方法文章

微流体平台，用于用动态压缩刺激软骨细胞

DOI：

10.3791/59676

⸱

2019年9月13日

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

本文内容

摘要

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本文提供了用于软骨细胞压缩的气动微流体装置的制造和特征的详细方法。

摘要

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众所周知，机械刺激可以调节细胞和组织的生物功能。最近的研究表明，压缩应力会改变生长板软骨结构，导致儿童长骨的生长调节。为了确定压缩应力在骨骼生长中的作用，我们创建了一种由气动压力驱动微流体装置，以动态（或静态）压缩嵌入在藻酸盐水凝胶缸中的生长板软骨细胞。在本文中，我们将介绍制造和描述此设备的详细方法。我们的协议的优点是:1） 在单个平台上的五个技术复制上可以生成五种不同幅度的压缩应力;2） 通过传统的光学显微镜很容易可视化细胞形态;3） 细胞可以快速分离从设备压缩后，以方便下游检测，4）该平台可应用于研究任何细胞类型的机械生物学，可以在水凝胶中生长。

引言

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微工程平台是研究分子、细胞和组织水平生物学的宝贵工具，因为它们能够动态控制物理和化学微环境1、2、3 ，4，5，6，7，8.因此，可以同时以严格控制的方式测试多个假设。在生长板软骨的情况下，有越来越多的证据表明，通过作用调节骨骼生长，压缩应力在生长板软骨9、10、11、 12，13，14，15，

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方案

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注:在本协议的每一步都佩戴个人防护设备（PPE），如手套和实验室外套。

1. 主模具制造

注:在烟机罩中执行步骤 1.1 - 1.3。

  1. 玻璃处理
    注:为步骤 1.1 佩戴面罩、手套和实验室外套。
    1. 通过混合硫酸（H2SO4）和过氧化氢（H2O2），使皮兰哈溶液（60 mL）的体积比为3:1。
      注意:由于爆炸危险，请勿在同一烟罩中使用Piranha溶液和丙酮。
    2. 在 Piranha 溶液中放置玻璃板（50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 mm），在 40°C 下放置 30 分钟。
    3. 用去离子水（diH2O）冲洗玻璃板。
    4. 将玻璃板置于室温下丙酮10分钟。
    5. 用异丙醇冲洗玻璃板，然后用氮气（N2）气体干燥。
    6. 在热板上在 200°C 下烘烤玻璃板 20 分钟。所有后续烘焙步骤均使用热板。
  2. SU-8 种子层形成在玻璃板上
    1. 将 SU-8 5 涂在玻璃板上，并带有一次性移液器，覆盖板表面面积约的 2/3。
    2. 使用 SU-8 5 光阻器在 500 rpm 下旋转玻璃板，....

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结果

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本文介绍了微流体软骨细胞压缩装置制造的详细步骤（图2）。该器件包含5×5阵列的圆柱形藻状细胞-软骨细胞结构，这些构造可以压缩五种不同程度的压缩（图1，图3和图4）。气动微通道的高度约为90 μm，PDMS气球直径分别为1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mm。该器件的性能通过具有静态压缩条件和图像处理的共聚焦显微镜进行量化。静态压缩用于显微成像，因为z堆栈成像与共聚焦显微镜需要几分钟时间，因此在动态压缩期间，定量成像速度太慢。

图 3a显示了玻璃板 2 上铸造的 5 × 5 阵列的藻酸盐水凝胶柱（直径:±0.8 mm，高度:±1 mm）。通过在凝胶中加入荧光珠来成像这些凝胶结构。图 3b显示了一个示例案例，.......

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讨论

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为了测试压缩应力对生长板软骨细胞的影响，我们开发了微流体软骨细胞压缩装置（图1），用于将不同级别的压缩应力应用于3D藻酸水凝胶支架中的软骨细胞高吞吐量方式的文化。为了帮助其他研究人员采用我们的设备或开发类似的设备，我们在本协议文章中提供了设备制造步骤的详细信息。

该协议的关键步骤是 1） 使用气动微通道（第 1 层）制造 PDMS 层，没有任何气泡，因为第 1 层中的气泡可能会损坏气动微通道，同时将背衬透明度膜剥离，2） 保持用于固化 PDMS 气球（第 2 层）的恒定温度（例如 80°C），因为 PDMS 的弹性已知取决于固化温度36，3）使用新鲜的氨基硅化玻璃将藻酸盐凝胶结构与 PDMS 气球对齐 4板（玻璃板2）用于在盐渍化处理后两天内将藻酸盐凝胶柱粘结在玻璃板上2。

该协议的主要局限性是，制造设备相对耗费大量人力，因为该过程涉及光刻和软光刻的多个步骤。此外，每当使用不同类型的水凝胶和细胞时，都需要评估基于我们协议.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们感谢克里斯托弗·莫雷斯和斯蒂芬·莫林博士对设备设计和制造的支持。这项研究得到了内布拉斯加大学林肯分校（UNL）和内布拉斯加大学医学中心（UNMC）的人类健康生物工程资助，并得到了NIH/NIAMS的AR070242资助。我们感谢内布拉斯加大学医学中心高级显微镜核心设施的Janice A. Taylor和James R. Talaska为共聚焦显微镜提供帮助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷 （ATPES）Sigma-Aldrich741442-100ML（
十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）-1-三氯氢硅烷联合化学技术T2492-KG
亚克力板McMaster-Carr8560K354
气泵Schwarzer PrecisionSP 500 EC-LC4.5V DC我们使用了 2015 年购买的型号。气泵 （SP 500 EC-LC） 的内部设计和性能在 2016 年初发生了变化。此外，气泵的性能随着时间的推移而变化。因此，SP 500 EC-LC 气泵产生的气压应在使用前进行校准。
海藻酸盐粉FMC CorporationPronova UP MVG
倒钩直连接器（金属管）PneumadyneEB40-250
钙黄绿素 AMInvitrogenC3100MP
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）Gibco11960-044
染色的红色荧光水颗粒Thermo Fisher ScientificR0100
EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）Thermo Fisher Scientific22980
泡沫垫GRAINGER项目 # 5GCE8
函数/任意波形发生器Keysight Technologies33210A
盐酸Fisher ChemicalA144-500
过氧化氢Fisher生物试剂BP2633500
异丙醇BDH1174-4LPVWR
显微镜载玻片Thermo Fisher Scientific22-267-013
等离子清洗剂Harrick PlasmaPDC-001
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）道康宁184 SIL ELAST 套件 0.5 千克
电源Keysight TechnologiesE3630A
SeaKem LE 琼脂糖Lonza50004
氢氧化钠Fisher ChemicalS318-1
电磁歧管PneumadyneMSV10-1
电磁阀PneumadyneS10MM-30-12-3
旋涂机Laurell TechnologiesWS-650Mz-23NPPB
SU8 显影剂MicroChem 公司Y020100 4000L1PE
SU8-100MicroChem Corp.Y131273 0500L1GL
SU8-5MicroChem Corp.Y131252 0500L1GL
磺基 NHS（N-羟基磺基琥珀酰亚胺）Thermo Fisher Scientific24510
硫酸EMD MilliporeMSX12445

参考文献

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  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskelet....

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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Microfluidic DeviceChondrocyte CompressionDynamic CompressionPDMS FabricationAlginate HydrogelGrowth PlateMechanobiologyPneumatic ActuationCell IsolationFluorescence Microscopy

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