一种用于对软骨细胞施加动态压缩刺激的微流控平台

摘要

本文提供了用于软骨细胞压缩的气动微流控装置的制备与表征的详细方法。

摘要

已知机械刺激可调节细胞和组织的生物学功能。近期研究表明，压缩应力会改变生长板软骨的结构，从而影响儿童长骨的生长。为了确定压缩应力在骨生长中的作用，我们开发了一种由气压驱动的微流控装置，可对嵌入藻酸盐水凝胶圆柱体中的生长板软骨细胞施加动态（或静态）压缩。本文详细描述了该装置的制备与表征方法。本实验方案的优势包括：1）在同一平台上，可在五个技术重复中产生五种不同强度的压缩应力；2）可通过普通光学显微镜方便地观察细胞形态；3）压缩后可快速从装置中分离细胞，便于后续检测；4）该平台可用于研究任何能在水凝胶中生长的细胞类型的力学生物学特性。

引言

微加工平台是研究分子、细胞和组织水平生物学的有力工具，因为它们能够动态调控物理和化学微环境^{1,2,3,4,5,6,7,8}。因此，可在严格控制的条件下同时检验多个假设。对于生长板软骨而言，越来越多的证据表明，压缩应力通过作用于生长板软骨在调节骨骼生长中发挥重要作用^{9,10,11,12,13,14,15,}

方案

注意：在本方案的每一步骤中，均需佩戴个人防护装备（PPE），如手套和实验服。

1. 母模制备

注意：步骤 1.1 - 1.3 需在通风橱中进行。

1. 玻璃处理
   注意：步骤 1.1 中需佩戴面罩、手套和实验服。
   1. 将硫酸（H₂SO₄）与过氧化氢（H₂O₂）按一定比例混合，配制 60 mL 的 Piranha 溶液。₂SO₄）和过氧化氢（H₂O₂₂O₂体积比为3:1。
      警告：由于存在爆炸危险，禁止在同一个通风橱内使用Piranha溶液和丙酮。
   2. 将一块玻璃板（50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 mm）置于Piranha溶液中，40℃下处理30分钟 °C.
   3. 用去离子水（diH₂O）冲洗玻璃板₂O)
   4. 将玻璃板置于室温的丙酮中10分钟。
   5. 用异丙醇冲洗玻璃板，并用氮气（N₂）吹干₂）气体。
   6. 将玻璃板在200℃下烘烤 °在加热板上于 C 条件下加热 20 分钟。后续所有烘烤步骤均使用加热板。
2. 玻璃板上 SU-8 种子层的形成 <....

结果

本文展示了微流控软骨细胞压缩装置制备的详细步骤（图2）。该装置包含一个5 × 5排列的圆柱形海藻酸盐-软骨细胞结构阵列，这些结构可受到五种不同幅度的压缩（图1、图3和图4）。气动微通道的高度约为90 μm，PDMS气囊的直径分别为1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mm。通过共聚焦显微镜在静态压缩条件下结合图像处理对装置性能进行了量化。由于共聚焦显微镜的z轴层扫成像需要数分钟时间，因此在动态压缩过程中进行定量成像速度过慢，故采用静态压缩进行显微成像。

图3a 显示了在2号玻璃板上制备的5 × 5海藻酸盐水凝胶柱阵列（直径：约0.8 mm，高度：约1 mm）。通过在凝胶中添加荧光微球对这些凝胶结构进行成像。图3b

讨论

为了研究压缩应力对生长板软骨细胞的影响，我们开发了微流控软骨细胞压缩装置（图1），可在高通量条件下对包裹于海藻酸盐水凝胶支架中的软骨细胞施加不同水平的压缩应力，以进行三维培养。为帮助其他研究人员采用本装置或开发类似装置，本文详细提供了该装置的制备步骤。

本方案中的关键步骤包括：1）制备不含任何气泡的带有气动微通道的PDMS层（第1层），因为第1层中的气泡在剥离背衬透明膜时可能损坏气动微通道；2）保持恒定的温度（例如80 °C）固化PDMS气囊（第2层），因为PDMS的弹性已知与固化温度有关³⁶；3）将海藻酸盐凝胶结构与PDMS气囊对齐；4）在硅烷化处理后的两天内使用新鲜的氨基硅烷化玻璃板（玻璃板2），以将海藻酸盐凝胶柱牢固结合在玻璃板2上。

本方案的主要局限在于，由于涉及光刻和多次软光刻步骤，器件的制备过程相对费时费力。此外，每当使用不同类型的水凝胶和细胞时，都需要重新评估基于本方案制备的微流控细胞压缩装置的性能。这是因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（ATPES）	Sigma-Aldrich	741442-100ML
(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷	United Chemical Technologies	T2492-KG
丙烯酸板	McMaster-Carr	8560K354
空气泵	施瓦策精密仪器	SP 500 EC-LC4.5V DC	我们使用的是2015年购买的型号。SP 500 EC-LC空气泵的内部设计和性能在2016年初发生了变化。此外，空气泵的性能会随着时间推移而发生变化。因此，SP 500 EC-LC空气泵在使用前应进行压力校准。
海藻酸钠粉末	FMC 公司	Pronova UP MVG
直型金属连接管接头	Pneumadyne	EB40-250
Calcein AM	Invitrogen	C3100MP
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11960-044
染成红色的水相荧光颗粒	赛默飞世尔科技	R0100
EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）	赛默飞世尔科技	22980
泡沫垫	格雷格	货号 # 5GCE8
函数/任意波形发生器	是德科技	33210A
盐酸	Fisher Chemical	A144-500
过氧化氢	Fisher BioReagents	BP2633500
异丙醇	BDH1174-4LP	VWR
显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	22-267-013
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-001
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	道康宁	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
电源	是德科技	E3630A
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50004
氢氧化钠	Fisher Chemical	S318-1
电磁阀组	Pneumadyne	MSV10-1
电磁阀	Pneumadyne	S10MM-30-12-3
旋涂仪	劳雷尔科技	WS-650Mz-23NPPB
SU8 显影液	MicroChem 公司	Y020100 4000L1PE
SU8-100	MicroChem 公司	Y131273 0500L1GL
SU8-5	MicroChem 公司	Y131252 0500L1GL
磺基-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）	赛默飞世尔科技	24510
硫酸	EMD Millipore	MSX12445