用于评估口腔中性粒细胞的稳定的小鼠牙周炎结扎诱导模型

摘要

本文介绍了一种建立结扎诱导的多颗上颌磨牙小鼠牙周炎模型的方案，该模型可导致更大范围的牙龈组织和骨组织受累，便于后续分析，并减少实验动物的使用量。同时描述了一种类似于人类受试者检测方法的口腔中性粒细胞评估技术。

摘要

利用小鼠模型研究牙周病病理生理学的主要优势在于动物成本较低、存在多种基因修饰品系，以及可对采集的软组织和硬组织进行大量分析。然而，许多此类模型存在操作上的争议。作为替代方案，可采用由局部形成并持续存在的失调性口腔微生物组驱动的结扎诱导型牙周病模型，该模型诱导迅速且相对可靠。遗憾的是，现有的结扎诱导小鼠牙周炎方案仅局限于牙周组织的局部区域，且易发生植入结扎线过早脱落的问题。这减少了可用于后续分析的组织量，并增加了实验所需动物数量。本方案详细描述了实现更佳固定效果的扩展磨牙结扎操作步骤，以及一种新型冲洗技术的使用方法，用于从小鼠口腔中回收中性粒细胞，提供了一种可缓解上述技术难题的替代性方法。

引言

牙周病（PD）是一种与显著宿主发病率和经济负担相关的溶骨性疾病，其特征为牙龈炎症以及受累牙齿的软组织附着和骨性支持的丧失^1,2,3,4。该过程由口腔微生物群与宿主先天免疫系统之间的相互作用所调控，还与糖尿病、心血管疾病和癌症等其他全身性炎症疾病的加重相关^5,6,7,8。传统上曾假设牙周病的发病机制依赖于特定细菌（如Porphyromonas gingivalis）的大量存在⁹。然而，近期证据表明，牙周病中的微生物成分是由牙菌斑生物膜介导的。这种生物膜是由多种微生物组成的有组织、复杂的群落，可处于健康的共生状态或破坏性的生态失调状态^10,11。口腔生物膜通常通过阻止致病菌定植灶的形成，并通过调节宿主免疫反应促进理想的牙龈组织结构与功能，从而对宿主....

方案

所有小鼠研究均符合相关伦理规定，并已获得多伦多大学动物护理委员会和研究伦理委员会批准（方案编号 20011930）。

1. 结扎装置安装

注意：这是一项非无菌手术操作，可在标准手术室中进行。使用无菌动物（本实验未涉及）时，必须在生物安全柜内操作，使用无菌器械，并通过向口腔接种牙周致病菌以引发牙周炎的临床表现。

1. 对中国台湾地区：在涉及地理或行政区域表述时，应遵循一个中国原则，将“Taiwan”译为“中国台湾”。不得使用任何暗示“两个中国”或“一中一台”的表述。 源文本翻译如下： 对已适应饲养环境的8–12周龄雄性C57BL/6小鼠，通过腹腔注射给予麻醉剂，剂量为0.5" 根据批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，使用26 G无菌皮下注射针头和1 mL注射器。
   注意：使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉剂组合可快速、可靠地在整个操作过程中诱导出适当的麻醉水平。
2. 在手术前以及手术过程中每15分钟评估一次麻醉深度，以足底反射消失为指标。
3. 将小鼠置于预热的手术台上（图1A）。使用弹性带将上颌和下颌固定在张开位置，并用棉卷垫高颈部，以帮助维持上颌处于更水平的方向（图1

结果

提供了由结扎诱导的牙周炎所致的小鼠正常（图3A）和炎症（图3B）口腔环境的代表性口腔冲洗样本流式细胞术数据。同时展示了从植入结扎材料中回收中性粒细胞（PMNs）的结果（图3C）。流式细胞仪各通道电压手动校准，并使用单染补偿微珠进行补偿调节。根据所述门控策略³⁸，将PMNs定义为Ly6G^+veF4/80^-ve。每个口腔冲洗液和结扎样本至少采集500个门控内的PMN事件。通过台盼蓝染色测定，PMN存活率约为37%。代表性图像显示了从牙槽骨嵴顶（ABC）至釉牙骨质界（CEJ）测量的牙槽骨水平，在健康小鼠（图4A）和结扎小鼠（图4

讨论

与小鼠结扎诱导牙周炎模型使用相关的关键要素是结扎线必须保留在原位，直至动物被处死或人为移除。已安置的利于生物膜滞留的结扎线可在短短6天内引发明显的牙槽骨高度丧失，并在第11至16天之间达到平台期³⁹。选择在骨量丧失达到最大值之前处死实验动物，从而使该模型成为一种更短周期的结扎诱导牙周炎模型，目的是进一步减少结扎线过早脱落的发生率；所谓过早脱落，是指在动物被处死前结扎线丢失，导致该动物无法用于诊断分析。

该模型最常被提及的缺点是，由于小鼠磨牙齿系尺寸极小（周长范围从M1的4.4 mm到M3的2.6 mm），结扎操作在技术上被认为较为困难⁴⁰。这一问题可通过由外科人员或受训人员进行结扎操作来缓解，每只动物的操作时间最多为10分钟，且包括麻醉给药过程。此外，结扎放置是一项通过重复练习即可掌握的技能，其操作复杂程度并不高于许多需要较高手动灵活性的常规实验室技术。从操作角度来看，腹腔麻醉可提供充足的操作时间以利于结扎的安装。如有需要，还可更换安装不理想的结扎线，因为将缝线定位至牙龈沟内，并将结扎结.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 F4/80 抗体	BioLegend	123131	BV421，克隆株 BM8
抗小鼠 Ly6G 抗体	BD	560602	PerCP-Cy5.5，克隆株 1A8
C57BL/6 雄性小鼠	Charles River		8 至 12 周龄
锥形离心管	FroggaBio	TB15-500	15 mL
锥形离心管	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS 缓冲液	多个来源		1% BSA（BioShop），2 mM EDTA（Merck），1× HBSS-/- （Gibco）
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		型号 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
热疗泵	Hallowell		HTP-1500
热玻璃珠灭菌器	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
虹膜剪刀	Almedic	7602-A8-684	直型
氯胺酮	Vetoquinol		100 mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
小鼠血清	Sigma	M5905-5ML
尼龙网筛滤器	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
多聚甲醛	Fisher Scientific	28908	16%（w/v），无甲醇
磷酸盐缓冲液	Sigma	D1408-500ML	不含 CaCl2 和 MgCl2，10×
塑料一次性注射器	BD	309659	1 mL
大鼠血清	Sigma	R9759-5ML
丝线缝合线	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
持针钳	Almedic	7726-A10-700	#1
持针钳	Almedic	7727-A10-704	#5
体视解剖显微镜	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
无菌皮下注射针头	BD	305111	26G × 1/2"
注射器	BD	309659	1 mL
赛拉嗪	Rompun		20 mg/mL