植入异丙肾上腺素微型泵以诱导小鼠心力衰竭

摘要

通过植入渗透泵长期给予异丙肾上腺素已被广泛用于模拟小鼠的晚期心力衰竭。本文中，我们详细描述了微型泵植入手术的方法，以实现连续3周的异丙肾上腺素给药，以及通过超声心动图评估模型成功建立的方法。

摘要

异丙肾上腺素（ISO）是一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂，广泛用于在小鼠中诱导心脏损伤。急性模型可模拟应激性心肌病，而通过渗透泵给药的慢性模型则可模拟人类的晚期心力衰竭。本方案旨在通过植入式微型泵建立小鼠慢性ISO诱导的心力衰竭模型。该方法已成功应用于100多个近交系小鼠品系。文中详细描述了微型泵植入手术技术，适用于所有希望建立小鼠心力衰竭模型的研究人员。此外，还提供了各品系小鼠基于超声心动图参数的每周心脏重构变化以及预期的模型建立时间。总之，该方法简单且可重复。通过植入式微型泵持续给予ISO 3至4周，足以诱导心脏重构。最后，可通过连续超声心动图检测心肌肥厚、心室扩张和功能障碍，从而在活体动物中评估ISO模型建立的成功与否。

引言

射血分数降低的心力衰竭（HFrEF）常伴随交感神经系统为维持心血管稳态而产生的明确可识别的代偿性反应¹。长期激活可导致血流动力学应激以及对心脏和循环系统的有害影响。这些机制已成为现代心力衰竭药物治疗的基石，并在心力衰竭进展及神经激素系统治疗性拮抗中发挥重要作用¹。

目前有多种小鼠模型可用于心力衰竭的基础研究。基因模型在探索分子治疗策略和研究信号通路方面具有优势。然而，这些模型可能与常见类型的心力衰竭并不相关。其他常用模型包括左前降支（LAD）冠状动脉结扎、经主动脉缩窄（TAC）和异丙肾上腺素（ISO）诱导模型，每种模型分别模拟不同的病理病因^2,3,4,5,6。LAD冠状动脉结扎可诱导前壁心肌梗死，从而建立特异性的缺血性心肌病模型。TAC通过诱发急性压力超负荷，建立高血压性心力衰竭模型。尽管可通过测量压力梯度对心肌肥厚程度进行分层，但其高血压的急性发作缺乏直接的临床相关性⁴。LAD和TAC模型均需要较高的外科手术操作技术。急性ISO心力衰竭模型可模拟应激性心肌病（又称Takotsubo综合征），其特征为儿茶酚胺水平显著升高，并出现类似急性心肌梗死的左心室功能异常^7,8。相比之下，慢性ISO心力衰竭模型则表现出晚期心力衰竭的典型症状，并伴有持续升高的儿茶酚胺水平¹。慢性ISO模型的优点在于，它能够提供持续的肾上腺素能刺激，模拟晚期心力衰竭状态，且建模相对简便。研究者应根据所关注的特定病理过程，选择最合适的动物模型。

该方法的总体目标是通过植入微型泵持续释放异丙肾上腺素（ISO），在小鼠中诱导心力衰竭，以模拟心力衰竭患者体内存在的慢性交感神经激活状态¹。该方法操作简便且可重复。尽管不同小鼠品系之间存在明显差异，但在3至4周内以30 mg/kg/天的剂量给予ISO，足以在大多数小鼠中诱导心脏重构。具体而言，ISO在第1周引起促心肌肥厚的代偿性阶段，随后在第2周和第3周出现心壁变薄、心室扩张以及收缩功能下降²。ISO模型构建是否成功可通过体内连续超声心动图评估，观察是否存在心肌肥厚、心室扩张及心室功能障碍；也可通过体外对收获的心脏组织进行组织学和分子学分析，检测心肌内脂质积聚、纤维化、内质网应激、细胞凋亡以及基因表达变化来评估^9,10,11,12。

方案

本方案遵循加州大学洛杉矶分校动物护理指南（ARC方案编号 #2010-075）。建议读者遵循各自机构经IACUC批准的方案，因为围手术期小鼠护理和镇痛管理可能因机构而异。

1. 异丙肾上腺素渗透泵的制备

注意：该操作已在100多个近交系小鼠中成功应用，适用于9周龄以上、体重18克以上的雌性小鼠，部分品系的雄性小鼠亦适用。本操作对小鼠体重无上限要求。请始终设置年龄匹配的对照组，因为目前尚不清楚处理年龄是否会影响异丙肾上腺素诱导的心力衰竭易感性。

1. 称重并记录每只小鼠的体重。
2. 根据每只小鼠的体重计算异丙肾上腺素的合适剂量和浓度（见表1；补充文件）。
   注意：本实验所用的渗透泵（材料表）储液腔体积为100 µL，设计用于持续输注药物，最长可达28天。每只泵额外准备20 µL异丙肾上腺素溶液，以补偿灌注过程中填充管内的液体损耗。
3. 使用分析天平称取适量异丙肾上腺素（表1），溶于120 µL无菌0.9% NaCl溶液中。剧烈吹打或涡旋振荡1分钟，确保异丙肾上腺素完全溶解。
   注意：渗透泵的制备应在生物安全柜中进行。操作时应佩戴外科手套。建议在整个渗透泵制备及手术植入过程中均采用无菌操作技术。
4. 称量并记录空渗透泵及其流量调节器的总重量，随后取下流量调节器。
5. 用1.0 mL注射器吸取120 µL异丙肾上腺素溶液，并连接渗透泵配套的27号钝头填充管。
   注意：确保注射器和填充管内无气泡。
6. 将渗透泵保持直立状态，将填充管从泵顶部开口插入，直至管尖接近泵储液腔底部。
7. 缓慢推动注射器活塞，将异丙肾上腺素溶液注入泵内，直至液面升至泵开口处。
8. 小心拔出填充管，并擦去多余液体。
9. 重新插入流量调节器以封闭泵体，并擦去任何残留液体。
10. 通过重新称量渗透泵确认储液腔填充量是否超过90%。
    注意：对照组泵的制备方法相同，仅以无菌0.9% NaCl溶液填充储液腔。

2. 手术器械的准备

1. 清洁所有手术器械，包括光纤O形圈照明显微镜光源、2把镊子、持针器、热珠灭菌器、玻璃珠和剪刀（材料表）。
2. 将手术器械在121°C下高压灭菌30分钟，以在手术前对器械进行灭菌。

3. 异丙肾上腺素渗透泵手术植入

1. 将小鼠置于诱导室中，使用含3%异氟烷、95% O₂和5% CO₂的混合气体进行麻醉诱导，随后通过鼻罩以2%异氟烷维持麻醉状态。
2. 皮下注射5 mg/kg卡洛芬至颈背部肩胛间区域，以提供镇痛作用。
3. 在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜脱水。
4. 通过监测呼吸频率、脚趾夹捏反射以及黏膜颜色来评估麻醉深度。
5. 将小鼠仰卧位放置于加热垫上，去除下腹部毛发，并使用聚维酮碘或氯己定对皮肤进行消毒。
   注意：为最大限度降低术后感染风险，应确保手术区域无毛发残留。
6. 使用手术剪在腹中线处剪开长约1 cm的皮肤切口，再用钝头剪小心分离皮肤与下方腹膜壁。
   注意：优先选择腹腔内给药方式，以便容纳泵体尺寸。
7. 用镊子将腹膜壁与下方肠道分离，使用精细手术剪在腹膜壁上剪出一个约0.8 cm的开口。
8. 将渗透压泵以流量调节端先行的方式插入腹膜腔内。
9. 使用5.0可吸收缝线间断缝合腹膜壁上的切口，再用6.0不可吸收缝线间断缝合皮肤切口。
10. 将小鼠置于专用孵育箱中，保持其温暖干燥以促进恢复。在恢复初期每30分钟监测一次小鼠状态，持续两小时，观察其是否恢复正常的呼吸和活动能力。
11. 待小鼠完全从麻醉中恢复后，将其返回常规饲养环境。术后每日观察动物是否出现并发症，持续3天，之后每2至3天观察一次，直至实验结束。
    注意：应持续监测动物是否存在术后疼痛或感染迹象、体重下降、活动减少、异常姿势、缺乏理毛行为，以及对切口区域过度舔舐或啃咬等情况。
12. 皮下注射5 mg/kg卡洛芬，每24小时一次，持续最多48小时，之后根据需要给予。
13. 在饮水中添加0.25 mg/mL阿莫西林，连续使用5天，以预防手术部位感染。
14. 在术后7至10天拆除不可吸收缝线。

4. 麻醉状态下的超声心动图评估

注意：可重复进行超声心动图评估，以监测数周内心脏的连续性重构变化。我们在3周内每周进行一次超声心动图测量。

1. 在诱导室中使用1.25%至1.5%的异氟烷诱导麻醉。待小鼠适当镇静后，用胶带将其固定在超声心动图平台上，并通过鼻罩持续给予麻醉气体。
2. 将异氟烷浓度降低至1%的维持剂量，以尽量减少过度镇静带来的负性变时和变力效应。在整个实验过程中注意监测呼吸频率和心率，并根据需要调整异氟烷剂量。
3. 使用脱毛膏去除胸部毛发，并擦拭清除残留毛发。
4. 在胸部涂抹超声耦合剂，并放置超声探头以获取心脏图像。
5. 在B模式下，采用胸骨旁长轴切面成像左心室（LV）。调整超声心动图平台，使主动脉瓣与左心室心尖位于超声束的成像平面内。
6. 倾斜超声心动图平台，使左心室长轴与超声束垂直，并将左心室最大直径置于图像中心。
7. 将超声探头旋转90度，获取左心室短轴切面图像。
8. 在M模式下测量左心室壁厚度和内部径线。
9. 将小鼠放回笼中，监测其自主呼吸恢复及自发身体活动情况。

结果

在我们先前发表的研究中，通过渗透泵在21天内向105个杂交小鼠多样性面板（HMDP）品系施用了30 mg/kg/d的异丙肾上腺素（ISO）剂量^2,13。我们通过超声心动图评估了结果，分别在ISO处理前（基线）、第1周、第2周和第3周进行检测（图1）。与之前一项研究异丙肾上腺素在23个小鼠品系中影响的研究类似¹⁴，我们观察到不同品系间超声心动图参数存在显著差异。基于超声心动图参数的每周变化总结以及预期建模时间如（图2 和 图3）所示^2,15。尽管在不同小鼠品系之间存在变异，但总体而言，舒张末期室间隔厚度（IVSd）和缩短分数（FS）在第一周增加，但在后续时间点下降；左心室舒张末期内径...

讨论

我们已将该方法应用于100多个近交系小鼠品系，以评估慢性β-肾上腺素能刺激所致的心脏表型^2,13。已知不同小鼠品系对异丙肾上腺素的易感性存在显著差异，可根据需要针对特定品系进行优化¹⁶。这种差异可能源于小鼠品系间β-肾上腺素能受体功能的不同¹⁷、自主神经系统活性的品系依赖性差异¹⁶、β-肾上腺素能受体（beta-AR）密度和/或偶联效率的差异¹⁷，以及其他遗传差异。根据体内连续超声心动图检测，以及有无ISO处理下的离体心脏组织病理学和基因表达分析，慢性异丙肾上腺素处理诱导了从细胞过程、细胞外基质到炎症反应等多个层面的显著变化^2,13。以下因素可能与该心力衰竭模型的应用相关。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带流量调节器的微型渗透泵系统	Alzet	Model 1004	包含填充管、流量调节器和泵体
(-)-异丙肾上腺素盐酸盐	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-异丙肾上腺素盐酸盐为粉末状，需在 -20°C 下保存
1 ml 无菌注射器	VWR	BD309602
30 W LED 光纤O形圈显微镜照明器	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 涂层VICRYL（聚乳酸-乙醇酸共聚物910）缝线	Ethicon	J303H	5-0，可吸收
精细剪刀 - 锐利型	FST	14060-09
玻璃珠	FST	18000-46
热珠灭菌器	FST	18000-50
虹膜镊	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0，18" 黑色尼龙单丝缝线	LOOK	AA-2176	6-0，不可吸收
持针器	WPI	15926
生理盐水，0.9% NaCl	Fisher	89167-772