我们提供一种简单高效的方法，将经2’-脱氧鸟苷处理的E18.5天胸腺移植至裸鼠的肾包膜下。该方法有助于研究胸腺上皮细胞的功能以及T细胞的成熟过程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
胸腺是一种重要的中枢免疫器官，在T细胞的发育与分化过程中发挥着关键作用。胸腺移植是研究胸腺上皮细胞功能以及T细胞在体内成熟过程的重要方法。本文将介绍我们实验室所采用的实验方法：将经2'-脱氧鸟苷（用于耗竭供体淋巴细胞）处理的胚胎胸腺移植至无胸腺裸鼠的肾包膜下。该方法操作简便、效率高，无需特殊技能或设备。采用此简单方法获得的结果表明，移植的胸腺能够有效支持受体小鼠T细胞的生成。此外，本文还将进一步阐明该实验方案中的若干关键步骤。
引言
胸腺是中枢免疫器官，在胸腺中，胸腺细胞经历阳性选择和阴性选择，最终发育为成熟的T细胞1,2。异常的阳性选择或阴性选择分别会导致免疫缺陷或自身免疫性疾病3,4。因此，胸腺器官移植是研究供体胸腺中T细胞选择过程的重要方法。当分析由基因突变介导的胸腺上皮细胞功能时，该方法尤为重要，因为这些基因突变会导致胚胎致死表型5。
为了研究受体T细胞在移植胸腺中的成熟过程，必须清除胸腺内供体来源的淋巴细胞。为此，通常选择胚胎第14、15或16天（E14、E15、E16）的胸腺6,7。更成熟阶段的胸腺也可通过2'-脱氧鸟苷处理有效清除供体淋巴细胞。然而，此前尚未有文献详细描述清除淋巴细胞及使用较晚阶段胸腺进行培养的具体实验方案8,9。尽管已有多个研究报道了胸腺移植的操作流程10,1....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案遵循暨南大学动物护理伦理委员会的指导原则。
注意：所用材料列于材料表中。
1. 分离胚胎胸腺
- 实验前对所有手术器械进行高压灭菌，并用70%乙醇对实验台/超净台进行消毒。
- 使用二氧化碳对妊娠雌性小鼠（成功交配后18.5天）进行麻醉并实施安乐死，然后用70%乙醇擦拭腹部区域。
注意：本实验中采用 Insm1+/lacZ 雌鼠与 Insm1+/lacZ 雄鼠进行交配。 在从子宫中分离胚胎前，对每只胚胎实施经胎盘注射戊巴比妥，并在分离后进行断头处理。 - 使用剪刀从膀胱处开始，沿子宫双角方向，在腹部剪出一个"V"形切口。
- 用剪刀剪断子宫系膜以及宫颈/阴道，取出子宫并置于盛有冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，冰上保存。接着，从一侧子宫角到另一侧剪开子宫前壁，暴露包裹在蜕膜中的胚胎。用精细镊子剥离蜕膜组织，剪断脐带以释放胚胎。将所有胚胎置于新的冰上培养皿中，直至开始胸腺分离。
- 用70%酒精擦拭一只胚胎，并将其放置于新的培养皿中。从此步骤起，确保维持无菌操作条件。
- 用剪刀紧贴下颌处剪下胚胎头部，并用纸巾吸除血液。随后，将胚....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
此处展示了包含两个完整叶的 E18.5 胸腺（图 1）。此外，展示了用于剪裁形成输注管斜面的头皮静脉针（图 2）。接下来，还展示了移植至肾包膜内胸腺位置的代表性图像（图 3A），以及受体小鼠体内生长 8 周后的胸腺图像（图 3B）。为了确定 T 细胞是否在移植胸腺的裸鼠中产生，我们通过 CD4 和 CD8 抗体染色及流式细胞术分析，检测了移植胸腺和外周血中的细胞群。外周血从前文所述的眶后窦采集12。我们发现，在移植胸腺的裸鼠中，T 细胞在移植胸腺和外周血中均有生成。然而，在未移植的裸鼠外周血中未检测到 T 细胞（图 4）。为了确定 T 细胞的来源，我们采用本实验室常规使用的基因分型方法并参照前文所述方法13,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
胚胎胸腺肾包膜下移植是研究胸腺上皮细胞功能及T细胞在体内成熟过程的重要方法。尽管已有若干关于胚胎胸腺器官培养与移植的实验研究6,7，本方案为较晚期胸腺组织的小鼠胚胎胸腺培养及肾包膜下移植提供了一种简便的替代操作流程。
本方案通过引入多项不同改进，优化了既往的实验流程6,7,10,11。首先，我们采用E18.5胚胎期的胸腺进行移植，而非以往常用的E14-E16期胸腺。其优势在于，此发育后期阶段的胸腺已具备相对成熟的胸腺结构和上皮细胞群体。尽管新生或成年小鼠也可作为成熟胸腺的替代来源，但当基因操作（如Jmjd6或Insm1基因突变）导致围产期致死表型时
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了暨南大学为S.J.提供的启动经费以及中国广州市科技计划项目（资助号：201704020209，授予S.J.）的支持。我们感谢Amy Botta（加拿大安大略省多伦多市约克大学生物系，邮编M3J 1P3）对稿件的校对和编辑工作。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 聚维酮碘 | 上海利康消毒高科技有限公司 | 20171113 | |
| 0.9% 氯化钠注射液 | 山东齐鲁制药有限公司 | 2C17112101 | |
| 1 mL 无菌注射器 | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-脱氧鸟苷 | MEC | HY-17563 | 溶于DMSO中配制成1M溶液，使用时按1:800稀释（终浓度1.25 mM） |
| 24孔细胞培养板 | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 外科缝合针带线 | 中国宁波成功显微外科器械厂 | YY0166-2002 | |
| 60 mm 细胞培养皿 | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% 乙醇 | LIRCON | 20181221 | |
| APC抗小鼠CD8a抗体 | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| 弯头精细镊子，JZ 10 cm | 上海医疗器械（集团）有限公司 | JD1060 | 使用前需灭菌 |
| 注射用头孢美唑钠 | 四川禾信制药有限公司 | 17062111 079 | 6 mg溶于0.5 ml 0.9% NaCl溶液中，按7.5 μl/g体重给药 |
| 解剖剪刀，JZ 10 cm | 上海医疗器械（集团）有限公司 | JC2303 | 使用前需灭菌 |
| 胎牛血清（FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| 精细镊子，JZ 10 cm | 上海医疗器械（集团）有限公司 | JD1050 | 使用前需灭菌 |
| 流式细胞仪 | BD | FACSCanto II | |
| 氟尼辛葡甲胺 | MACLIN | F810147 | 1 mg溶于1 ml 0.9% NaCl溶液中，按2 μl/g体重给药 |
| 镊子，Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | 使用前需灭菌 |
| 红外灯 | OTLAN | MT-810 | |
| 持针器，JZ 14 cm | 上海医疗器械（集团）有限公司 | J32010 | 使用前需灭菌 |
| PE抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| 青霉素-链霉素混合液 | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| 戊巴比妥钠盐 | Sigma | P3761 | 用PBS配制成1.5%溶液，按75 μg/g体重给药 |
| RPMI1640培养基 | GIBCO | C14-11875-093 | |
| 头皮静脉针 | 上海 kindly 医疗器械有限公司 | XC001 | |
| 弹簧剪刀 | VANNAS | S11014-12 | 使用前需灭菌 |
| 体视显微镜 | OLYMPUS | SZ61 | |
| 无菌15 cm 棉签 | 广州浩正 | 20150014 | |
| 无菌纱布 5 cm × 7 cm-8P | 广州浩正 | 20172640868 | |
| 无菌PBS (1×) | GENOM | GNM20012 | |
| 组织镊，JZ 12.5 cm | 上海医疗器械（集团）有限公司 | J41010 | 使用前需灭菌 |
参考文献
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
