本文介绍了一种在成年雄性Wistar大鼠中使用侧向液体打击损伤（FPI）模型诱导重度创伤性脑损伤（TBI）的实验方案。同时，我们还展示了如何利用无线遥测系统进行连续的视频脑电图（video-EEG）记录，并监测符合创伤后癫痫发生特征的癫痫样放电活动。
本文内容
摘要
摘要
侧向液体脉冲损伤（FPI）模型已被广泛建立，常用于研究创伤性脑损伤（TBI）和创伤后癫痫（PTE）。然而，不同研究在使用该模型时所采用的具体参数存在较大差异，导致各实验室之间的结果难以统一和比较。例如，已有报道指出，在颅骨切除的大小和位置、鲁尔锁接头相对于颅骨切除区域的放置方式、施加于硬脑膜的大气压力以及压力脉冲持续时间等方面均存在变异性。这些参数中的每一项都可能影响损伤的严重程度，而损伤严重程度又与PTE的发生率直接相关。这种变异性表现为各研究中报告的死亡率、翻正反射时间以及惊厥性癫痫发作发生率的广泛差异。本文提供了我们所采用方法的详细实验方案，以促进不同研究之间的标准化。我们结合使用FPI模型与无线脑电图（EEG）遥测系统，对脑电活动变化进行连续监测，并检测癫痫发作活动。 FPI通过在左侧半球、前囟与人字缝之间、靠近外侧嵴处制作一个5 mm的颅骨切除来诱导。将一个鲁尔锁接头固定在颅骨上，覆盖于颅骨切除区域。该接头连接至FPI装置，通过与接头以旋转锁紧连接器相连的压力导管，向完整的硬脑膜直接施加持续20毫秒的压力脉冲。动物恢复后，再次进行麻醉以移除接头。随后，将五个直径0.5 mm的不锈钢EEG电极螺钉经颅骨与硬脑膜接触，其中四个作为记录电极，一个作为参考电极。电极导线被汇总至一个基座连接器，并用骨水泥固定。在TBI后最多连续采集4周的视频/EEG记录。
引言
根据美国疾病控制与预防中心向国会提交的一份2015年报告，美国每年约有250万人遭受创伤性脑损伤（TBI）1。据估计，TBI导致了20%的症状性癫痫病例以及全部癫痫病例中的5%2,3,4。此外，约20%的TBI患者会发展为创伤后癫痫5。重要的是，由TBI引发的慢性反复性癫痫发作通常具有药物难治性，从而加重了疾病负担6。导致创伤后癫痫（PTE）的确切机制仍不明确。然而，已有若干关键的流行病学研究探讨了创伤后癫痫（PTE）的发生率及其潜在风险因素2,4,7,8,9,10,11。这些流行病学研究均进一步证实了损伤严重程度与癫痫发生风险之间的相关性。
目前广泛用于发现新型抗癫痫疗法的方法主要依赖于使用化学致痫剂或电点燃模型来诱导癫痫12。鉴于创伤性脑损伤（TBI）患者对这些模型中开发出的药物存在较高的耐药发生率，我们推测TBI诱发的癫痫发作可能不同于化学致痫剂或点燃诱导的癫痫发作，并可能涉及不同的癫痫发生通路或过程。因此，TBI模型可能更适用于开发更有效的治疗手段，以预防创伤后癫痫的发生。
创伤性脑损伤（TBI）的液体打击损伤（FPI）模型已使用数十年，是研究TBI和创伤后癫痫（PTE）的一种成熟方法13,14,15,16,17,18。然而，正如我们最近综述所述，不同实验室报道的FPI方法存在高度变异性19,20。实验室之间缺乏一致性，导致临床前研究结果难以重复，也使结果的解释变得困难。因此，目前已有越来越多的关注和努力致力于推动此类研究的更高程度的标准化21,22,23,24。
为了进一步提高致力于研究创伤后癫痫发生的研究实验室之间的一致性与标准化水平，本文提供了我们所采用方法的详细操作流程。我们此前曾报道，在重度创伤性脑损伤（TBI）后的六周内，惊厥性癫痫发作的发生率可达60%20。目前，我们采用该方法从损伤当天开始对大鼠进行监测，并持续24小时不间断地观察长达4周。我们选择使用无线遥测系统，该系统具有多项优势：首先，大鼠可在笼内自由活动，从而减少应激反应；其次，由于大鼠自身可作为接地，因此可降低信号噪声。此外，我们当前的系统配备了加速度计，能够检测三个方向（X、Y和Z轴）的快速运动，有助于识别惊厥性癫痫发作事件。最后，无线遥测系统便于对大鼠进行日常管理，例如补充生理盐水注射、称重以及进行神经功能缺损评分，而这些操作在大鼠连接固定导线时会变得复杂。然而，该方法也存在若干局限性：首先，可同时记录多达八只大鼠的系统的初始成本约为60,000美元；其次，系统供电依赖电池，需每日监测并更换电池，而电池更换频率受采样率影响。在1000 Hz采样率下，通常每周更换一次电池。有限的电源供应还限制了系统仅能记录四个脑电图（EEG）信号。最后，虽然信号丢失情况较少，但仍偶有发生。尽管如此，该方法仍为监测创伤后癫痫发生提供了稳定且可靠的手段，并有助于发现新的治疗策略。
方案
所有实验程序均经纽约州立大学布法罗分校机构动物照护与使用委员会批准，并遵循其指南。
1. 液体打击损伤
- 穿戴实验服或手术服、外科口罩、外科手套和头部覆盖物，并对所有接触手术部位的器械和材料进行灭菌。
- 将一只10至12周龄、雄性、Wistar大鼠（350–400 g）置于适合大鼠使用的适当大小的诱导室中，使用3%异氟烷和1 L/min氧气进行麻醉。待大鼠意识丧失后，将其从诱导室中取出并转移至准备区域。将无菌眼用软膏涂抹于双眼。
- 使用装有#40刀头的电动剪毛器，从大鼠眼睛上方至耳后基部剃除头部毛发 ，以获得足够的手术视野。清除手术区域所有松散的剪下毛发。
- 用2%氯己定溶液擦拭剃净的头皮，随后使用70%乙醇进行消毒。从中心开始，向外以同心圆方式远离切口部位擦拭。重复此过程3次。以相同方式涂抹碘伏溶液，并使其自然干燥。
- 将麻醉后的大鼠固定于立体定位仪中，并通过鼻罩持续给予2–3%异氟烷和1 L/min氧气维持麻醉。检查后肢回缩反射和眼睑反射是否消失，以确认大鼠处于手术麻醉水平。
- 在整个手术过程中监测呼吸频率、心率、体温和血氧饱和度。维持心率在300–400次/分钟之间，SpO2高于90%。
注意：可将脉搏血氧仪连接至大鼠后肢足部，持续读取心率和SpO2数值。心率超过400次/分钟提示麻醉深度不足。可在大鼠身下放置一个与直肠温度计联动、设定为37 °C的自调节加热垫，以维持体温。配备光源的体视显微镜结合光纤灯有助于清晰观察手术过程。 - 在切口前10– 15分钟，使用23号针头在切口部位皮内注射0.5%盐酸布比卡因，以实现局部镇痛。
- 使用#10手术刀片在头皮皮肤和肌肉上做一条1.5–2.5 cm的正中切口。牵开皮肤和肌肉以暴露颅骨，提供清晰的手术视野。用无菌棉签将骨面下方的筋膜和脂肪组织轻轻推开。
注意：电凝装置有助于快速实现止血。 - 使用手术刮匙修平左侧顶骨外侧嵴，形成光滑平坦的表面，以便双雌式鲁尔锁接头底部能与颅骨表面完全贴合。
- 用含2.0 mg/mL庆大霉素的无菌生理盐水冲洗颅骨表面及周围组织。用无菌棉签吸除多余液体。
- 将3%过氧化氢涂抹于颅骨表面以干燥骨面。
注意：若骨面未充分干燥，牙科水泥将无法良好粘附，无法形成牢固密封。 - 在左侧顶骨上制作一个直径5 mm的颅骨切除区域。
注意：将环钻钻头安装在固定于立体定位仪的电动钻上，有助于启动颅骨切除。使用手动钻配合直径5 mm的环钻缓慢完成剩余骨质的切除。接近完成时，应反向旋转环钻，以防损伤下方的硬脑膜。此时骨片周围会出现骨质变薄现象，轻压骨瓣时可感到松动。 - 使用手术刮匙和光滑组织镊子取出骨瓣。
注意：可能会有少量出血，但可通过无菌棉签轻压迅速实现止血。 - 在体视显微镜和照明下目视检查硬脑膜是否有破裂迹象。 颅骨切除区域周围将残留一圈薄层骨缘。 使用光滑组织镊子小心去除该骨缘，注意避免损伤硬脑膜。
- 用70%乙醇擦拭颅骨，清除骨屑并进一步干燥颅骨。
- 在鲁尔锁接头底部边缘周围涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂，并将其固定于颅骨上的颅骨切除部位，注意不要堵塞开口。注意避免粘合剂接触硬脑膜。此外，再在接头外底座周围加涂一层薄粘合剂，进一步固定鲁尔锁接头。
- 配制牙科水泥混悬液。将水泥涂布于颅骨表面，覆盖鲁尔锁接头基部周围区域，以牢固固定接头。
- 使用注射器和针头将无菌无防腐剂的人工脑脊液（CSF）溶液（pH 7.4）注入鲁尔锁接头内，直至液面在接头边缘上方形成凸面液滴。
注意：该溶液可在牙科水泥固化过程中保持硬脑膜湿润，同时用于判断密封完整性。若液面下降，提示系统存在泄漏，必须拆除并更换鲁尔锁接头。 - 待牙科水泥完全固化后，停止气体麻醉，并将大鼠从立体定位仪中取出。
- 将大鼠放置于FPI装置旁的平台上。
- FPI装置末端的压力传感器连接一段弯曲金属尖端，从液体储罐延伸而出。将一段12 cm长的压力管一端连接至弯曲尖端，另一端连接一个2 cm长的雄性鲁尔锁旋转接头。通过将大鼠颅骨上的雌性接头端与雄性接头连接，将大鼠固定于FPI装置上。
注意：确保连接紧密，并排除系统内所有气泡。 - 将动物置于胸卧位，并反复检查回缩反射是否恢复。一旦大鼠恢复回缩反射但仍处于镇静状态，立即释放FPI装置的摆锤，产生一次持续20 ms的压力脉冲以诱导损伤。
注意：切勿在动物深度麻醉状态下诱导损伤，否则易因神经源性肺水肿导致死亡率升高。不同设备存在差异，但在本实验所用装置中，锤击角度为17°时可产生2.2–2.3个大气压的压力脉冲。假手术对照动物接受除实际液体脉冲外的所有相同操作步骤。 - 损伤后立即断开大鼠与FPI装置的连接，将其置于胸卧位，并通过鼻罩提供辅助氧气（1 L/min），直至自主呼吸恢复。呼吸暂停是预期的损伤后果。必要时可通过球囊阀面罩进行间歇性人工通气，直至大鼠恢复自主呼吸。
注意：通常呼吸暂停持续时间少于2分钟。压力脉冲施加后，由于儿茶酚胺激增，可立即观察到心率短暂快速上升（>500次/分钟）。可通过连接于大鼠足部的脉搏血氧仪监测该现象，其可能提示发生了严重损伤。 - 持续监测大鼠，并记录翻正反射恢复时间（四肢稳定行走）。
- 每只大鼠所接受的大气压脉冲强度应相互之间差异不超过±0.05个大气压。确认每次压力脉冲在示波器上均产生波形平滑、振幅和持续时间一致的信号。
注意：信号噪声可能提示系统内存在气泡，必须在施加损伤脉冲前排除。在本实验中，导致严重损伤的大气压脉冲通常使动物翻正时间达30–60分钟。该范围的翻正时间与约40–50%的死亡率相关。 - 皮下注射10 mL预温生理盐水，作为支持性护理措施。
- 将大鼠放回其原饲养笼，使其恢复至少4小时。
注意：若大鼠在术后立即再次接受麻醉，观察到死亡率升高。
2. 皮层脑电图电极的植入及视频脑电图记录
- 损伤后4 h，按照先前所述方法麻醉大鼠，并将其重新置于立体定位仪中，以移除鲁尔锁接头和牙科水泥。
注意：接头和胶水在适度压力下极易折断。移除接头时，应仔细检查硬脑膜是否有破裂或损伤。立即 处死任何硬脑膜受损的动物。 - 在计划钻5个引导孔的每个颅骨位置上，分别滴加一小滴0.5%盐酸布比卡因（bupivacaine hydrochloride） 图1).
- 使用手持式0.1 mm钻头在颅骨上钻导孔。
- 在以下位置的每个导孔中固定一个不锈钢电极螺钉：参考电极螺钉置于小脑上方、人字缝后方尾侧区域。记录电极分别置于：1）颅骨切除区同侧且头侧的大脑半球上方；2）颅骨切除区同侧且尾侧的大脑半球上方；3）颅骨切除区对侧且头侧的大脑半球上方；4）颅骨切除区对侧且尾侧的大脑半球上方。
- 用70%乙醇擦拭颅骨，以去除任何骨屑。
- 用一层薄薄的无菌骨蜡覆盖颅骨切除部位，以遮盖暴露的硬脑膜。
- 将电极阵列通过将带有颜色编码的电极导线裸露端紧密缠绕在指定的不锈钢电极螺钉上，连接至5个脑电图（EEG）电极。
注意：每根电极导线的另一端需插入基座连接器内指定的特定位置。 - 配制骨水泥浆液。
- 将电极导线收拢至基座下方盘成线圈，并使用骨水泥将导线和基座固定到位。保持基座位置稳定，直至骨水泥完全固化。
注意：骨骼必须完全干燥且无任何残留血液，以确保良好粘附并防止发射器过早脱落。 - 在将动物从立体定位仪中取出之前，将装有新电池的无线发射器连接到基座上。
- 将动物放回其饲养笼中，将笼子置于接收器附近，并确保其处于指定视频摄像机的视野范围内。启动视频/脑电图记录。
3. 视频脑电图记录的采集
- 在采集大鼠脑电图（EEG）信号之前，需对用于EEG采集的大鼠饲养房间进行频率扫描，以识别可能存在的干扰频率，避免在存在背景噪声的频率下进行EEG记录。
- 将所有发射器设置为无干扰的特定频率。
- 设置每个可编程发射器的采样频率和输入范围。
注意：此操作可使用系统制造商提供的智能工具完成。发射器最高采样速率为1000 Hz，最大输入范围为±10 mV。本实验中分析的EEG信号频率范围为0.5 Hz至30 Hz ，因此采样率设置为250 Hz。我们通常观察到 振幅低于1 mV，因此输入范围设置为±2 mV。 - 使用制造商提供的EEG采集软件，从损伤当天开始连续记录视频-EEG信号，通过唯一频率将每个无线发射器连接至特定接收器。
注意：每对发射器-接收器可同时监测4个单极EEG通道，以及X、Y和Z三个方向的加速度信号。EEG数据可写入存储服务器，视频数据应保存在与存储服务器相连的NAS设备上。EEG分析软件根据存储服务器的时间同步视频与EEG记录。 - 使用视频采集软件，通过每只大鼠专用的200万像素分辨率摄像头（1920 × 1080）以每秒30帧的速度记录其视频。
注意：每个摄像头均配备独立的红外照明装置，用于夜间视频采集。 - 配置系统每24小时自动将所有视频和EEG记录保存至存储服务器。视频文件体积较大。
4. 视频/脑电图分析
- 以 1/10 秒的时间分辨率将视频与每段 EEG 记录同步。通过使用系统制造商提供的视频/EEG 分析软件，生成一个元文件，其中包含 EEG 和视频各自精确时间的时间戳。
- 手动浏览 EEG 记录，识别定义癫痫发作活动的索引事件。
- 利用视频/EEG 分析软件及索引 EEG 事件，创建一个配置文件，该文件使用关键参数（例如特定频段的功率、频段功率与总功率的比值、加速度阈值等）来定义潜在癫痫发作事件的特征。
- 运行 EEG 分析软件，根据配置文件中选定的参数，识别 EEG 记录中符合条件的潜在区域。
注意：EEG 分析软件支持自动癫痫发作检测，可高亮显示 EEG 信号中的感兴趣区域，并提供全信号范围内的 FFT 功率谱分析。 - 通过采集期间录制的视频记录，确认潜在的惊厥性癫痫发作，这些视频记录已与每只大鼠对应的 EEG 记录同步。
结果
在本模型中，我们对成年雄性Wistar大鼠诱导了重度创伤性脑损伤（TBI）。在本文所述条件下，通常观察到的死亡率为40–50%，翻正反射时间约为30–60分钟，与先前报道一致20。我们能够从损伤当天开始，持续24小时/天采集视频与脑电图（EEG）记录。显示四个单极EEG电极和一个参考电极位置的示意图见图1A。展示在本文所述条件下预期出现的TBI病灶位置与形态的图像见图1B–D。在本文所述条件下，我们持续在TBI后前3天内观察到δ波减慢。损伤较轻的大鼠表现出单侧、间歇性的δ波减慢（图2C–D）。相比之下，较严重的损伤后则出现持续性、双侧性的δ波减慢（图3C–D）。所有TBI大鼠均持续观察到不同程度的δ波减慢，但在假手术（仅行开颅术）的对照组大鼠中未检测到任何δ波减慢（图2A–B；3A–B）。大多数TBI大鼠在损伤后前3天内持续观察到广泛的δ波减慢。有趣的是，大鼠在损伤后前3天通常表现出明显的体重下降。非惊厥性癫痫发作偶尔在TBI后第一周内被观察到（图4C–D）。临床癫痫发作表现为与直立和跌倒相关的尖波簇以及前肢强直性阵挛，可在TBI后1周出现（图5C–D）。最后，图6展示了因电池故障导致的偶发性间歇性信号丢失和信号完全丧失的代表性图像。
图 1．开颅位置、电极放置位置及病灶部位。（A）显示大鼠颅骨的示意图，其中左侧半球的开颅部位以灰色圆圈表示，四个单极电极（黑点；1、2、3、4）位于前囟（Bregma）与后囟（Lambda）之间，参考电极（黑点，R）位于中线，后囟后方；（B）显示冠状位死后T2加权MRI扫描图像，病灶位置以红色圆圈标示；（C）显示皮层的二维图谱，其中病灶的位置和大小以蓝色区域标示；（D）显示尼氏染色的冠状切片，病灶区域以方框标出，右侧图像为病灶区域的100倍放大图。 请点击此处查看该图的高清版本。
图2．中度创伤性脑损伤（TBI）当天记录到的单侧间歇性δ波减慢。 （A）显示了假手术未受伤对照组大鼠在手术当天的90秒脑电图（EEG）记录。四个通道均显示。从第3通道中提取框选区域内的10秒记录，以更清晰地观察基础EEG模式。随后从中选取2048毫秒的EPOC片段用于相应的快速傅里叶变换（FFT）分析。（B）为手术当天假手术未受伤动物所选2048毫秒EPOC片段的FFT分析结果。（C）显示了一段90秒的EEG记录，展示了中度损伤动物在损伤当天出现的单侧间歇性δ波减慢模式。同样从第3通道提取框选区域内的10秒记录，以更清楚地观察δ波减慢的EEG模式，并从中选取2048毫秒的EPOC片段进行相应的FFT分析。（D）为中度TBI动物在损伤当天所选2048毫秒EPOC片段的FFT分析结果。90秒EEG记录自上而下依次为生物电位通道1、2、3、4，对应于颅骨切除部位周围的电极位置，如图1所示。灰色垂直标记表示EEG记录中每1秒的时间间隔。所有EEG记录的显示尺度均为（±500 µV）。在FFT分析图中，整体分析频率范围为0.5–30 Hz，并进一步划分为四个独立频段：δ波（黄色，0.5–4 Hz）、θ波（紫色，4–8 Hz）、α波（红色，8–12 Hz）和β波（绿色，12–30 Hz）。FFT分析图中的%（功率）图表示每个预设频段对所分析EPOC总功率的贡献百分比，从而实现对EEG波形模式的进一步数学表征。请点击此处查看该图的放大版本。
图3．重度TBI当天记录的双侧持续性δ波减慢。 （A）显示了手术当天假手术对照组大鼠的90秒EEG轨迹，共呈现四个通道。从第3通道中提取框选区域的10秒轨迹，以便更清晰地观察基础EEG模式。随后从中选取2048毫秒的EPOC片段用于相应的FFT分析。（B）手术当天假手术动物所选2048毫秒EPOC片段的FFT分析结果。（C）显示了重度损伤动物在受伤当天表现出的持续性双侧δ波减慢模式的90秒EEG轨迹。同样从第3通道提取框选区域的10秒轨迹，以更清楚地展示δ波减慢的EEG特征，并从中选取2048毫秒的EPOC片段进行相应的FFT分析。（D）重度TBI动物在受伤当天所选2048毫秒EPOC片段的FFT分析结果。90秒EEG轨迹从上至下依次为生物电位通道1、2、3、4，对应于颅骨切除部位周围的电极位置，如图1所示。灰色垂直标记表示EEG轨迹上的1秒时间间隔。所有EEG轨迹的电压刻度均为（±500 µV）。在FFT分析图中，总分析频率范围为0.5–30 Hz，并进一步划分为四个独立的频段：δ波（黄色，0.5–4 Hz）、θ波（紫色，4–8 Hz）、α波（红色，8–12 Hz）和β波（绿色，12–30 Hz）。FFT分析中的%（功率）图显示了每个指定频段在所分析EPOC总功率中所占的百分比，从而实现对EEG波形模式的进一步数学表征。请点击此处查看该图的放大版本。
图4。重度创伤性脑损伤（TBI）后第3天记录到的非惊厥性电发作。 (A) 显示假手术对照组大鼠在手术后第3天25的90秒脑电图（EEG）记录，共展示四个通道。从第3通道中提取方框区域内的10秒片段，以更清晰地观察基线EEG模式。从中选取一段2048毫秒的EPOC片段用于相应的FFT分析。(B) 对手术后第3天25假手术未受伤动物所选2048毫秒EPOC片段进行的FFT分析。(C) 显示重度损伤后第325天的90秒EEG记录。可见双侧及全部四个记录通道中出现逐渐增强的快速尖峰放电模式。从第3通道提取方框区域内的10秒片段以更清晰地观察尖峰EEG模式，并从中选取2048毫秒的EPOC片段用于相应的FFT分析。(D) 对重度TBI动物在损伤当天所选2048毫秒EPOC片段进行的FFT分析。90秒EEG记录自上而下分别为生物电位1、2、3、4，对应于图1中颅骨切除部位周围的电极位置。灰色垂直标记表示EEG记录中每1秒的时间间隔。所有EEG记录的电压刻度均为(± 500 µV)。在FFT分析图中，总分析频率范围为0.5–30 Hz，并进一步划分为四个独立频段：Delta（黄色，0.5–4 Hz）、Theta（紫色，4–8 Hz）、Alpha（红色，8–12 Hz）和Beta（绿色，12–30 Hz）。FFT分析中的%（功率）图表示每个预定义频段对所分析EPOC总功率的贡献百分比，从而实现对EEG波形模式的进一步数学表征。请点击此处查看该图的高清版本。
图5．创伤性脑损伤（TBI）后第9天记录到的惊厥性电发作。 (A) 显示假手术、未受伤对照组大鼠在术后第9天的90秒脑电图（EEG）记录，共展示四个通道的信号。从第3通道中提取方框区域内的10秒片段，以便更清晰地观察基础脑电图模式。从中选取2048毫秒的EPOC段用于相应的FFT分析。(B) 对术后第9天假手术动物所选2048毫秒EPOC段进行的FFT分析。(C) 显示重度损伤后第9天的90秒脑电图记录。该图显示双侧及全部四个记录通道中均出现逐渐增强的快速尖峰模式。同样从第3通道提取方框区域内的10秒片段，以更清楚地展示尖峰脑电图模式，并从中选取2048毫秒的EPOC段用于相应的FFT分析。(D) 对重度TBI动物损伤后第9天所选2048毫秒EPOC段进行的FFT分析。90秒脑电图自上而下依次为生物电位1、2、3、4，对应于图1中颅骨切除部位周围的电极位置。灰色垂直标记表示脑电图中每1秒的时间间隔。所有脑电图均以(± 500 µV)的比例显示。在FFT分析图中，总分析频率范围为0.5–30 Hz，并进一步划分为四个独立频段：Delta（黄色，0.5–4 Hz）、Theta（紫色，4–8 Hz）、Alpha（红色，8–12 Hz）和Beta（绿色，12–30 Hz）。FFT分析图中的%(Power)图表示在所分析EPOC段的总功率中，各指定频段所占的百分比，从而实现对脑电图波形模式的进一步数学表征。请点击此处查看该图的高清版本。
图6．信号丢失。这些是EEG记录中由于发射器或接收器问题导致信号丢失的三种不同示例。（A）这是EEG记录中出现间歇性信号丢失的示例。（B）这是在连续无线遥测过程中因电池失效导致信号丢失在EEG轨迹上的表现示例。（C）在圆圈标记的区域内可见，当信号质量（QoS）从100降至0时，EEG轨迹变为平坦并停滞在0 µV。灰色垂直标记表示EEG轨迹上1秒的时间间隔。所有EEG轨迹的显示尺度均为（± 500 µV）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
关于FPI TBI模型所采用的具体参数和方法，不同实验室之间已报道存在显著差异14,26,27,28。这些不一致性导致了相互矛盾的研究结果，并使得各实验室之间的研究努力与成果难以统一。本文中，我们详细介绍了一种用于长期、连续视频/脑电图（EEG）记录以监测创伤后癫痫样活动的方法。采用所述方法获得可重复结果的过程中，多个步骤至关重要。
首先，由于创伤后癫痫的发生率与损伤严重程度相关，因此应采用可导致最严重创伤性脑损伤（TBI）的条件。具体而言，应进行5 mm的颅骨切除，以确保充分暴露足够大面积的硬脑膜。此外，将一个雌-雌型鲁尔锁装置固定在颅骨表面，其开口应正对颅骨切除部位。这与其他实验室所采用的方法不同，后者通常使用较小的颅骨切除（3 mm）和/或在颅骨切除部位内放置改装的针头接头，从而有效减小了开口尺寸。通过将鲁尔锁装置置于颅骨切除区域之外，可保持5 mm的开口大小。这些特定参数会影响施加于硬脑膜的总体力量。施加于硬脑膜的大气压力也显著影响所观察到的损伤严重程度。然而，大气压力具有高度变异性，且似乎依赖于设备。一些实验室报告施加了8–10 ms的壓力脉冲18。相比之下，本文所述方法产生的是20 ms的压力脉冲，这与其他似乎造成更严重损伤的实验室结果一致14,28。显然，诱发损伤的压力脉冲是各实验室之间存在较大差异的一个参数，必须通过实验加以确定。然而，损伤严重程度可根据死亡率（40–50%）和翻正反射时间（>30 min）的综合指标来判断26。研究中必须仅纳入硬脑膜完整的动物。此外，若颅骨切除部位被任何胶水或水泥堵塞，导致硬脑膜部分区域未能完全暴露于液体压力脉冲之下，则该动物应被排除在研究之外。 同样，鲁尔锁下方过多的胶水可能粘附于硬脑膜，在移除水泥帽时甚至会将硬脑膜一并撕脱，即使损伤操作本身已成功。 最后，示波器上压力脉冲曲线的平滑形态表明流体腔内无气泡存在，且提示活塞运动无阻力。
麻醉是另一个必须控制的关键因素。应将异氟烷暴露维持在能够保持手术麻醉水平的最低浓度。暴露于较高浓度异氟烷或暴露时间较长的大鼠更易发生神经源性肺水肿。颅骨准备是该方法的另一个关键环节，特别是干燥颅骨并清除所有骨屑，有助于防止大鼠过早自行移除发射器。
螺钉的放置以及脑电图导线的连接显然对获得稳定且可重复的记录至关重要。螺钉植入不可过深，以免对脑组织造成损伤。成年雄性Wistar大鼠（12周龄）开颅后所获取的骨瓣厚度通常为2 mm。应使用直径为2.5 mm的脑电图电极螺钉。可借助弯头蚊式止血钳的尖端作为间隔工具，确保螺钉仅延伸至颅骨基底部，而不会突入脑内。
本文介绍的方法确实存在一些局限性。电池需要定期更换，更换频率取决于采样率。当采样率为1000 Hz时，通常每周需更换一次电池。通过降低采样率，可以延长电池更换的时间间隔。该系统仅限于记录四个单极脑电图（EEG）电极的信号，但这一配置可实现每半球两个通道，能够区分局灶性和全面性事件，并能辨别前部与后部的脑电变化。尽管存在这些限制，该方法仍为在重度创伤性脑损伤（TBI）后进行连续视频/脑电图监测及癫痫样改变的检测提供了一种合理可行的手段。
本方法在创伤性脑损伤（TBI）后一个月内可诱导出脑电图和惊厥性癫痫发作。因此，该方法为研究预防重度TBI后癫痫发生的潜在治疗手段提供了合理的时间窗口。该方法还可用于探究与创伤后癫痫（PTE）相关的分子机制，并可能有助于发现可用于识别PTE高风险患者的潜在生物标志物。
披露
Chelasea R Richardson 是本研究所述无线遥测系统供应商 emka Scientific 的员工。
致谢
我们感谢 Paul Dressel 在图形设计和图表准备方面提供的宝贵支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.00 mm 钻头 | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
| 3M ESPE Durelon 羧酸盐水门汀 | 3M，德国诺伊斯 | 38019 | 牙科水门汀 |
| 4-0 缝合线 | Ethicon，新泽西州萨默维尔 | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk，26mm 1/2c 锥形针，30"（75cm），黑色编织不可吸收缝合线 |
| 5 mm 外径环钻 | Fine Science Tools | 18004-50 | |
| 骨蜡 | Medline Industries，伊利诺伊州门德尔辛 | REF DYNJBW25 | |
| 盐酸丁丙诺啡注射液（0.3 mg/mL），1 mL 小瓶 | Par Pharmalogical，纽约州栗树岭 | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
| Dumont #6 镊子 | Fine Science Tools | 11260-20 | |
| Dumont #7b 镊子 | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ecgAUTO | EMKA Technologies，弗吉尼亚州福尔斯彻奇 | ||
| 雌性鲁尔螺纹式接头透明聚碳酸酯 | Cole-Palmer 仪器 | SKO#45501-22 | 订单批次 #214271 |
| 脚踏式电钻 | Grobet USA，新泽西州卡尔施塔特 | 型号 C-300 | |
| GentaMax 100（硫酸庆大霉素溶液） | Phoenix，由 Clipper Distributing Company LLC 生产，密苏里州圣约瑟夫 | NDC 57319-520-05 | |
| Hill's 处方饮食 a/d 犬/猫用罐头 | Hill's 宠物营养公司，堪萨斯州托皮卡 | ||
| IOX2 软件 | EMKA Technologies，弗吉尼亚州福尔斯彻奇 | ||
| 异氟烷，USP | Piramal Enterprise Limited，印度安得拉邦 | NDC 66794-013-25 | |
| IsoTech 麻醉机 | SurgiVet | WWV9000 | |
| 侧方 FPI 装置 | AmScien | 302 | 带弯曲尖端，配有压力管延长段，通过螺口连接器（Cole-Palmer；#4550-22）连接 |
| Leica A60 体视显微镜 | Leica Biosystems，弗吉尼亚州里士满 | PN: 10 450 488 | |
| Marcaine（0.5%）盐酸布比卡因注射液 USP 5 mg/mL | Hospira，伊利诺伊州莱克福里斯特 | CA-3627 | 50mL 多剂量小瓶；NDC 0409-1610-50 |
| 微型 Adson 镊子 | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| 带缝线切割器的 Olsen-Hegar 持针器 | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| PALACOS R+G 含庆大霉素骨水泥 | Heraeus, | REF: 5036964 | 含 1 × 0.5g 庆大霉素的X线显影骨水泥 |
| Physio Suite | Kent Scientific，康涅狄格州特林顿 | ||
| 聚维酮碘溶液 | 贝塔丁 | ||
| Puralube Vet 软膏 | Dechra Veterinary Products，堪萨斯州欧弗兰帕克 | NDC 17033-211-38 | |
| 手术刀片（#10）及刀柄 | Integra Miltex，宾夕法尼亚州约克 | REF: 4-110 | |
| 手术刀柄 - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| 镰状刀 | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm 弯曲刀片，圆形手柄，总长 168mm，6.6 英寸 |
| Silverstein 微型镜 | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 直径 3mm，倾斜 45 度，总长 180mm，7.2 英寸 |
| 存储 NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
| Synology 助手 | Synology Inc. | ||
| 热烧灼装置 | Geiger Medical Technology，爱荷华州德拉科议会岩 | 型号 NO: 150 | |
| Vetivex | Dechra Veterinary Products，堪萨斯州欧弗兰帕克 | 兽用 pHyLyteTM 注射液 pH 7.4（多种电解质注射液，1 型，USP） | |
| 摄像机 | TRENDnet，加利福尼亚州托伦斯 | TV-IP314PI | 室内外 4MP H.265 WDR PoE 红外子弹型网络摄像机 |
| 视频 NAS | Synology Inc. | DS916 | |
| Wistar IGS 大鼠 | Charles River | 品系编号 003 | 损伤时为 12 周龄 |
| Wullstein 牵开器 | Fine Science Tools | 17018-11 |
参考文献
- Flanagan, S. R. Invited Commentary on Centers for Disease Control and Prevention Report to Congress: Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96, 1753-1755 (2015).
- Annegers, J. F., Coan, S. P., Hauser, W. A., Leestma, J., Duffell, W., Tarver, B. Epilepsy, vagal nerve stimulation by the NCP system, mortality, and sudden, unexpected, unexplained death. Epilepsia. 39, 206-212 (1998).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Englander, J., et al. Analyzing risk factors for late posttraumatic seizures: a prospective, multicenter investigation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 84, 365-373 (2003).
- Faul, M. X. L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , Atlanta (GA). (2010).
- Herman, S. T. Epilepsy after brain insult: targeting epileptogenesis. Neurology. 59, 21-26 (2002).
- Annegers, J. F., Coan, S. P. The risks of epilepsy after traumatic brain injury. Seizure. 9, 453-457 (2000).
- Christensen, J., Pedersen, M. G., Pedersen, C. B., Sidenius, P., Olsen, J., Vestergaard, M. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373, 1105-1110 (2009).
- Webb, T. S., Whitehead, C. R., Wells, T. S., Gore, R. K., Otte, C. N. Neurologically-related sequelae associated with mild traumatic brain injury. Brain Injury. 29, 430-437 (2015).
- Mahler, B., Carlsson, S., Andersson, T., Adelow, C., Ahlbom, A., Tomson, T. Unprovoked seizures after traumatic brain injury: A population-based case-control study. Epilepsia. 56, 1438-1444 (2015).
- Wang, H., et al. Post-traumatic seizures--a prospective, multicenter, large case study after head injury in China. Epilepsy Research. 107, 272-278 (2013).
- Simonato, M., French, J. A., Galanopoulou, A. S., O'Brien, T. J. Issues for new antiepilepsy drug development. Current Opinion in Neurology. 26, 195-200 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Review Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscienc. 140, 685-697 (2006).
- McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Curia, G., Eastman, C. L., Miller, J. W., D'Ambrosio, R. Modeling Post-Traumatic Epilepsy for Therapy Development. Translational Research in Traumatic Brain Injury. Laskowitz, D., Grant, G. , Boca Raton (FL). (2016).
- D'Ambrosio, R., Fairbanks, J. P., Fender, J. S., Born, D. E., Doyle, D. L., Miller, J. W. Post-traumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat. Brain. 127, 304-314 (2004).
- Saatman, K. E., et al. Classification of traumatic brain injury for targeted therapies. Journal of Neurotrauma. 25, 719-738 (2008).
- Smith, D., Brooke, D., Wohlgehagen, E., Rau, T., Poulsen, D. Temporal and Spatial Changes in the Pattern of Iba1 and CD68 Staining in the Rat Brain Following Severe Traumatic Brain Injury. Modern Research in Inflammation. 4, 9-23 (2015).
- Ndode-Ekane, X. E., et al. Harmonization of lateral fluid-percussion injury model production and post-injury monitoring in a preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 151, 7-16 (2019).
- Ciszek, R., et al. Informatics tools to assess the success of procedural harmonization in preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 17-26 (2019).
- Immonen, R., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter MRI biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 46-57 (2019).
- Kamnaksh, A., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter plasma protein and miRNA biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 149, 92-101 (2019).
- Redell, J. B., Moore, A. N., Ward, N. H., Hergenroeder, G. W., Dash, P. K. Human traumatic brain injury alters plasma microRNA levels. Journal of Neurotrauma. 27, 2147-2156 (2010).
- Smith, D., et al. Convulsive seizures and EEG spikes after lateral fluid-percussion injury in the rat. Epilepsy Research. 147, 87-94 (2018).
- Eastman, C. L., Fender, J. S., Temkin, N. R., D'Ambrosio, R. Optimized methods for epilepsy therapy development using an etiologically realistic model of focal epilepsy in the rat. Experimental Neurology. 264, 150-162 (2015).
- Shultz, S. R., et al. Can structural or functional changes following traumatic brain injury in the rat predict epileptic outcome. Epilepsia. 54, 1240-1250 (2013).
重印与许可
