用于评估口腔中性粒细胞的稳定的小鼠牙周炎结扎诱导模型

摘要

本文介绍了一种建立结扎诱导的多颗上颌磨牙小鼠牙周炎模型的方案，该模型可导致更大范围的牙龈组织和骨组织受累，便于后续分析，并减少实验动物的使用量。同时描述了一种类似于人类受试者检测方法的口腔中性粒细胞评估技术。

摘要

利用小鼠模型研究牙周病病理生理学的主要优势在于动物成本较低、存在多种基因修饰品系，以及可对采集的软组织和硬组织进行大量分析。然而，许多此类模型存在操作上的争议。作为替代方案，可采用由局部形成并持续存在的失调性口腔微生物组驱动的结扎诱导型牙周病模型，该模型诱导迅速且相对可靠。遗憾的是，现有的结扎诱导小鼠牙周炎方案仅局限于牙周组织的局部区域，且易发生植入结扎线过早脱落的问题。这减少了可用于后续分析的组织量，并增加了实验所需动物数量。本方案详细描述了实现更佳固定效果的扩展磨牙结扎操作步骤，以及一种新型冲洗技术的使用方法，用于从小鼠口腔中回收中性粒细胞，提供了一种可缓解上述技术难题的替代性方法。

引言

牙周病（PD）是一种与显著宿主发病率和经济负担相关的溶骨性疾病，其特征为牙龈炎症以及受累牙齿的软组织附着和骨性支持的丧失^1,2,3,4。该过程由口腔微生物群与宿主先天免疫系统之间的相互作用所调控，还与糖尿病、心血管疾病和癌症等其他全身性炎症疾病的加重相关^5,6,7,8。传统上曾假设牙周病的发病机制依赖于特定细菌（如Porphyromonas gingivalis）的大量存在⁹。然而，近期证据表明，牙周病中的微生物成分是由牙菌斑生物膜介导的。这种生物膜是由多种微生物组成的有组织、复杂的群落，可处于健康的共生状态或破坏性的生态失调状态^10,11。口腔生物膜通常通过阻止致病菌定植灶的形成，并通过调节宿主免疫反应促进理想的牙龈组织结构与功能，从而对宿主起到保护作用^12,13。口腔内共生微生物与宿主免疫系统之间稳态关系的扰动可能导致组织稳态改变，进而引发菌群失调，并出现牙周病典型的临床和影像学表现^{5,10,12,13,14}。

有趣的是，尽管口腔菌群失调的建立是帕金森病（PD）启动所必需的，但其本身并不足以在所有个体中驱动PD的发生，这提示宿主免疫反应具有阻止菌群在共生状态与失调状态之间转变的能力¹⁵。这使得人们特别关注PD如何从局部和全身两个层面影响先天免疫系统的关键角色之一——多形核粒细胞（PMN），即中性粒细胞^16,17。

在人体中，健康牙周结缔组织每小时约从循环系统募集 2 × 10⁶ 个中性粒细胞（PMNs），使其成为该部位占主导地位的白细胞群体。随后，这些细胞作为龈沟液的组成部分，从龈沟排出至口腔。在牙周病（PD）存在的情况下，循环系统和口腔中均出现中性粒细胞增多，这些效应细胞表现出过度炎症的表型，导致上述牙周组织的破坏^{17,18,19,20,21,22}。因此，深入了解中性粒细胞在牙周病及其他全身性炎症疾病中的作用至关重要。

尽管普遍认为慢性疾病与牙周病（PD）之间存在双向关联，但其潜在机制尚未阐明，这给这些严重且可能致命的全身性疾病的管理带来了困难。已采用多种实验动物模型来研究牙周病的病理生理学，每种模型各有优缺点^23,24。特别聚焦于小鼠模型时，已有多种实验方案可用于牙周病的研究；然而，这些模型存在若干技术和生理学上的局限性^{25,26,27,28,29,30,31}。

首先，经口灌胃小鼠模型需要多次接种人类牙周致病菌，以诱导牙龈炎症和骨质丧失。此外，通常在实验前需进行一段时间的抗生素处理，以抑制小鼠口腔内的共生菌群²⁵。该模型通常需要专门的技术培训才能安全实施经口灌胃操作，仅使用了复杂的人类口腔微生物组中一小部分牙周致病菌，且需要数月时间才能形成牙槽骨吸收。

相比之下，化学诱导的小鼠模型通过口服给予三硝基苯磺酸（TNBS）或葡聚糖硫酸钠（DSS）来建立，这些试剂常用于在数月内建立小鼠结肠炎模型，以诱导牙周骨丧失²⁶。目前已有基于口腔内和口腔外脓肿的模型，分别涉及小鼠的切牙及背部组织和颅骨组织。在前一种脓肿模型中，需多次注射细菌，从而形成多个牙龈脓肿，但其导致的牙槽骨丧失较少，限制了其在牙周病（PD）研究中的应用。而后一种脓肿模型则更适用于研究口腔外部位的细菌毒力、炎症反应及骨吸收过程，但因此无法评估牙周组织及口腔微生物组^{27,28,29,30,31}。

在牙周炎的结扎诱导模型中，通常将编织丝线缝合线环绕结扎于第二磨牙周围。作为替代方法，也可将一段线性缝合材料插入第一和第二磨牙之间^32,33。结扎的目的是促进细菌积聚，并在龈沟内引发菌群失调，从而导致牙周组织炎症以及构成牙周组织的结构破坏。尤其值得注意的是，与更常用的经口灌胃模型相比，该模型能够引起更显著的牙槽骨丧失³⁴。此外，经口灌胃模型的应用还受到多种小鼠品系（如C57BL/6）天然抵抗牙槽骨丧失的限制。这一问题尤为突出，因为该品系是目前小鼠动物实验中最常用的品系³⁵。

Marchesan 等人以及 Abe 和 Hajishengallis 描述的现有操作流程旨在简化结扎线放置的技术步骤^33,36。然而，前一种方案需要使用专用的 3D 打印设备，且存在结扎线过早脱落的风险，从而增加实验动物的使用数量以及手术室额外操作时间带来的成本。此外，这两种方案均只能产生较小范围的病变牙周组织，可供研究的组织区域有限。

该技术的优势在于能够同时研究调控牙周组织的口腔菌群失调与免疫学机制，利用低成本且具有多样化遗传背景的动物，以及简便的饲养和管理方法。因此，研究目标应是最大化获取病变组织的量，并在遵循动物实验减量原则的前提下，尽可能减少动物使用数量。这就要求确保所有动物均能被纳入实验分析中³⁷。然而需要指出的是，无论采用何种牙周病动物模型，目前尚无单一模型能够涵盖人类牙周病病理生理学的所有方面。

本新方案采用大多数实验室常见的器械和材料，在多个上颌磨牙周围放置结扎线。该方法留有充足的时间，可轻松且可靠地安装结扎线，显著降低过早脱落的风险。最后，由于中性粒细胞（PMNs）在牙周病（PD）中协调牙周组织的破坏，本文还提出了一种新颖的方法，以类似于人类的方式回收口腔中性粒细胞。

方案

所有小鼠研究均符合相关伦理规定，并已获得多伦多大学动物护理委员会和研究伦理委员会批准（方案编号 20011930）。

1. 结扎装置安装

注意：这是一项非无菌手术操作，可在标准手术室中进行。使用无菌动物（本实验未涉及）时，必须在生物安全柜内操作，使用无菌器械，并通过向口腔接种牙周致病菌以引发牙周炎的临床表现。

1. 对中国台湾地区：在涉及地理或行政区域表述时，应遵循一个中国原则，将“Taiwan”译为“中国台湾”。不得使用任何暗示“两个中国”或“一中一台”的表述。 源文本翻译如下： 对已适应饲养环境的8–12周龄雄性C57BL/6小鼠，通过腹腔注射给予麻醉剂，剂量为0.5" 根据批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，使用26 G无菌皮下注射针头和1 mL注射器。
   注意：使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉剂组合可快速、可靠地在整个操作过程中诱导出适当的麻醉水平。
2. 在手术前以及手术过程中每15分钟评估一次麻醉深度，以足底反射消失为指标。
3. 将小鼠置于预热的手术台上（图1A）。使用弹性带将上颌和下颌固定在张开位置，并用棉卷垫高颈部，以帮助维持上颌处于更水平的方向（图1B用覆盖物遮盖动物的躯干和尾部，以减少手术过程中的热量散失。
4. 将手术显微镜调整至所需放大倍数，并调节照明（若照明设备未直接安装于显微镜上），使其对准口腔以观察牙列。尽管所需放大倍数因操作者而异，但在16倍放大下可获得对口腔结构的最佳可视化效果。
5. 使用镊子在牙龈沟内于第一（M1）和第二（M2）上颌磨牙周围安装无菌5-0编织丝线缝合线。
   注意：可使用较细规格的编织丝线缝合线，以加快安装速度并降低医源性软组织损伤的可能性。
   1. 将缝线的远端置于牙列的腭侧，近端则插入M2与M3邻接处之间图2A).
   2. 将缝线绕过M2的颊面，并将其插入M1与M2之间的邻接点。确保拉紧缝线的两端，使缝线进入龈沟并消除所有松动部分（图2B).
   3. 将缝线的近端线段绕过M1，在其外形高点下方，插入M1与M2的邻接点之间。拉紧缝线的近端线尾，使缝线进入龈沟并完全消除松弛。图2C).
      注意：若在 M1 与 M2 或 M2 与 M3 之间插入缝线时遇到阻力，可使用标准牙科探针轻微打开接触点。
   4. 用外科结将缝线两端打结，并尽可能剪短线尾。将结置于上颌牙列腭侧M1与M2之间的龈楔状隙内。图2D).
      注意：如有需要，可在对侧重复步骤 1.4.1–1.4.4。
   5. 在每只实验动物之间，使用热玻璃珠灭菌器对手术器械进行灭菌。
      警告：镊子的尖端极为锋利，容易造成口腔创伤和明显出血。准备小段纱布以清除口腔内的血液，并对活动性出血的伤口施加压力止血。
6. 结扎完成后，将小鼠从手术装置中取出，放入干净的笼子中，并置于加热灯下，监测直至完全恢复。
7. 将每只小鼠单独饲养，并提供适当的环境丰富化措施，允许其活动 随意摄取 在温度和湿度受控的环境中（12小时光照/12小时黑暗循环），自由摄取过滤水和研磨的标准饲料，持续7–11天。
   注意：研磨后的饲料可降低咀嚼所需的作用力，从而减轻与进食相关的疼痛，并有助于防止结扎线过早脱落。

2. 样本采集

1. 根据批准的 IACUC 指南对小鼠实施安乐死。
   注意：本方案首选使用 CO₂ 室进行个体安乐死，随后进行颈椎脱位。若实验需要采集其他组织，该方法可作相应调整。
2. 立即用移液器将 100 µL 4 °C 的无钙镁灭菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗口腔，持续 10 秒。
3. 重复步骤 2.2 两次，并将每次冲洗液置于同一个 15 mL 圆锥形聚丙烯无菌试管中。
4. 将液体通过 40 μm 尼龙网筛过滤，转移至 50 mL 圆锥形聚丙烯无菌试管中。
5. 将上述滤液转移至一个新的 15 mL 圆锥形聚丙烯无菌试管中。
   注意：将样本最终转移至较小体积的试管中，有助于在后续步骤中更清晰地观察细胞沉淀。
   1. 如需要，取出磨牙结扎线（或多条结扎线），放入另一支 15 mL 圆锥形聚丙烯无菌试管中，试管内含 300 µL 4 °C 的无钙镁灭菌 1× PBS。轻轻振荡后，将缝线从管中取出。从此步骤起，该样本的处理方式与口腔冲洗样本完全相同。
6. 加入 33.3 µL 的 16% 多聚甲醛（PFA），以促进样本固定。
7. 立即涡旋混匀样本，并在冰上孵育 15 分钟。
8. 用 1× PBS 加至 15 mL 以稀释 PFA，然后在 4 °C 下以 1000 × g 离心 5 分钟。
9. 吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 4 °C 的荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
10. 再次在 4 °C 下以 1000 RCF 离心 5 分钟。
11. 吸除上清液，将沉淀重悬于适量体积的 FACS 缓冲液中，使最终浓度为 0.5–1.0 × 10⁶ 个细胞/50 μL FACS 缓冲液。

3. 流式细胞术分析的抗体染色

注意：使用前请预先标记并冷藏所有必需的流式细胞术管。

1. 向50 μL样品中加入1 μL大鼠血清和2 μL抗小鼠IgG抗体，立即涡旋混匀，并在冰上封闭20分钟。
2. 向每份样品中加入适量抗体，立即涡旋混匀，避光冰上孵育30分钟。
   注意：抗体的选择及使用体积取决于针对该特定技术预先优化的小规模预实验结果。
3. 用1 mL FACS缓冲液洗涤样品，短暂涡旋后在4 °C、1000 x g 离心5分钟。重复此步骤2次。
4. 将样品重悬于250 μL FACS缓冲液中，用石蜡膜封口，再用铝箔纸包裹，于4 °C保存直至分析。
   注意：由于长期储存会导致荧光信号减弱，最好在完成实验方案后数小时内进行样品分析。但在必要时，样品也可在2–3天内完成分析。

结果

提供了由结扎诱导的牙周炎所致的小鼠正常（图3A）和炎症（图3B）口腔环境的代表性口腔冲洗样本流式细胞术数据。同时展示了从植入结扎材料中回收中性粒细胞（PMNs）的结果（图3C）。流式细胞仪各通道电压手动校准，并使用单染补偿微珠进行补偿调节。根据所述门控策略³⁸，将PMNs定义为Ly6G^+veF4/80^-ve。每个口腔冲洗液和结扎样本至少采集500个门控内的PMN事件。通过台盼蓝染色测定，PMN存活率约为37%。代表性图像显示了从牙槽骨嵴顶（ABC）至釉牙骨质界（CEJ）测量的牙槽骨水平，在健康小鼠（图4A）和结扎小鼠（图4

讨论

与小鼠结扎诱导牙周炎模型使用相关的关键要素是结扎线必须保留在原位，直至动物被处死或人为移除。已安置的利于生物膜滞留的结扎线可在短短6天内引发明显的牙槽骨高度丧失，并在第11至16天之间达到平台期³⁹。选择在骨量丧失达到最大值之前处死实验动物，从而使该模型成为一种更短周期的结扎诱导牙周炎模型，目的是进一步减少结扎线过早脱落的发生率；所谓过早脱落，是指在动物被处死前结扎线丢失，导致该动物无法用于诊断分析。

该模型最常被提及的缺点是，由于小鼠磨牙齿系尺寸极小（周长范围从M1的4.4 mm到M3的2.6 mm），结扎操作在技术上被认为较为困难⁴⁰。这一问题可通过由外科人员或受训人员进行结扎操作来缓解，每只动物的操作时间最多为10分钟，且包括麻醉给药过程。此外，结扎放置是一项通过重复练习即可掌握的技能，其操作复杂程度并不高于许多需要较高手动灵活性的常规实验室技术。从操作角度来看，腹腔麻醉可提供充足的操作时间以利于结扎的安装。如有需要，还可更换安装不理想的结扎线，因为将缝线定位至牙龈沟内，并将结扎结...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 F4/80 抗体	BioLegend	123131	BV421，克隆株 BM8
抗小鼠 Ly6G 抗体	BD	560602	PerCP-Cy5.5，克隆株 1A8
C57BL/6 雄性小鼠	Charles River		8 至 12 周龄
锥形离心管	FroggaBio	TB15-500	15 mL
锥形离心管	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS 缓冲液	多个来源		1% BSA（BioShop），2 mM EDTA（Merck），1× HBSS-/- （Gibco）
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		型号 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
热疗泵	Hallowell		HTP-1500
热玻璃珠灭菌器	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
虹膜剪刀	Almedic	7602-A8-684	直型
氯胺酮	Vetoquinol		100 mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
小鼠血清	Sigma	M5905-5ML
尼龙网筛滤器	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
多聚甲醛	Fisher Scientific	28908	16%（w/v），无甲醇
磷酸盐缓冲液	Sigma	D1408-500ML	不含 CaCl2 和 MgCl2，10×
塑料一次性注射器	BD	309659	1 mL
大鼠血清	Sigma	R9759-5ML
丝线缝合线	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
持针钳	Almedic	7726-A10-700	#1
持针钳	Almedic	7727-A10-704	#5
体视解剖显微镜	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
无菌皮下注射针头	BD	305111	26G × 1/2"
注射器	BD	309659	1 mL
赛拉嗪	Rompun		20 mg/mL