本文介绍一种间接ELISA夹心免疫捕获法，用于测定狂犬病疫苗中免疫原性糖蛋白的含量。该检测方法采用一种可识别糖蛋白三聚体的中和性单克隆抗体（mAb-D1），可作为体内NIH试验的替代方法，用于在生产过程中监测疫苗效力的一致性。
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本文内容
摘要
摘要
全球对动物福利日益增长的关注正推动生产商和国家控制实验室（OMCLs）遵循“3R”原则，即替代、减少和优化实验动物的使用。世界卫生组织（WHO）和欧洲层面均推荐开发体外方法，作为评估狂犬病疫苗效力的NIH试验的替代方案。在狂犬病病毒（RABV）颗粒表面，糖蛋白的三聚体构成主要免疫原，可诱导产生病毒中和抗体（VNAbs）。目前已开发出一种ELISA检测方法，其中中和性单克隆抗体（mAb-D1）可特异性识别糖蛋白的三聚体形式，用于测定疫苗批次生产过程中天然折叠的三聚体糖蛋白含量。该体外效力检测方法与NIH试验具有良好的一致性，并已在狂犬病疫苗生产商和OMCLs的协作试验中被证明适用。避免使用动物是近期未来可实现的目标。
本方法基于一种间接ELISA夹心免疫捕获技术，使用单克隆抗体D1（mAb-D1）识别三聚体狂犬病病毒（RABV）糖蛋白的抗原位点III（氨基酸330至338），即具有免疫原性的RABV抗原。mAb-D1同时用于包被和检测疫苗批次中存在的糖蛋白三聚体。由于该表位的识别依赖于其构象特性，因此可能已变性（免疫原性较低）的糖蛋白无法被mAb-D1捕获和检测。待测疫苗在预先用mAb-D1致敏的酶标板中孵育。结合的三聚体RABV糖蛋白通过再次加入辣根过氧化物酶标记的mAb-D1进行识别，随后在底物和显色剂存在下显色。通过比较待测疫苗与参考疫苗的吸光度，可确定其免疫原性糖蛋白的含量。
引言
50 多年来，NIH 测试1 是用于在批次放行前评估狂犬病疫苗效力的金标准方法。该试验包括将待测疫苗通过腹腔免疫接种于若干组小鼠，14天后通过颅内（IC）途径以狂犬病病毒（RABV）挑战病毒标准株（CVS）进行攻击。疫苗效力根据颅内攻击后存活小鼠的比例进行评估。尽管世界卫生组织（WHO）2 欧洲药典3 仍需要通过NIH测试来评估疫苗效力，但该测试存在若干障碍：结果变异性较高4；在攻毒过程中使用具有感染性的狂犬病病毒（RABV），这需要熟练的技术操作和严格的生物安全措施；实验需使用大量动物，且攻毒的严重性引发严重的伦理关切5一种较温和的检测方法已被开发出来：在腹腔免疫接种两周后，不对小鼠进行颅内攻击，而是采血并利用体外中和试验检测其血清中是否存在特异性的狂犬病病毒中和抗体（VNAbs）。然而，该方法仍需牺牲大量实验小鼠，尽管其目前已用于兽用疫苗的检测。6,7 并已被考虑用于人类疫苗8.
目前，国际9和欧洲
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方案
1. 安全预防措施
注意：该方法适用于活体狂犬病病毒（RABV）和灭活疫苗。
- 遵循良好的实验室规范和安全操作程序。
- 穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括一次性实验服、手套、口罩、护目镜等。
- 当滴定活病毒时，应在II级生物安全柜中操作。
- 所有与样本接触过的材料（试剂、洗涤液等）均应视为具有传染性的物质。
- 将受污染的材料浸入含2.5%次氯酸钠的漂白剂溶液中30分钟，以进行去污处理。
- 根据良好实验室规范操作化学品。
2. 准备
- 尽可能使用分析纯试剂。
- 现配包被缓冲液/碳酸盐缓冲液、封闭缓冲液、稀释液和柠檬酸盐缓冲液（表1），经0.45或0.22 µm滤膜过滤后，于4 °C保存一天，使用前确保其分析纯度。
- 使用前30分钟将试剂平衡至室温（+18 °C至+25 °C），并轻轻混匀以确保均一。
3. 微孔板致敏
注意：使用经过优化、可高效结合免疫球蛋白的96孔吸附免疫测定板（例如，参见材料表）。
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结果
在以下示例中，使用参考疫苗批号09（由纯化的灭活狂犬病病毒颗粒组成，PV疫苗株）。该疫苗中糖蛋白三聚体（10 µg/mL）的含量是通过测定病毒总蛋白量（BCA法）并结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳评估糖蛋白所占比例后确定的。此外，也可使用经校准的参考疫苗，例如世界卫生组织第六代狂犬病疫苗国际标准品（WHO 6th International Standard，NIBSC编号：07/162）。
表3 显示了一次典型实验的OD值（492 nm）。利用这些值，通过以下方式绘制参考疫苗曲线：（1）以不同稀释度的参考疫苗的平均OD值（减去空白孔的平均OD值）作为纵坐标（线性刻度）；（2）以糖蛋白三聚体的浓度（ng/mL）作为横坐标（对数刻度）（图1）。
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讨论
单克隆抗体 mAb-D1 所识别的表位位于 RABV 糖蛋白的抗原位点 III，该位点不仅是诱导病毒中和抗体（VNAbs）的免疫优势区域，还参与神经毒力、致病性40,41以及受体识别42。在糖蛋白上还存在另一个重要的抗原位点，即抗原位点 II43，已从中分离出多种单克隆抗体，例如 mAb-WI-111235。这些抗体也可用于类似类型的实验。
ELISA体外方法的一个局限性在于，所使用的单克隆抗体识别的表位必须在待测狂犬病病毒株中保持保守。迄今为止，用于人用狂犬病疫苗的所有经典毒株均可被mAb-D1识别。然而，动物疫苗中使用的狂犬病病毒株具有更高的多样性，未来可能构成问题。不过，如前所述，可通过使用识别RABV糖蛋白不同抗原位点的其他单克隆抗体作为包被和检测抗体，应用相同的检测方法，从而克服这一问题
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Sylvie Morgeaux 博士和 Jean-Michel Chapsal 博士在建立疫苗批次 ELISA 检测方法以及组织国际研讨会和协作研究中所作出的重要贡献。感谢 Sabrina Kali 对稿件的审阅。Pierre Perrin 博士负责单克隆抗体 mAb-D1 的分离与表征。本工作主要由巴斯德研究所提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| II 级生物安全柜 | ThermoFisher Scientific | 10445753 | 若对活病毒进行滴定 |
| 透明平底免疫非无菌96孔板，400 µL，MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | 有利于与负载的抗体结合 |
| Equip Labo 聚丙烯实验室通风橱 | ThermoFisher Scientific | 12576606 | 用于硫酸的配制 |
| 免疫学强结合板 MAXISORP 平底吸附 96孔板 | Dutscher | 55303 | 有利于与负载的抗体结合 |
| 微孔板封板膜（100片） | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| 微量滴定板 单模式读板机 Sunrise | TECAN | ||
| 微孔板振荡孵育器 | Dutscher | 441504 | |
| 酶标洗板机 Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| 多通道移液器（30-300 µL）12通道 | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| 单通道移液器（试剂盒 2：Finnpipettes F2 0.2-2） μ2-20 微升 μL，20-200 μL && 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |
参考文献
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
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重印与许可
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