使用mRNA电穿孔快速有效地表达Avian胚胎中的多种蛋白质

Summary

我们报告信使RNA(mRNA)电穿孔作为一种方法,允许快速有效地表达多个蛋白质在龟胚胎模型系统。该方法可用于荧光标记细胞,并在电穿孔后不久通过延时显微镜记录细胞体内运动。

Abstract

我们报告说,mRNA电穿孔允许荧光蛋白比DNA电穿孔更快地和广泛地标记活的鹅胚胎中的细胞。高转染效率允许至少4个不同的mRNA以±87%的效率进行共转染。大多数电穿孔的mRNA在电穿孔后的前2小时降解,允许在发育中的胚胎中进行时间敏感的实验。最后,我们描述了如何动态成像活胚胎电镀与mRNA编码各种亚细胞靶向荧光蛋白。

Introduction

电穿孔是一种物理转染方法,它使用电脉冲在等离子膜中产生瞬态孔隙,使核酸或化学物质等物质进入细胞醇。电穿孔被广泛用于将DNA输送到细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞1、2、3。它通常用于将遗传有效载荷引入发育中的鸟类胚胎中的目标细胞和组织,以研究发育的遗传控制或标记细胞^迁移种群4、5、6 ⁷.然而,DNA电^穿孔8也存在一些实验限制。例如,DNA电穿孔通常引入每个细胞表达载体数量高度可变,随后引入其编码的 mRNA 和蛋白质。这种变异性会导致相当大的细胞异质性,使图像分析和数据解释复杂化9,10。此外,来自DNA电穿孔的蛋白质在电穿孔后才开始表达±3小时,直到12小时才达到细胞数量和荧光强度的最高效率,这可能是因为需要时间转移到细胞核并完成转录和翻译在体内11。

Protocol

所有动物程序均按照洛杉矶儿童医院和南加州大学机构动物护理和使用委员会批准的准则进行。

1. 生成基于 pCS2 的表达式矢量

1. 要克隆 pCS2.Lifeact-eGFP,请通过消化 2 μg 的 pCS2.CycB1-GFP(包含不同插入的构造)在适当的消化缓冲液中(参见材料表)在适当的消化缓冲液中(参见材料表)稀释到总反应中的 1 倍来制备载体主干在37°C下体积为50μL1小时(参见图1,了解克隆过程原理图)。
   1. 通过加入虾碱性磷酸酶(1 U),从限制性酶反应中脱光载体骨干质的游离3'OH端。在37°C下孵育30分钟。
   2. 在 1% 甘蔗凝胶/1x Tris 醋酸 EDTA (TAE) 缓冲液中运行整个混合物,在 90 V 下进行 ±50 分钟,然后在 1x TAE 缓冲液中将凝胶染色至 0.5 μg/mL 溶液中,在 1x TAE 缓冲液中轻轻摇动 15 分钟。此外,请确保在自由通道中加载分子量标记,以帮助确定 DNA 大小。
   3. 使用 DNA 安全紫外线转导剂避免刻痕 DNA,快速从腺胶凝胶中切出载体主干(预期带大小为 4kb),并使用制造商的说明使用凝胶纯化试剂盒从凝胶片中分离 DNA 片段。
2. 与步骤1.1同时,在适当的消化缓冲液中,在总反应体积为50μ....

Results

mRNA 电穿孔比 DNA 电穿孔更有效

我们使用 pCS2+。H2B-黄体素制备体外转录mRNA。由于DNA电穿孔通常在1-2μg/μL下进行,我们使用mRNA的等位浓度(计算为H2B-Citrine的约0.25-0.5微克/μL)进行mRNA电穿孔。我们首先测试了pCS2+的电穿孔效率。H2B-黄水晶DNA与H2B-黄水晶mRNA(从pCS2+的SP6启动子体转录的体外转录)。H2B-黄酸酯)通过将DNA或mRNA分别电穿孔到HH5青鱼胚胎中,然后在电穿孔后12小时检查电穿孔效率。虽然DNA电穿孔导致一些电穿孔细胞的荧光更亮,但与广泛表达的mRNA编码FPs相比,DNA电穿孔的效率明显较低(图2A和B)。

考虑到电穿孔协议中固有的胚胎到胚胎变异性,将编码H2B-.......

Discussion

在此协议中,我们提供了关于如何精确微注射和电镀mRNA到胃化鹅胚胎细胞的逐步说明。我们证明,体外合成的mRNA电穿孔允许快速有效地表达荧光蛋白(FPs)在胃化鹅胚胎(图2和3)。 从电镀mRNA翻译的H2B-黄水晶蛋白的荧光可以在+20分钟内通过共聚焦显微镜检测,并在FP荧光中增加数小时(图3,补充电影1)。这是令人惊讶的快速和接近假定的黄水晶成熟时间32,33。从DNA载体表达的FPs在2-3小时后被检测到(图3,补充。电影1),这是类似于以前的报告8,34,35。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI-HF	新英格兰生物实验室	R3136L
BglII	新英格兰生物实验室	R0144S
BsrG1-HF	新英格兰生物实验室	R3575S
NotI-HF	新英格兰生物实验室	R3189L
SalI-HF	新英格兰生物实验室	R3138L
苯酚：氯仿：异戊醇	Thermo Fisher
SP6 mMessage 机体外转录试剂盒	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-（1,1,3,3-四甲基丁基）苯基 - 聚乙二醇，t< / em>-辛基苯氧基乙醇，聚乙二醇tert-辛基苯醚
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2-（4-氨基苯基）-6-吲哚卡巴脒二盐酸盐，4′，6-二脒基-2-苯吲哚二盐酸盐，DAPI二盐酸盐
Whatman No.1 滤纸	Sigma Aldrich	WHA1001125
甘油	Sigma Aldrich	G9012
尿素	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi 是 Dorus Gadella 的礼物（Addgene 质粒 # 36205;http://n2t.net/addgene:36205 ;RRID：Addgene_36205）
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Methods 2008;5：605-7.PubMed ID：18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		这篇论文
pCS.H2B-黄水晶	Addgene	53752	pCS-H2B-黄水晶是 Sean Megason（Addgene 质粒 # 53752;http://n2t.net/addgene:53752 ;RRID：Addgene_53752）
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry 是 Sean Megason （Addgene 质粒 # 53750 http://n2t.net/addgene:53750;RRID：Addgene_53750）
蔡司 LSM-780 倒置显微镜	Carl Zeiss Microscopy GmbHLSM-780		是一款共聚焦和多光子显微镜，可提供重要成像工作所需的灵敏度。780 配备电动载物台、自动对焦装置和全载物台顶部遮光培养箱，是一款适用于高端活细胞/胚胎成像的出色显微镜。高灵敏度 32 通道 Quasar 探测器可实现光谱成像、线性解混和高色数 （>4） 图像采集。可以使用 6 线单光子激光器（405、458、488、514、564 和 633 nm）、变色龙（相干）2 光子激光器（范围从 690nm 到 1000nm）进行激发，并使用 ZEN 2011 SP7（黑色）系统软件运行。
CUY-21 EDIT 体内电穿孔仪	Bex Co.， Ltd.
铂扁平方形电极，边长 5	mmBex Co.， Ltd.
奥林巴斯MVX10 FL体视显微镜	奥林巴斯生命科学
XM10单色相机	奥林巴斯生命科学
<强>磷酸盐缓冲盐水（PBS）用于HCR（10次，pH 7.4）			要制备1 L 10&次储备溶液，请混合80 g NaCl （Sigma-Aldrich S3014），2 g KCl （Sigma-Aldrich P9541），11.4 g Na2HPO4 （无水;Sigma-Aldrich S3264） 和 2.7 g KH2PO4 （无水;Sigma-Aldrich P9791）。用 HCl 将 pH 值调节至 7.4，并用超纯 H 2 O 将最终体积降至 1 L。避免在 PBS 中使用 CaCl2 和 MgCl2 进行 HCR。重要的是，用于 HCR 的 PBS 应制备为不含 RNase 的溶液（例如，通过焦碳酸二乙酯 [DEPC] 处理）。
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO< sub>4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			加入 1 mL Triton X-100 （Sigma Aldrich 93443） 和 100 mL 10&次;PBS 加入 890 mL 超纯蒸馏 H2O。通过 0.2 μ 过滤溶液;m 过滤器并将其存储在 4 ？C 直到使用。
1&次磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（DEPC 处理;pH 7.4）
0.1% Triton X-100