Method Article

使用mRNA电穿孔快速有效地表达Avian胚胎中的多种蛋白质

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们报告信使RNA(mRNA)电穿孔作为一种方法,允许快速有效地表达多个蛋白质在龟胚胎模型系统。该方法可用于荧光标记细胞,并在电穿孔后不久通过延时显微镜记录细胞体内运动。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们报告说,mRNA电穿孔允许荧光蛋白比DNA电穿孔更快地和广泛地标记活的鹅胚胎中的细胞。高转染效率允许至少4个不同的mRNA以±87%的效率进行共转染。大多数电穿孔的mRNA在电穿孔后的前2小时降解,允许在发育中的胚胎中进行时间敏感的实验。最后,我们描述了如何动态成像活胚胎电镀与mRNA编码各种亚细胞靶向荧光蛋白。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

电穿孔是一种物理转染方法,它使用电脉冲在等离子膜中产生瞬态孔隙,使核酸或化学物质等物质进入细胞醇。电穿孔被广泛用于将DNA输送到细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞1、2、3。它通常用于将遗传有效载荷引入发育中的鸟类胚胎中的目标细胞和组织,以研究发育的遗传控制或标记细胞迁移种群4、5、6 7.然而,DNA电穿孔8也存在一些实验限制。例如,DNA电穿孔通常引入每个细胞表达载体数量高度可变,随后引入其编码的 mRNA 和蛋白质。这种变异性会导致相当大的细胞异质性,使图像分析和数据解释复杂化9,10。此外,来自DNA电穿孔的蛋白质在电穿孔后才开始表达±3小时,直到12小时才达到细胞数量和荧光强度的最高效率,这可能是因为需要时间转移到细胞核并完成转录和翻译在体内11。

相比之下,mRNA转染已有效地用于各种模型系统,包括通过微注射12、13、通过mRNA脂肪可敏转染14重新编程人类干细胞,在成年小鼠中电化顽固神经干细胞15。我们利用编码不同荧光蛋白(FPs)的体外合成mRNA,测试了mRNA电穿孔在早期鸟类胚胎发育过程中有效标记细胞的能力。在我们的研究中,我们使用pCS2+载体,一种多用途表达载体,通常用于在异种动物和斑马鱼胚胎中表达蛋白质。pCS2+ 中的 SP6 和 T7 RNA 聚合酶启动子允许在体外转录/翻译系统中使用时从任何克隆基因中合成 mRNA 和蛋白质。

在这里,我们证明了mRNA电穿孔允许快速有效地表达荧光蛋白(FPs)在胃化鹅胚胎。我们设计并生成了许多在这些研究中使用的表达式向量。例如,我们将 LifeAct-eGFP 基因16分克隆到 pCS2+ 载体17中,以从 CMV 启动子和 SP6 启动子表达。插入的基因位于SP6启动子的下游和SV40聚(A)尾18的上游。在与mRNA和DNA共电的胚胎中,从体外转录的mRNA编码的FPs在电穿孔后20分钟内首次被检测到,而DNA表达载体中的FPs仅在3小时后被检测到。膜蛋白可以同时电化到胚胎中,从而在单个细胞中快速有效地表达多种蛋白质。最后,使用光漂白(FRAP)测定后的体内荧光恢复,我们发现大多数电化mRNA在2小时内衰变。因此,快速的初始蛋白质生产与有限的新蛋白质转化相结合,使mRNA电穿孔成为一种有价值的技术,当需要时间控制表达时。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物程序均按照洛杉矶儿童医院和南加州大学机构动物护理和使用委员会批准的准则进行。

1. 生成基于 pCS2 的表达式矢量

  1. 要克隆 pCS2.Lifeact-eGFP,请通过消化 2 μg 的 pCS2.CycB1-GFP(包含不同插入的构造)在适当的消化缓冲液中(参见材料表)在适当的消化缓冲液中(参见材料表)稀释到总反应中的 1 倍来制备载体主干在37°C下体积为50μL1小时(参见图1,了解克隆过程原理图)。
    1. 通过加入虾碱性磷酸酶(1 U),从限制性酶反应中脱光载体骨干质的游离3'OH端。在37°C下孵育30分钟。
    2. 在 1% 甘蔗凝胶/1x Tris 醋酸 EDTA (TAE) 缓冲液中运行整个混合物,在 90 V 下进行 ±50 分钟,然后在 1x TAE 缓冲液中将凝胶染色至 0.5 μg/mL 溶液中,在 1x TAE 缓冲液中轻轻摇动 15 分钟。此外,请确保在自由通道中加载分子量标记,以帮助确定 DNA 大小。
    3. 使用 DNA 安全紫外线转导剂避免刻痕 DNA,快速从腺胶凝胶中切出载体主干(预期带大小为 4kb),并使用制造商的说明使用凝胶纯化试剂盒从凝胶片中分离 DNA 片段。
  2. 与步骤1.1同时,在适当的消化缓冲液中,在总反应体积为50μL的50μL中,在37°C下,在适当的消化缓冲液中消化2μg的pEGFP-N1-Lifeact,将2μg的pEGFP-N1-Lifeact与BglII(10 U)一起制备。运行整个混合物在1%的甘蔗凝胶中,以分离800 bp带,如步骤1.1.2-1.1.3所述。
  3. 在分光光度计上纯化和定量载体后,在T4DNA冠带缓冲液中结合50纳克的载体和38纳克的插入物(1:3载体与插入的摩尔比),然后加入T4DNA联结酶,催化结扎反应。此外,设置无 DNA 控制、仅矢量控制以及仅插入控件。在室温下孵育所有反应30分钟。
    1. 将结扎混合物的1μL转化为合格的大肠杆菌DH10。 此外,仅转换水负控制和 20 pUC19 正控制。将细菌传播到含有50微克/mL阿霉素的Luria Broth(LB)琼脂板,并在37°C下孵育过夜。
    2. 第二天早上,计算每个盘子上的菌落。
      注:理想情况下,负控制板上不应有菌落,矢量插入连接板上不应有>100个菌落,并且仅向量板上的菌落较少。
    3. 从用载体+插入结扎混合物转化的琼脂板上挑选至少8个细菌菌落,并使用无菌牙签或移液头将其接种到含有50μg/mL阿霉素的2 mL液体LB汤中。
    4. 使用商业质粒小试剂盒从每个克隆中提取DNA。
    5. 使用每个克隆的500 ng DNA在适当的消化缓冲液中使用NotI(10 U)和BamHI(10 U)运行诊断限制消化,在37°C下稀释至1x1小时1小时,并在1x TAE缓冲液中运行1%的角糖凝胶上消化的DNA。pCS2.Lifeact-eGFP 阳性克隆的预期波段大小为 3.9 kb 和 978 bp。
    6. 将1 pg-100 ng的DNA从阳性克隆转化为合格的大肠杆菌DH10,并准备3-4个微预备反应,如前一步所述,以获得足够量的DNA进行体外转录反应(最小10微克)。

2. 通过体外转录制备mRNA

  1. 在适当的消化缓冲液中,用 NotI (10 U) 在 37°C 过夜时,在总反应量为 50 μL 的 50 μL 中,用 NotI (10 U) 在刀片的 3' 端线性化 10 μg 的 PCS2.LifeAct-eGFP。
    注:为了防止RNase污染,减少mRNA降解,在处理mRNA样品时戴手套。
  2. 使用苯酚混合物净化DNA:氯仿:等亚醇(25:24:1,v/v)。
    1. 加入150 μL无RNase水,使消化反应的总体积等于200μL。然后,加入200μL的苯酚:氯仿:等醇和涡旋混合物20s。
    2. 以最大速度(18,400 x g)在微熔中离心2分钟。小心地去除含有线性DNA的顶部水相。重复此步骤以去除其他杂质,并小心不要破坏底部和顶部液相之间可能形成的白色沉淀物。
  3. 通过加入1/10体积3M醋酸钠(无RN酶)和2.5卷100%乙醇沉淀线性DNA。将混合物留在-20°C处,超过30分钟,然后以最大速度(18,400 x g)离心,颗粒DNA。
    1. 用70%乙醇清洗DNA颗粒,然后风干颗粒,超过5分钟。
    2. 将DNA颗粒溶解在5μL的无RNase水中。通过分光光度计量化DNA。
      注:预期DNA浓度为±0.5-1 μg/μL,A260/A280比率介于1.7-2.0之间。
  4. 使用1 μg的线性化pCS2.LifeAct-eGFPDNA进行体外转录(IVT)。按照制造商在商业套件中的说明(参见材料表)包括 10 μL 的盖模拟(最终浓度 0.8 mM)和 NTP(ATP、CTP 和 TTP 的最终浓度为 1 mM;GTP 为 0.2 mM),2 μL 的 10 倍反应缓冲液(最终浓度)SP6 RNA聚合酶的2μL和高达20μL的无RN酶水。
    1. 根据转录笔大小,孵育 IVT 混合物约 2 小时或更长时间。
      注:2 h 孵育对3 kb成绩单有效,但隔夜孵育对大于5 kb的转录本效果更好。
    2. 要从转录反应中去除游离核苷酸,加入30μL的LiCl RNA沉淀溶液(7.5M氯化锂,50mM EDTA)以沉淀mRNA。将混合物短暂涡流,在-20°C下储存30分钟,以最大速度(18,400 x g)在微熔中将mRNA旋转15分钟,然后用70%乙醇(无RNase)冲洗。
  5. 将合成的mRNA溶解在15μL的无RN酶水中。在5μL/管(共3管)下分配合成的mRNA,并置于-80°C进行长期储存。用分光光度计定量mRNA。
    注:预期收率为15-20 μg mRNA(±1 μg/μL)。1 μL (1 μg/μL) 足以进行 10 个胚胎的实验,假设 mRNA 从 1 μg/μL 稀释到 500 纳克/μL,并且每个胚胎被注射 ±200 nL。因此,每个管子应包含足够的mRNA进行+5实验。
  6. 使用 RNase 去污溶液(例如,RNase Away)清洁所有凝胶设备后,在 1x TAE 缓冲液中的 1% agarose 凝胶上运行 ±300 ng mRNA,并确保 mRNA 显示为一个波段(如果形成二级结构,则可能存在多个带),并且不会涂抹凝胶通道中的ppears,表明RNA降解。

3. mRNA电穿孔混合物的制备

  1. 以所需浓度解冻和稀释 mRNA(无RNase水中的250-500纳克/μL适用于本工作测试的所有 mRNA)。添加 1/10 体积的彩色染料(参见材料表,无RNAe,0.1%最终浓度),以帮助可视化 mRNA 注射部位并正确放置电极。
    注:    如果DNA和RNA结合进行共电穿孔,则使用苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀在mRNA和DNA混合物之前,确保DNA不会污染RNases。
    1. 请务必使用模拟(无添加RNA)电穿孔溶液准备负控制。如果可能,使用预先验证的 mRNA(在以前的实验中证明能成功产生 FP 的 mRNA)制备阳性对照。
      注:负控制对于所有成像实验建立背景荧光水平以实现数据规范化至关重要。当使用新转录的mRNA时,正控制尤其重要,因为帮助确认电穿孔设置是否有效。
  2. 将 mRNA 电穿孔溶液储存在冰浆上,以防止降解,直到准备好进行电穿孔。

4. 电波mRNA进入活的奎尔胚胎

  1. 每天收集新鲜产的受精卵,在13°C的加湿冰箱中储存不超过1周。在38°C下孵育卵,直到所需的胚胎发育阶段19,20,21。
    注:HH3至HH5用于静态和动态成像。对于HH3胚胎,在收获前将卵子留在室温下2小时,使得分离过程更容易,因为当冷却时,胚胎通常更耐物理操作。
  2. 根据EC培养系统22分离和制备胚胎。每个条件至少收集5个胚胎,包括至少一个作为阴性对照(不电镀)。
    1. 轻轻打破,将鸡蛋倒入10厘米的培养皿中。用转移移液器去除大部分厚白蛋白,并用纸巾轻轻擦拭蛋黄表面,取出胚胎周围剩余的厚白蛋白,以确保胚胎紧紧地粘在纸环上。
    2. 将预切滤纸(见材料表)放在胚胎上,用剪刀在胚胎周围平滑切割。
    3. 使用巴斯德移液器用PBS为胚胎提供底,使用柔和的溪流来腾空任何粘在胚胎上的蛋黄。
      注:在使用更年轻 (
    4. 缓慢地将胚胎/纸环以倾斜的角度向上拉,然后从蛋黄上拉出,放入装满 PBS 的培养皿中,以便进一步清洁。一旦大部分蛋黄被移除,将胚胎腹腔侧向上放在一个35毫米的培养皿上,上面覆盖着半固体混合物的琼脂/白蛋白。
  3. 使用玻璃微移液拉器仪器制备 6 至 8 个 10 厘米长的玻璃微毛细血管(O.D. = 1.2 mm)。
  4. 将胚胎腹腔侧向上放在充满PBS的电穿孔室中。使用玻璃微毛细管,将200 nL的mRNA或DNA/mRNA电穿孔混合物注射到覆盖所需区域的表膜和维他林膜之间的腔中。
    注:在本手稿中显示的大多数实验中,整个前部区域和一些用于 opaca 的区域被电化。
  5. 将正极和负极(铂平方形电极;侧长5mm)分别放置在胚胎顶部和底部,并使用以下脉冲序列电波:5个5V的方形电脉冲,50ms持续时间,间隔为100 ms使用体内电孔。确保电极之间的距离为 ±5 mm。
    注:优化电穿孔参数对于避免可能杀死脆弱的胚胎细胞的条件至关重要。电压、脉冲长度、脉冲间隔以及DNA和mRNA脉冲数的参数应考虑用于各种电穿孔装置。
  6. 在38°C下孵育电镀胚胎到所需的发育阶段。
    注:荧光解剖立体镜(见材料表)有助于筛选转染的胚胎与非转染胚胎。
  7. 如果胚胎要静态成像,在PBS中将其固定在4%的甲醛中,在室温下固定1小时,或在4°C下过夜。
    1. 用剪刀平滑地在滤纸周围切开,用锋利的钳子轻轻剥去背表面的闪亮膜,从而从膜膜中取出胚胎。
    2. 在 PBS/Triton 中清洗固定胚胎 (0.1%)2x 5 分钟,如果需要,继续原位杂交或免疫染色。
    3. 最后,在PBS/Triton(0.1%)中将胚胎染色在0.5μg/μL DAPI中在室温下至少30分钟。在PBS/Triton 2中清洗胚胎5分钟,在SCALE-U2溶液23中清除胚胎过夜。
  8. 要分析电穿孔的效率(见图2),使用ImageJ上的二进制和粒子分析工具和DAPI通道从图像中的所有细胞获取核轮廓。
    1. 要在 ImageJ 上使用二进制工具,请在包含大多数单元格的 DAPI 通道中使用单个 z 切片,然后单击"处理 > 二进制 > 使二进制"。要分离附近的单元格,请单击"处理 > 二进制 > 分水岭"。通过单击"分析>分析粒子",大小设置为 100-500 (μm2) 获取细胞轮廓。
    2. 确保大多数单元格在 DAPI 通道中勾勒,并通过单击"更多>在ROI 管理器弹出窗口上保存"来保存单元格轮廓。
    3. 通过打开 mRNA 或 DNA 通道中的单个 z 切片上以前保存的文件,然后单击 ROI 管理器上的"测量",使用这些轮廓获得 mRNA 和 DNA 通道的荧光强度值。
    4. 最后,过滤这些强度值,将具有<6,000荧光强度的细胞计数为非转染细胞,将>6,000荧光强度的细胞作为转染。

5. 由电镀 mRNA 编码的图像 FP

  1. 在荧光解剖立体镜下观察所有电镀胚胎后,选择最健康、最好的电镀胚胎进行动态成像实验。
    1. 继续孵育其他电镀胚胎和非电化胚胎(负控制)在单独的培养箱中,同时成像选定的胚胎,以防该胚胎在实验期间死亡。
  2. 对于动态成像,使用前24、25、26所述的全山前ovo鸟类胚胎培养,使用倒置共聚焦显微镜。
    注:    显微镜配有一个台面培养箱(见材料表),在成像过程中将温度保持在36°C。在显微镜设置期间观察到,在36°C下孵育的胚胎比在较高温度下存活的时间更长,可能是因为激光可能导致胚胎局部加热。读者应确定适合自己显微镜设置的最佳舞台孵化温度。
    1. 要动态成像和可视化胚胎生成,请用 PBS 短暂清洁电穿孔胚胎,通过在 PBS 清洁中使用钳子移动胚胎,去除在电穿孔过程中胚胎背侧可能形成的任何气泡解决 方案。
    2. 将干净的胚胎直接放在含有一层薄白蛋白-agar(±150 μL)的成像皿上,确保胚胎22的背表面不会产生任何气泡。
    3. 为确保长期成像的生存,在成像盘的内边缘添加一张湿润的纸片,并使用石蜡薄膜密封培养皿,以尽量减少成像和孵育过程中的蒸发。
    4. 将此培养皿快速移动到共聚焦显微镜的预加热阶段,并使用明场通道(PMT 激光 20%)定位胚胎中的彩色染料,该通道可识别注射和电镀区域。
  3. 将成像软件设置为所需目标(10 或 20x)、二色镜(GFP nm 为 488 nm,RFP 为 561),发射光谱(GFP 为 499-562 nm,RFP 为 570-695 nm),并打开适当的激光(GFP 为 488 nm,RFP 为 561 nm)。
    注:    电镀mRNA被转化为在20分钟内看到的蛋白质(见图3)。 本文中大多数图像使用的成像元数据是:具有20倍目标的倒置共聚焦显微镜(见材料表);像素停机时间,±1.5 μs;4 行扫描的平均值。
    1. 单击成像软件上的 Live,根据每个显微镜激光功率将激光功率调整到适合荧光强度的设置。首先使用1%的激光功率、800增益对胚胎进行成像,并将激光功率缓慢地增加1%,直到看到饱和像素。
    2. 遵循此操作,稍微降低激光功率,直到不再看到饱和像素。
      注:为胚胎成像过程的开始而选择的激光功率可能适合早期时间点,但如果细胞的荧光随着时间的推移变得明亮或变暗,则在以后的时间点并不理想。为了解决这个问题,最初在稍低的功率设置下对胚胎进行成像,因为电穿孔电池通常在电穿孔后的前 6 小时内变亮(参见图 3A-E,用于量化信号增加)。如果后面的图像已饱和,则继续使用原始成像设置进行成像,但在使用较弱的成像设置(较小的针孔或较弱的激光功率)后立即拍摄其他图像。
    3. 每3-5分钟对胚胎进行图像,以跟踪不同时间点的单个细胞迁移。对于这项工作,图像是Z堆栈(约50μm厚)的整个电镀区域,再加上一些额外的空间朝z堆栈的底部,以防胚胎沉入角玫瑰床在整个成像会话。
    4. 通过检查第一部电影的前几个时间点,观察单元格的移动速度。如果像元以快速的速度移动(意味着它们将在几个时间点内退出图像区域的区域),请考虑扩大图像区域的缩放(1 倍 = 0.8 倍)或对不同区域进行成像。
      注:该地区的胚胎区移动速度比该地区地区快得多。此外,较年轻的胚胎(HH3,HH5)通常含有与较老的胚胎相比,经历更快速运动的细胞(>HH7)。
    5. 对胚胎的电镀区域进行成像后,对同一胚胎的未电镀区域进行成像,以确定自荧光水平(如果使用低激光功率 <10% 来成像胚胎,则应为最小)。

6. 光漂白 (FRAP) 到测定 mRNA 完整性后的荧光恢复

注:光漂白 (FRAP) 测定后体内荧光恢复可用于确定转染的 mRNA 可转换为 FP 的时间。以下协议概述了用于检测 H2B 半寿命的 FRAP 实验。黄水晶mRNA在电镀胚胎中。

  1. 使用 20x 0.8 NA 物镜和完全打开的针孔在倒置共焦显微镜上执行 FRAP 实验。
    1. 在立体显微镜上确认H2B-黄水晶的电穿孔,并在倒式共焦显微镜的预热台上设置胚胎(参见步骤5.2.4)后,不同时间从H2B-Citrine中光漂白大部分细胞荧光点(45分钟,2小时,5小时电穿孔后)使用405nm激光70%激光功率,100次迭代,扫描速度4,仅剩5%的荧光。
      注:此过程需要几分钟时间。
    2. 光漂白后,继续在36°C的舞台上孵育胚胎。
  2. 注意在光漂白区域内积极分割细胞,这表明光漂白细胞在治疗后尚未完全死亡。
  3. 使用共聚焦显微镜,定期(3 或 5 分钟)获取漂白后图像(电镀区域的 z 堆栈),时间间隔长达 30 分钟。
    注:如果可用,使用转基因 H2B-XFP 线作为正对照,以确保光漂白区域的细胞存活。电镀mRNA编码的FP的荧光回收率应降低,但在整个电影中,通过转基因编码的FP应保持一致。
  4. 确保成像条件不会有害地影响胚胎存活,同时孵育未光漂白的电化胚胎,可作为成像的控制。
  5. 要量化 mRNA 衰变后电穿孔的光漂白结果,请使用 ImageJ 测量每个细胞的中心荧光强度(7.5 μm 圆),从而跟踪细胞荧光随时间推后(3 或 5 分钟)。测量光漂白区域内所有未进行线粒体,且已完全光漂白的细胞。
    注:考虑从定量中省略线粒细胞,因为由于染色质凝结,线粒核的荧光比相间核更强。
  6. 在各种时间点(45 分钟、2 小时和 5 小时)绘制漂白后随时间的荧光强度。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA 电穿孔比 DNA 电穿孔更有效

我们使用 pCS2+。H2B-黄体素制备体外转录mRNA。由于DNA电穿孔通常在1-2μg/μL下进行,我们使用mRNA的等位浓度(计算为H2B-Citrine的约0.25-0.5微克/μL)进行mRNA电穿孔。我们首先测试了pCS2+的电穿孔效率。H2B-黄水晶DNA与H2B-黄水晶mRNA(从pCS2+的SP6启动子体转录的体外转录)。H2B-黄酸酯)通过将DNA或mRNA分别电穿孔到HH5青鱼胚胎中,然后在电穿孔后12小时检查电穿孔效率。虽然DNA电穿孔导致一些电穿孔细胞的荧光更亮,但与广泛表达的mRNA编码FPs相比,DNA电穿孔的效率明显较低(图2A和B)。

考虑到电穿孔协议中固有的胚胎到胚胎变异性,将编码H2B-...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此协议中,我们提供了关于如何精确微注射和电镀mRNA到胃化鹅胚胎细胞的逐步说明。我们证明,体外合成的mRNA电穿孔允许快速有效地表达荧光蛋白(FPs)在胃化鹅胚胎(图2和3)。 从电镀mRNA翻译的H2B-黄水晶蛋白的荧光可以在+20分钟内通过共聚焦显微镜检测,并在FP荧光中增加数小时(图3,补充电影1)。这是令人惊讶的快速和接近假定的黄水晶成熟时间32,33。从DNA载体表达的FPs在2-3小时后被检测到(图3,补充。电影1),这是类似于以前的报告8,34,35。

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人没有利益冲突可申报。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢大卫·胡斯对这项工作的有益见解。这项工作部分得到了玫瑰山基金会暑期研究奖学金(2016-2018年)和南加州大学教务长研究生研究奖学金、萨班研究所校内培养博士前博士奖和大学南加州本科生研究伙伴计划奖授予R.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HF新英格兰生物实验室R3136L
BglII新英格兰生物实验室R0144S
BsrG1-HF新英格兰生物实验室R3575S
NotI-HF新英格兰生物实验室R3189L
SalI-HF新英格兰生物实验室R3138L
苯酚：氯仿：异戊醇Thermo Fisher
SP6 mMessage 机体外转录试剂盒Thermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-（1,1,3,3-四甲基丁基）苯基 - 聚乙二醇，t< / em>-辛基苯氧基乙醇，聚乙二醇tert-辛基苯醚
DAPISigma AldrichD95422-（4-氨基苯基）-6-吲哚卡巴脒二盐酸盐，4′，6-二脒基-2-苯吲哚二盐酸盐，DAPI二盐酸盐
Whatman No.1 滤纸Sigma AldrichWHA1001125
甘油Sigma AldrichG9012
尿素Sigma Aldrich51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi 是 Dorus Gadella 的礼物（Addgene 质粒 # 36205;http://n2t.net/addgene:36205 ;RRID：Addgene_36205）
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5：605-7.PubMed ID：18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgene这篇论文
pCS.H2B-黄水晶Addgene53752pCS-H2B-黄水晶是 Sean Megason（Addgene 质粒 # 53752;http://n2t.net/addgene:53752 ;RRID：Addgene_53752）
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry 是 Sean Megason （Addgene 质粒 # 53750 http://n2t.net/addgene:53750;RRID：Addgene_53750）
蔡司 LSM-780 倒置显微镜Carl Zeiss Microscopy GmbHLSM-780是一款共聚焦和多光子显微镜，可提供重要成像工作所需的灵敏度。780 配备电动载物台、自动对焦装置和全载物台顶部遮光培养箱，是一款适用于高端活细胞/胚胎成像的出色显微镜。高灵敏度 32 通道 Quasar 探测器可实现光谱成像、线性解混和高色数 （>4） 图像采集。可以使用 6 线单光子激光器（405、458、488、514、564 和 633 nm）、变色龙（相干）2 光子激光器（范围从 690nm 到 1000nm）进行激发，并使用 ZEN 2011 SP7（黑色）系统软件运行。
CUY-21 EDIT 体内电穿孔仪Bex Co.， Ltd.
铂扁平方形电极，边长 5mmBex Co.， Ltd.
奥林巴斯MVX10 FL体视显微镜奥林巴斯生命科学
XM10单色相机奥林巴斯生命科学
<强>磷酸盐缓冲盐水（PBS）用于HCR（10次，pH 7.4）要制备1 L 10&次储备溶液，请混合80 g NaCl （Sigma-Aldrich S3014），2 g KCl （Sigma-Aldrich P9541），11.4 g Na2HPO4 （无水;Sigma-Aldrich S3264） 和 2.7 g KH2PO4 （无水;Sigma-Aldrich P9791）。用 HCl 将 pH 值调节至 7.4，并用超纯 H 2 O 将最终体积降至 1 L。避免在 PBS 中使用 CaCl2 和 MgCl2 进行 HCR。重要的是，用于 HCR 的 PBS 应制备为不含 RNase 的溶液（例如，通过焦碳酸二乙酯 [DEPC] 处理）。
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO< sub>4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton加入 1 mL Triton X-100 （Sigma Aldrich 93443） 和 100 mL 10&次;PBS 加入 890 mL 超纯蒸馏 H2O。通过 0.2 μ 过滤溶液;m 过滤器并将其存储在 4 ？C 直到使用。
1&次磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（DEPC 处理;pH 7.4）
0.1% Triton X-100
15593031LF701P5E

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