体。将针头推进至组织内2 mm处，注入500 µg刀豆蛋白A（Con A），体积为0.1 mL（图8B).
注意：此注射有时可能会引起疼痛。如有必要，在完成注射前应使动物保持在异氟烷麻醉状态下。
- 眶上泪腺注射 （OSLG）
注意：OSLG 随即快速进行。- 对眼球施加内侧压力，使OSLG从后方切迹突出（参见参考文献）25 用于解剖学观察（如有需要）。对眼球施加内侧压力（图9, 红色箭头) 与后切迹处突出的枕骨上项线隆起相对应。该隆起可作为粗略定位标志，用于寻找后切迹。
- 使用尖端闭合的弯头镊子按压该区域，直至触及颅骨上的骨性开口。该开口呈狭缝状，位于突起下方，方向为前后向。
- 用镊子施加适度压力，使皮肤留下压痕，作为针头放置的定位标志（图10A).
- 将针头（结核菌素注射器配27号、5/8英寸针头）垂直插入皮肤凹陷标记处图10B约¼英寸刺入切迹，随后将针头转向后外侧，朝向外眦，目标为注射点与眶缘骨性边缘中点之间的位置。
注意：如果针头未准确对准切迹，颅骨将阻碍其前进。 - 当针头到达目标位置后，缓慢注入1000 µg刀豆蛋白A（Con A），体积为0.2 mL（图10C).
- 在2-3分钟内完成PSLG和OSLG的注射。
- 将动物从异氟烷镇静中移出（如果尚未完成）。通常无需进一步镇静即可完成下泪腺（ILG）注射。
- 下泪腺注射
- 从侧面观察动物。ILG 的隆起可见于眼眶下前方区域。图11A).
- 使用外科标记笔或合适的永久性记号笔，在皮肤上画一条垂直线，标示出ILG腺浅部从颧骨上较表浅（更偏外侧）的静息位置向眼眶内侧位置过渡的区域。该位置通常位于前角膜缘下方图11A).
- 通过将垂直持握的超声探头沿皮肤上的此线扫查，确定颧骨的末端。ILG 的转变发生在图像中腺体从边界清晰（图像中腺体下缘可见颧骨的强回声线）转变为无明确内侧边界（颧骨回声不再可见）的区域。 图1).
- 当超声屏幕显示此变化时，观察手柄相对于皮肤上所画线条的位置。这是 "注射部位" Con A 应给予的位置。
- 控制注射深度，将Con A注入位于颧弓骨内侧稍偏处的腺体位置。
- 确定注射深度的方法如下：将预期注射深度设定为颧骨（高回声信号）深度加1 mm。用已知的针头长度（本例中为15 mm）减去该数值。
- 将针头插入腺体的 "注射部位" 约12毫米，然后缓慢撤出，直至体外露出的针头长度（使用外科卡尺测量）等于5.8.6中计算出的差值（图12注射0.2 mL含1000 µg刀豆蛋白A（Con A）的溶液。
注意：为确保腺体包膜的完整性 穿孔 并且不应仅由针头推入，针头应插入约12 mm或几乎至针座处，然后开始撤出。 - 重复超声检查以确认注射成功。ILG 应显示出特征性的低回声区域（图1).
注意：ILG 注射是动物耐受性最好的一种注射方式26 因此，该步骤最后进行。
- 在10分钟内完成双眼所有腺体的注射操作。操作者需熟练掌握该技术以达到此要求。
注意：对双侧眶内泪腺进行一次注射可诱导产生持续1-2周的急性干眼症。 - 对于持续时间较长的DED，按照上述方法每7天注射一次Con A。最多可成功进行6次此类注射。
6. 术后护理
- 注射Con A后，将动物置于固定袋中观察至少10-20分钟，或直至麻醉作用完全消退。
- 在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。在动物完全恢复前，不得将其放回各自的笼中。
- 术后疼痛通常较轻，持续时间少于48小时。使用兔面部表情疼痛评分量表评估疼痛程度。如有需要，可给予一次皮下注射酮咯酸（5 mg/kg）。对于更严重的疼痛，每8小时给予一次皮下注射布托啡诺0.1 mg/kg。
结果
Con A 注射在泪腺中诱导出强烈的炎症反应，其特征是密集的淋巴细胞浸润（图13），并伴有泪液分泌减少。所有泪液相关参数均显著改变（表1 和 表2）。此外，泪液中乳铁蛋白水平受到抑制（对照组 = 3.1±0.45 vs. Con A 注射组 = 2.7±0.02 ng/mg 蛋白质（均值 ± 标准误）；p<0.03）。最终结果表现为角膜和结膜上皮屏障功能受损，玫瑰红染色增强即为此提供了证据（图6）。
注射三个眼眶LG组织所产生的DED状态具有一致性和均匀性，与先前方法所达到的状态不同18,27。该结果的关键因素在于超声引导下对ILG的注射以及对OSLG的注射。表1总结了该方法的主要结果，所有变化均与重度DED一致。
单次注射刀豆蛋白A（Con A）可诱导持续约1周的干眼症（DED）；所有临床参数在第10天时均恢复正常（表2）。间隔约1周进行连续多次Con A注射，可相应延长DED的持续时间。例如，在第7天进行第二次Con A注射可使DED维持2周，依此类推。经过约5次注射后，DED状态通常会变为永久性，无需进一步注射。
在由Con A诱导的干眼病（DED）兔模型中，使用新型试剂磷硫茚（phosphosulindac）治疗后，疾病症状显著受到抑制。例如，经该试剂治疗一周后，泪膜破裂时间（TBUT）较溶剂处理组动物显著延长（43.6±4.0 vs. 12.2±2.8 s；p<0.001；均值 ± SEM，以下数值同）；同时，泪液渗透压恢复正常（294±4.6 vs. 311±2.0 mOsm/L，p<0.002）。从作用机制上看，磷硫茚显著降低了两种关键白细胞介素的水平：IL-1β（8.4±1.2 vs. 21.2±6.6 pg/mg蛋白；p<0.03）和IL-8（4.9±1.7 vs. 13.5±5.0 pg/mg蛋白；p<0.05）19。
图1：下泪腺的超声图像。 上图： 下泪腺（ILG）向眼眶深部移动，位于颧弓下方。虚线表示超声探头在皮肤上扫查的路径。 中图： 当探头沿此线扫查时，检查者需观察左侧图像中存在的颧骨回声（箭头）是否消失，如右侧图像所示。 下图： 注射Con A前后拍摄的下泪腺图像（左为治疗前，右为治疗后）。腺体内出现大的囊性腔隙，证实药物已正确递送。经许可转载19。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：气体面罩镇静。 本照片显示使用异氟烷通过气体面罩实现短暂中度镇静。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：瞬膜的切除。 (A) 注射利多卡因/肾上腺素。 (B) 使用Westcott剪刀在瞬膜基底部将其截断。 (C) 瞬膜切除后，眼球表面更易于观察。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：泪膜破裂时间测量。 (A) 滴入荧光素滴眼液后，在蓝光下角膜表面呈现均匀的绿色泪膜外观。(B) 荧光素染色中已出现明显破裂的角膜表面，表现为多个暗色圆形区域和线性条纹。一旦出现第一个暗点或暗线，即记录破裂时间。两个浅蓝色圆形为光源在角膜表面的反光。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：Schirmer 泪液试验。 (A) 将 Weck-Cel 海绵正确置于下穹窿，以清除残留的局部利多卡因溶液及基础泪液。将三角形海绵的后缘置于下睑缘下方，可保持操作技术的高度一致性，从而在放置泪液试纸前均匀干燥眼表。 (B) 泪液试纸正确放置于眼球与下睑（睑结膜）之间的中点位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：玫瑰红染色。 上图：角膜表面的图像。左图：使用Con A治疗前无玫瑰红染色。右图：注射后（右上）可见鼻侧上方象限的角膜和结膜弥漫性染色。下图：来自上方球结膜的结膜印迹细胞学检查。左图：治疗前存在大量杯状细胞。右图：治疗后存在上皮细胞，但杯状细胞缺失。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：用于刀豆球蛋白A注射的兔子准备。 (A) 使用小型剪刀去除毛发，以便更清晰地观察解剖标志，识别眶上泪腺。 (B) 使用脱毛剂（Nair）去除剪毛后残留的毛发。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：睑部泪腺注射。 （A） 睑部泪腺表现为上睑后颞侧区域的结节状隆起。滴加一滴2%荧光素后，可见泪液从该腺体表面流出。（B） 在对兔实施中度镇静的同时进行睑部泪腺注射。一名研究人员牵拉眼睑，充分暴露腺体并固定面罩，另一名研究人员则对腺体进行注射。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：眼眶上泪腺的定位。 皮肤轮廓的变化提示了眼眶上泪腺（OSLG）穿过后切迹时的位置。交替施加于眼球的内侧压力（大箭头）可导致上眼眶腺体脱出，表现为皮肤上的微小隆起。每次施加压力时，该隆起的大小都会增大（小箭头）。该腺体的位置通常与眼眶后缘对齐。请点击此处查看此图的放大版本。
图10：眶上泪腺的注射。 (A) 使用细齿镊子在如图9所示突出的颅骨区域施加轻柔压力。可触诊到颅骨上一个细小的裂隙状开口。用镊子留下一个微小的压痕，有助于在注射时准确定位针头。 (B) 针头垂直穿过切迹插入。若位置不正确，针头的通路会被骨性颅骨阻挡。 (C) 针头最终位置斜向外眦。 请点击此处查看该图的放大版本。
图11：下泪腺的定位。 (A) 通过下眼睑可见下泪腺（ILG）浅层部分的隆起。曲线形笔标记表示腺体的较低位置。位于鼻侧角膜缘下方的垂直线，表示ILG向眼眶深部移行的大致位置，可作为超声（US）检查的视觉参考。 (B) 超声探头在垂直线区域来回扫查；超声显示器将显示颧骨终止的位置、ILG移行的位置以及刀豆蛋白A（Con A）注射的部位（“注射位点”）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图12：下泪腺注射。 下泪腺（ILG）注射在超声（US）定位的位置进行。注射深度按文中所述方法计算（步骤5.8.6）。游标卡尺（位于针头后方）用于确保注射前针头插入至正确深度。 请点击此处查看该图的放大版本。
图13：泪腺的组织学。 正常下泪腺的组织切片显示典型的管泡状腺结构 (A)，而注射Con A后 (B) 可见明显的淋巴细胞浸润，导致腺体结构破坏。类似的炎性浸润也见于上泪腺。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 注射方法 | TBUT，秒 | 泪液渗透压，Osm/L | STT，mm | |||
| 基线值 | 注射后 | 基线值 | 注射后 | 基线值 | 注射后 | |
| 均值 ± 标准误，% 变化 | ||||||
| 无超声引导的ILG注射 | 58.5 ± 1.5 | 44.5 ± 7.7 | 297 ± 4.9 | 300 ± 3.8 | 15.2 ± 0.9 | 12.9 ± 2.2 |
| %变化 | -23% | 1% | -15% | |||
| p=0.05 | p=0.36 | p=0.21 | ||||
| 超声引导下ILG + PSLG注射 | 59.4 ± 0.6 | 11.4 ± 4.2 | 296 ± 4.7 | 326 ± 3.7 | 15.1 ± 1.3 | 10.7 ± 1.8 |
| %变化 | -81% | 10% | -29% | |||
| p<0.0001 | p<0.0001 | p<0.03 | ||||
| 超声引导下ILG + PSLG + OSLG注射 | 60 ± 0.0 | 6.2 ± 1.3 | 299 ± 2.9 | 309 ± 2.8 | 14.6 ± 0.9 | 9.9 ± 1.3 |
| %变化 | -90% | 3% | -32% | |||
| p<0.0001 | p<0.008 | p<0.002 | ||||
| 所有数值均在向所列腺体单次注射Con A后的第6天测得。所有比较均相对于基线值。*ILG，下泪腺；PSLG，上泪腺睑叶部分；OSLG，上泪腺眶叶部分；US，超声。 | ||||||
表1：注射技术与注射位点数量对干眼严重程度的影响。
| 基线 | 第6天 | 第13天 | 第21天 | |
| 1次注射 | 2次注射 | 3次注射 | ||
| TBUT，秒 | 58.5 ± 1.5 | 44.5 ± 7.7 | 29.2 ± 7.8 | 12.8 ± 3.9 |
| %变化 | -24% | -50% | -78% | |
| p=0.17 | p=0.001 | p<0.0001 | ||
| TOsm，Osm/L | 297 ± 4.9 | 300 ± 3.9 | 308 ± 4.9 | 313 ± 2.7 |
| %变化 | 1% | 4% | 5% | |
| p=0.36 | p=0.04 | p=0.003 | ||
| STT，mm | 15.2 ± 0.9 | 9.3 ± 1.6 | 12.9 ± 1.6 | 7.4 ± 1.1 |
| %变化 | -39% | -15% | -51% | |
| p=0.17 | p=0.13 | p=0.008 | ||
| 所有比较均相对于基线进行。 | ||||
表2：反复向ILG注射Con A对DED持续时间的影响。
讨论
兔子在干眼症（DED）研究中具有很高的吸引力。与小鼠和大鼠相比，其角膜和结膜的表面积更接近人类；其药物代谢酶（如酯酶）的组成、泪腺组织学特征与人类相似，且其眼睛足够大，适合进行有意义的药代动力学研究。与具有类似特征的猪和猴相比，兔子成本更低，实验操作更为简便。如果考虑开展机制性研究，与小鼠相比，兔子的一个相对不足之处在于可用的试剂（例如单克隆抗体）较少。然而，在药代动力学和生物分布研究方面，兔子远优于小鼠，因为其各个组织易于分离，且体积足够大，可用于分析工作，从而避免了"样本 pooling"。
一个关键的通用参数是兔子的适应期。动物从供应商处运输时，运输环境往往无法保证适宜的温度或湿度条件。部分动物在到达时可能已经出现干眼症状。建议设置为期两周的适应期。同样重要的是，必须严格监控实验兔在动物房饲养环境中的湿度和温度。任一条件的偏差都可能导致其眼部状况出现巨大差异。应提前准备备用加湿器和除湿器。一旦中央系统失效，需迅速使用备用设备恢复环境湿度。需注意，此类意外情况在夏季更为常见。然而，成功诱导兔干眼病（DED）最关键的三个步骤是：1）熟练使用超声成像技术识别下泪腺（ILG），并引导和确认刀豆蛋白A（Con A）的注射；2）确保对下泪腺以及上泪腺（SLG）的两个部分均进行注射；3）可靠且可重复地检测干眼病的各项参数。
掌握所需的实验技能并非易事，但不应阻碍任何严肃的研究人员。预计在五次尝试后即可完成学习过程。一台质量合理的超声成像系统至关重要。通过超声识别解剖标志非常重要，因此研究人员应复习兔的解剖结构。Davis25对兔解剖结构的经典描述极为详尽，具有极大的参考价值。同时需注意眶下泪腺（ILG）大小的个体差异。由此引申的一点是，Con A注射是否成功必须始终通过后续影像学检查加以确认。在一组兔子中对Con A反应的差异，最常见原因在于注射技术（注射失败或部分成功）或忽略了残余泪腺组织通过过度分泌泪液进行代偿的能力。对于希望熟练掌握注射技术的研究者，可先注射亚甲蓝，随后立即进行解剖观察，若染料到达泪腺或溢出至邻近组织，则可直观判断注射效果。迄今为止，作者团队已成功实施该注射方法超过270次，未发生任何并发症。
检测上述干眼症（DED）的五项参数可能与临床实践中确定这些参数一样具有挑战性。尽管目前尚未正式记录这些参数中的任何一项存在昼夜节律变化，但已有充分的背景证据表明眼部存在此类现象28，因此应在每天相同的时间（±1 小时）进行检测，尤其是在需要重复检测并相互比较时。保持检测操作的一致性至关重要。检测需要由两人组成的团队完成。同一房间内若有四名或更多研究人员参与检测，可能会造成干扰，因为某些步骤需要严格的时间控制。在需要时，适当且高质量的摄影记录非常重要。
该模型非常适合用于药物开发研究。熟练掌握动物模型和检测技术可确保药效和安全性研究具有良好的重复性19。
这种方法是一种强大的实验手段，因为它消除了先前模型中存在的混杂变异因素，简化了动物模型，并基本实现了对干眼病（DED）五个参数的标准化检测。该模型在候选治疗药物研究中的成功应用，证实了其作为一种信息丰富的动物模型的实际效用，对于一种迫切需要新疗法及更深入理解其发病机制的疾病而言，具有重要意义。
披露
作者声明不存在竞争利益，但BR除外，其在Medicon Pharmaceuticals, Inc.和Apis Therapeutics, LLC中持有股权；以及LH，其为Medicon Pharmaceuticals, Inc.的员工，并在Apis Therapeutics, LLC中持有股权。
致谢
所有动物实验均按照所有相关的监管和机构指南进行并符合其要求。所有研究均经纽约州立大学石溪分校机构审查委员会批准，并依照ARVO关于眼科和视觉研究中动物使用的规定进行。
本研究部分得到了纽约州立大学石溪医学院靶向研究机会基金（资助号：1149271-1-82502）以及纽约州塞托凯特市Medicon制药公司的研究基金资助。作者感谢Michele McTernan提供的编辑支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 微距镜头 | Canon EF 100mm f/2.8L IS USM | 3554B002 | |
| 26 号针头（5/8 英寸） | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305115 | 用于向泪腺注射 ConA 的针头 |
| 27 号针头（5/8 英寸） | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ | 305921 | 用于向泪腺注射 ConA 的针头 |
| Aceproinj（乙酰丙嗪） | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 皮下注射，0.1 ml/kg，用于兔的镇静 |
| 麻醉蒸发器 | VetEquip, Pleasanton, CA | Item #911103 | |
| Bishop Harmon 镊子 | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | 组织镊 |
| 卡尺 | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E-2404 | 用于测量 ConA 注射时针头的长度 |
| 刀豆蛋白 A（Concanavalin A） | Sigma, St. Louis, MO | C2010 | 用 PBS 配制成 5 mg/ml 溶液，用于注射至兔泪腺 |
| 单反相机 | Canon EOS 7D DSLR | 3814B004 | 数码单镜头反光相机 |
| 荧光素 | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | 用 PBS 稀释至 0.2%，用于测量泪膜破裂时间（TBUT） |
| 异氟烷（Isoflurane） | Henry Schein, Melville, NY | 29405 | |
| 乳铁蛋白 ELISA 试剂盒 | MyBiosource, San Diego, CA | MBS032049 | 用于检测泪液中乳铁蛋白水平 |
| 利多卡因（lidocaine） | Sigma, St. Louis, MO | L5647 | 用 PBS 配制成 1% 溶液，作为麻醉剂 |
| 微距/环形闪光灯 | Canon Macro Ring Lite MR-14EXII | 9389B002AA | |
| 渗透压检测探针 | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | 用于测量泪液渗透压 |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Mediatech, Inc. Manassas, VA | 21-031-CV | |
| 兔，新西兰白兔或荷兰带状兔（如文中所述） | Charles River Labs, Waltham, MA | 2-3 kg | 实验动物 |
| 玫瑰红（Rose Bengal） | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 用 PBS 配制成 1% 溶液，用于眼表染色 |
| Schirmer 试纸条 | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | 用于测量泪液分泌量 |
| 手术放大镜 +1.50 | Designs for Vision, Bohemia, NY | Specialty item | 在观察泪膜破裂及进行刀豆蛋白 A 注射时，提供眼表放大视野 |
| TearLab 渗透压计 | TearLab Corp., San Diego, CA | Model #200000W REV A | 用于测量泪液渗透压 |
| 超声探头 | VisualSonics Toronto, Ont | MX 550 S | 用于超声引导下对下泪腺进行 ConA 注射 |
参考文献
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