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方法文章

裸鼠肾包膜下移植经2'-脱氧鸟苷处理的小鼠胚胎胸腺

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DOI：

10.3791/59657

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2019年7月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital, Jinan University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Science, Jinan University, 3The Institute of Clinical Medicine, Jinan University, 4Joint institute of Metabolic Medicine Between Jinan University and University of Hong Kong

本文内容

摘要

我们提供一种简单高效的方法，将经2’-脱氧鸟苷处理的E18.5天胸腺移植至裸鼠的肾包膜下。该方法有助于研究胸腺上皮细胞的功能以及T细胞的成熟过程。

摘要

胸腺是一种重要的中枢免疫器官，在T细胞的发育与分化过程中发挥着关键作用。胸腺移植是研究胸腺上皮细胞功能以及T细胞在体内成熟过程的重要方法。本文将介绍我们实验室所采用的实验方法：将经2'-脱氧鸟苷（用于耗竭供体淋巴细胞）处理的胚胎胸腺移植至无胸腺裸鼠的肾包膜下。该方法操作简便、效率高，无需特殊技能或设备。采用此简单方法获得的结果表明，移植的胸腺能够有效支持受体小鼠T细胞的生成。此外，本文还将进一步阐明该实验方案中的若干关键步骤。

引言

胸腺是中枢免疫器官，在胸腺中，胸腺细胞经历阳性选择和阴性选择，最终发育为成熟的T细胞1,2。异常的阳性选择或阴性选择分别会导致免疫缺陷或自身免疫性疾病3,4。因此，胸腺器官移植是研究供体胸腺中T细胞选择过程的重要方法。当分析由基因突变介导的胸腺上皮细胞功能时，该方法尤为重要，因为这些基因突变会导致胚胎致死表型5。

为了研究受体T细胞在移植胸腺中的成熟过程，必须清除胸腺内供体来源的淋巴细胞。为此，通常选择胚胎第14、15或16天（E14、E15、E16）的胸腺6,7。更成熟阶段的胸腺也可通过2'-脱氧鸟苷处理有效清除供体淋巴细胞。然而，此前尚未有文献详细描述清除淋巴细胞及使用较晚阶段胸腺进行培养的具体实验方案8,9。尽管已有多个研究报道了胸腺移植的操作流程10,11，但仍需对这些方案进行进一步优化和改进。

我们的实验方案分为两个部分：（i）通过在含有2'-脱氧鸟苷的培养基中培养，从发育晚期（E18.5）胸腺中耗竭T淋巴细胞；（ii）将培养后的胸腺移植至受体。在本实验流程中，我们建立了一种简便的方法，可将较大组织（E18.5胸腺）植入肾包膜下，同时降低肾脏损伤的风险。尽管本方案聚焦于发育晚期的胸腺，但也可直接或经适当修改后用于不同发育阶段胸腺或其他类似大小组织的移植。

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方案

本方案遵循暨南大学动物护理伦理委员会的指导原则。

注意：所用材料列于材料表中。

1. 分离胚胎胸腺

  1. 实验前对所有手术器械进行高压灭菌，并用70%乙醇对实验台/超净台进行消毒。
  2. 使用二氧化碳对妊娠雌性小鼠（成功交配后18.5天）进行麻醉并实施安乐死，然后用70%乙醇擦拭腹部区域。
    注意：本实验中采用 Insm1+/lacZ 雌鼠与 Insm1+/lacZ 雄鼠进行交配。 在从子宫中分离胚胎前，对每只胚胎实施经胎盘注射戊巴比妥，并在分离后进行断头处理。
  3. 使用剪刀从膀胱处开始，沿子宫双角方向，在腹部剪出一个"V"形切口。
  4. 用剪刀剪断子宫系膜以及宫颈/阴道，取出子宫并置于盛有冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，冰上保存。接着，从一侧子宫角到另一侧剪开子宫前壁，暴露包裹在蜕膜中的胚胎。用精细镊子剥离蜕膜组织，剪断脐带以释放胚胎。将所有胚胎置于新的冰上培养皿中，直至开始胸腺分离。
  5. 用70%酒精擦拭一只胚胎，并将其放置于新的培养皿中。从此步骤起，确保维持无菌操作条件。
  6. 用剪刀紧贴下颌处剪下胚胎头部，并用纸巾吸除血液。随后，将胚胎仰卧固定在同一培养皿中。
    注意：我们剪取每只胚胎尾部的一小段组织，用于 Insm1 和 lacZ 基因型鉴定。
  7. 用剪刀沿腋前线水平剪开胸部侧壁，然后剪开膈肌以打开胸腔。此时胸腺应可见为位于气管前方、紧邻心脏的两个白色叶状结构。
  8. 将弯头镊置于胸腺后方，轻轻将胸腺剥离取出。务必检查胸腺完整性，确认其包含两个相连的叶。
  9. 用1×PBS清洗胸腺，并在体视显微镜下修剪去除结缔组织和血管。

2. 分离胚胎胸腺的培养

  1. 向24孔板的每个孔中加入500 µL培养基（RPMI1640 + 15%胎牛血清（FBS）+ 100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。将清洗干净的胸腺组织转移至孔中，每孔放置一个胸腺。图1展示了在培养基中分离的胸腺组织。
  2. 向含有胸腺组织的每个孔中加入2'-脱氧鸟苷，使其终浓度为1.25 mM。
  3. 将分离的胸腺组织培养八天，每两天更换一次培养基和2'-脱氧鸟苷。

3. 在肾包膜中建立包膜下腔隙

  1. 准备针头和剪切后的输液管（图2）：使用剪刀在头皮静脉针的管部以45°角进行斜切。
  2. 称量裸鼠体重，随后通过戊巴比妥钠（1.5%）注射液按75 µg/g体重剂量进行麻醉。
  3. 当捏足趾无反射时，将小鼠置于手术台上，采取右侧卧位。
  4. 使用0.5%聚维酮碘棉签，从内向外对术区皮肤进行两次消毒。
  5. 使用剪刀在左侧肾区（最后一根肋骨与髂嵴之间）沿脊柱方向做一5–9 mm的皮肤切口。接着剪开皮下组织和肌肉，打开腹腔，暴露肾脏。
  6. 暴露肾脏后，一手用镊子将肌肉和脂肪组织从脊柱侧切口边缘提起，另一手轻轻挤压肾脏使其外露（也可用双手手指共同挤压使肾脏外露）。
  7. 为确保手术过程中肾包膜保持湿润，用生理盐水（0.9% NaCl）润湿肾脏表面。
  8. 在肾包膜上制造一个小切口，使用步骤3.1中准备好的针尖在肾脏右下侧轻轻划破肾包膜。切口长度应为肾脏宽度的1/2–2/3；注意不要划伤肾脏实质。
  9. 将步骤3.1中准备好的输液管沿肾包膜切口插入，沿肾脏长轴方向轻柔地分离肾包膜与肾脏，直至深入肾包膜内3–4 mm。回撤输液管，即形成肾包膜下腔隙。

4. 移植小鼠胚胎胸腺

  1. 用生理盐水将步骤 2.3 中培养的胸腺清洗两次，以去除培养基。
  2. 将步骤 3.1 中准备好的带夹输液管在其与注射器连接处连接至注射器。缓慢将准备好的胸腺吸入输液管中。
  3. 将带夹输液管轻轻插入肾包膜并到达肾上极。将胸腺送入肾包膜下；在缓慢撤出输液管的同时，轻柔推动注射器活塞。
  4. 使用酒精灯轻微加热步骤 3.1 中准备的针头。确认整个胸腺已进入包膜下间隙后，用加热的针头烧灼切口以封闭。
  5. 烧灼后，将肾脏复位至腹腔内。缝合腹膜和肌肉层。
  6. 采用改良的间断垂直褥式缝合法关闭皮肤切口（至少打三个结，并剪除多余缝线）。
  7. 使用聚维碘酮棉签对切口进行消毒。为缓解疼痛，术中进行氟尼辛（2 µg/g 体重）皮下注射，并在术后连续给药 3 天。
  8. 在小鼠完全从麻醉中恢复之前，将其置于红外灯下保持温暖。
  9. 将胸腺在受体小鼠肾包膜内保留 8 周后，取出移植的胸腺，并按照先前所述方法进行表型分析5,8,9。

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结果

此处展示了包含两个完整叶的 E18.5 胸腺（图 1）。此外，展示了用于剪裁形成输注管斜面的头皮静脉针（图 2）。接下来，还展示了移植至肾包膜内胸腺位置的代表性图像（图 3A），以及受体小鼠体内生长 8 周后的胸腺图像（图 3B）。为了确定 T 细胞是否在移植胸腺的裸鼠中产生，我们通过 CD4 和 CD8 抗体染色及流式细胞术分析，检测了移植胸腺和外周血中的细胞群。外周血从前文所述的眶后窦采集12。我们发现，在移植胸腺的裸鼠中，T 细胞在移植胸腺和外周血中均有生成。然而，在未移植的裸鼠外周血中未检测到 T 细胞（图 4）。为了确定 T 细胞的来源，我们采用本实验室常规使用的基因分型方法并参照前文所述方法13,

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讨论

胚胎胸腺肾包膜下移植是研究胸腺上皮细胞功能及T细胞在体内成熟过程的重要方法。尽管已有若干关于胚胎胸腺器官培养与移植的实验研究6,7，本方案为较晚期胸腺组织的小鼠胚胎胸腺培养及肾包膜下移植提供了一种简便的替代操作流程。

本方案通过引入多项不同改进，优化了既往的实验流程6,7,10,11。首先，我们采用E18.5胚胎期的胸腺进行移植，而非以往常用的E14-E16期胸腺。其优势在于，此发育后期阶段的胸腺已具备相对成熟的胸腺结构和上皮细胞群体。尽管新生或成年小鼠也可作为成熟胸腺的替代来源，但当基因操作（如Jmjd6或Insm1基因突变）导致围产期致死表型时

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了暨南大学为S.J.提供的启动经费以及中国广州市科技计划项目（资助号：201704020209，授予S.J.）的支持。我们感谢Amy Botta（加拿大安大略省多伦多市约克大学生物系，邮编M3J 1P3）对稿件的校对和编辑工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 聚维酮碘上海利康消毒高科技有限公司20171113
0.9% 氯化钠注射液山东齐鲁制药有限公司2C17112101
1 mL 无菌注射器SolarbioYA1090
2’-脱氧鸟苷MECHY-17563溶于DMSO中配制成1M溶液，使用时按1:800稀释（终浓度1.25 mM）
24孔细胞培养板Corning IncorporatedCostar 3524
4-0 外科缝合针带线中国宁波成功显微外科器械厂YY0166-2002
60 mm 细胞培养皿Corning Incorporated430166
70% 乙醇LIRCON20181221
APC抗小鼠CD8a抗体Biolegend1007111:100
弯头精细镊子，JZ 10 cm上海医疗器械（集团）有限公司JD1060使用前需灭菌
注射用头孢美唑钠四川禾信制药有限公司17062111 0796 mg溶于0.5 ml 0.9% NaCl溶液中，按7.5 μl/g体重给药
解剖剪刀，JZ 10 cm上海医疗器械（集团）有限公司JC2303使用前需灭菌
胎牛血清（FBS）GIBCO10270-106
精细镊子，JZ 10 cm上海医疗器械（集团）有限公司JD1050使用前需灭菌
流式细胞仪BDFACSCanto II
氟尼辛葡甲胺MACLINF8101471 mg溶于1 ml 0.9% NaCl溶液中，按2 μl/g体重给药
镊子，Dumont #5World Precision Instruments14098使用前需灭菌
红外灯OTLANMT-810
持针器，JZ 14 cm上海医疗器械（集团）有限公司J32010使用前需灭菌
PE抗小鼠CD4抗体Biolegend1005111:100
青霉素-链霉素混合液GIBCO151401221:100
戊巴比妥钠盐SigmaP3761用PBS配制成1.5%溶液，按75 μg/g体重给药
RPMI1640培养基GIBCOC14-11875-093
头皮静脉针上海 kindly 医疗器械有限公司XC001
弹簧剪刀VANNASS11014-12使用前需灭菌
体视显微镜OLYMPUSSZ61
无菌15 cm 棉签广州浩正20150014
无菌纱布 5 cm × 7 cm-8P广州浩正20172640868
无菌PBS (1×)GENOMGNM20012
组织镊，JZ 12.5 cm上海医疗器械（集团）有限公司J41010使用前需灭菌

参考文献

  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
  2. Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
  3. Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
  4. Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
  5. Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
  6. Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
  7. T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
  8. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  9. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  10. Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709(2015).
  11. Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).
  12. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  13. Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
  14. Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).

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