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方法文章

一种用于对软骨细胞施加动态压缩刺激的微流控平台

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DOI：

10.3791/59676

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2019年9月13日

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

本文内容

摘要

本文提供了用于软骨细胞压缩的气动微流控装置的制备与表征的详细方法。

摘要

已知机械刺激可调节细胞和组织的生物学功能。近期研究表明，压缩应力会改变生长板软骨的结构，从而影响儿童长骨的生长。为了确定压缩应力在骨生长中的作用，我们开发了一种由气压驱动的微流控装置，可对嵌入藻酸盐水凝胶圆柱体中的生长板软骨细胞施加动态（或静态）压缩。本文详细描述了该装置的制备与表征方法。本实验方案的优势包括：1）在同一平台上，可在五个技术重复中产生五种不同强度的压缩应力；2）可通过普通光学显微镜方便地观察细胞形态；3）压缩后可快速从装置中分离细胞，便于后续检测；4）该平台可用于研究任何能在水凝胶中生长的细胞类型的力学生物学特性。

引言

微加工平台是研究分子、细胞和组织水平生物学的有力工具，因为它们能够动态调控物理和化学微环境1,2,3,4,5,6,7,8。因此，可在严格控制的条件下同时检验多个假设。对于生长板软骨而言，越来越多的证据表明，压缩应力通过作用于生长板软骨在调节骨骼生长中发挥重要作用9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25。然而，压缩应力的作用机制——特别是应力如何引导生长板中软骨细胞柱的形成——仍不清楚。

本实验方案的目标是构建一种气动驱动的微流控软骨细胞压缩装置26，以阐明生长板软骨细胞中力学生物学的机制（图1a-c）。该装置由两部分组成：气动驱动单元和海藻酸盐凝胶结构。微流控气动驱动单元采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）通过光刻和软光刻技术制备而成，包含一个5 × 5排列的薄PDMS膜气囊阵列，其膨胀程度可根据气囊直径的不同而变化。海藻酸盐凝胶结构由嵌入在5 × 5阵列海藻酸盐凝胶圆柱体中的软骨细胞构成，整个海藻酸盐-软骨细胞结构与驱动单元组装在一起。通过气动膨胀的PDMS气囊对海藻酸盐凝胶结构施加压缩（图1b）。由于PDMS气囊直径不同，该微流控装置可在同一平台上同时产生五种不同水平的压缩应力。因此，可在多种压缩条件下对软骨细胞的力学生物学进行高通量检测。

本方案中描述的微流控装置在研究软骨细胞力学生物学方面相较于传统的压缩装置（如外固定器14,21,23和宏观压缩装置16,19,27,28）具有多种优势：1）微流控装置成本较低，因其所需样品体积小于宏观压缩装置；2）微流控装置效率高，可同时测试多种压缩条件；3）微流控装置可通过微通道内有限混合形成化学物质浓度梯度，从而实现力学与化学刺激的联合施加；4）由透明PDMS制成的微流控装置可兼容多种显微镜技术（如延时显微成像和荧光共聚焦显微镜）。

我们采用并改进了Moraes等人的方法7,29，在单个装置中创建不同的压缩应力水平，以实现软骨细胞压缩的高通量力学生物学研究。该方法适用于需要三维（3D）培养环境的细胞（例如软骨细胞），以及细胞压缩后的生物学检测。尽管一些微流控细胞压缩装置能够压缩在二维（2D）基底上培养的细胞30,31,32，但这些装置不适用于软骨细胞，因为二维培养的软骨细胞会发生去分化。目前已有一些微流控平台可用于在光聚合水凝胶中压缩三维培养的细胞7,33，但由于从光聚合水凝胶中分离细胞较为困难，这些平台在压缩实验后难以实现细胞的有效回收。此外，紫外光（UV）照射和光交联引发剂对细胞的影响可能需要进一步评估。相比之下，我们的方法可在压缩实验后快速分离细胞，便于后续生物学检测，因为海藻酸盐水凝胶可通过钙螯合剂迅速解聚。本方案详细描述了该装置的制备与表征方法。微流控软骨细胞压缩装置的简要制备流程见图2。

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方案

注意：在本方案的每一步骤中，均需佩戴个人防护装备（PPE），如手套和实验服。

1. 母模制备

注意：步骤 1.1 - 1.3 需在通风橱中进行。

  1. 玻璃处理
    注意：步骤 1.1 中需佩戴面罩、手套和实验服。
    1. 将硫酸（H₂SO₄）与过氧化氢（H₂O₂）按一定比例混合，配制 60 mL 的 Piranha 溶液。2SO4）和过氧化氢（H₂O₂2O2体积比为3:1。
      警告：由于存在爆炸危险，禁止在同一个通风橱内使用Piranha溶液和丙酮。
    2. 将一块玻璃板（50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 mm）置于Piranha溶液中，40℃下处理30分钟 °C.
    3. 用去离子水（diH₂O）冲洗玻璃板2O)
    4. 将玻璃板置于室温的丙酮中10分钟。
    5. 用异丙醇冲洗玻璃板，并用氮气（N₂）吹干2）气体。
    6. 将玻璃板在200℃下烘烤 °在加热板上于 C 条件下加热 20 分钟。后续所有烘烤步骤均使用加热板。
  2. 玻璃板上 SU-8 种子层的形成
    1. 用一次性移液管将SU-8 5涂布于玻璃板上，覆盖约2/3的板面面积。
    2. 使用旋涂仪，先以 500 rpm 转速旋转涂布含 SU-8 5 光刻胶的玻璃板 35 秒（初始旋转周期），随后以 2,500 rpm 转速旋转 40 秒（最终旋转周期）。此后所有旋涂步骤均包含相同的初始旋转周期。
    3. 将涂有 SU-8 5 的玻璃板在 65 ℃ 烘烤 °C 下 2 分钟，然后在 95 °5 分钟，4 °C
    4. 将涂有 SU-8 5 的玻璃板暴露于紫外光下（60 mW/cm²）2，紫外灯与光掩模之间的距离为 20 cm，紫外光总能量 = 60 mJ/cm2）1 秒。
      注意：紫外曝光时间应根据所用紫外灯的功率进行调整。
    5. 将涂有 SU-8 5 的玻璃板在 65 ℃ 烘烤 °C，持续 2 分钟，然后在 95 °5 分钟，C
    6. 将烘烤后的玻璃板置于SU-8显影液中2分钟。
    7. 将涂有 SU-8 5 的玻璃在 180 ℃ 下烘烤 °20 分钟，4 °C
  3. 使用光刻法制备SU-8通道图案图2a 步骤 1-3)
    1. 将 SU-8 100 倒在已涂覆 SU-8 5 的玻璃片上，覆盖约 2/3 的玻璃片表面积。
    2. 以 3,000 rpm 的速度旋转涂有 SU-8 100 的玻璃板，持续 38 秒（≈ 90 μ微米厚。
    3. 将涂有 SU-8 100 的玻璃板在 65 °C 下烘烤 °C 下 10 分钟，然后在 95 °C 下 30 分钟。如果经过此步骤后 SU-8 100 仍然发黏，可在 95 °C，直至 SU-8 100 变为不粘状态。
    4. 放置高分辨率微通道光掩模（25,400 dpi，参见 补充图1）置于涂有SU-8 100的玻璃板上，并将覆盖有光掩模的玻璃板暴露于紫外光下4秒（紫外光总能量=240 mJ/cm²）2).
      注意：紫外曝光时间应根据所用紫外灯的功率进行调整。
    5. 从玻璃板上取下光掩模，并将玻璃板在65℃下烘烤 °C 下 2 分钟，然后 95 °C，20 分钟。
    6. 将烘烤后的玻璃板放入容器中，并用铝箔包裹容器以避光，过夜固化。
    7. 在 SU-8 显影液中对玻璃板上的 SU-8 100 微通道图案显影 15 分钟。
    8. 用异丙醇清洗 SU-8 图案化玻璃板（主模具），并用 N₂ 吹干2 如果在此过程中仍有白色颗粒残留，重复步骤7，持续5分钟。

2. 气动驱动单元

  1. 微通道层（第1层）
    注意：在通风橱内执行步骤2.1.1至2.1.2。
    1. 在盖玻片上滴加200 μL的（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）-1-三氯硅烷，并将其与母模一同放入真空腔中。
    2. 在腔体内抽真空2分钟，随后静置6小时（或过夜），以完成模具的硅烷化处理。
    3. 按10:1的质量比（预聚物：固化剂）混合PDMS，持续搅拌5分钟。
      注意：所有后续PDMS浇铸步骤均采用相同的预聚物与固化剂质量比（10:1）。
    4. 将PDMS浇注于母模上，并在真空腔中脱气30分钟。
    5. 用一张透明薄膜夹住PDMS。
    6. 使用玻璃板、泡沫垫和有机玻璃板夹紧上述夹层结构（图2a 步骤4）。
    7. 在80 °C烘箱中固化PDMS 6小时。
    8. 从夹层结构中分离出带有透明薄膜的PDMS层（第1层）（图2a 步骤5）。
    9. 使用等离子清洗仪对第1层和一块洁净的玻璃板（玻璃板1；50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 mm）表面进行活化处理，时间为1分钟。
      注意：等离子清洗时间可能因所用等离子清洗仪的功率不同而有所变化。
    10. 将第1层键合到玻璃板1上，并置于80 °C烘箱中30分钟。
    11. 从第1层上移除透明薄膜。
  2. 薄PDMS膜（第2层）
    1. 在透明薄膜上以1,000 rpm转速旋涂未固化的PDMS，持续1分钟，以获得厚度约为60 μm的PDMS层。
    2. 在80 °C烘箱中部分固化旋涂后的PDMS（第2层），时间为20–30分钟。
    3. 使用等离子清洗仪对玻璃板1上的第1层和第2层进行表面活化，时间为1分钟。
      注意：等离子清洗时间可能因所用等离子清洗仪的功率不同而有所变化。
    4. 将第2层键合至第1层，并在80 °C烘箱中过夜固化。
  3. 管路块
    1. 将金属管垂直放置于培养皿中。
    2. 缓慢倒入PDMS，使金属管约3/4部分浸没于其中。
    3. 在60 °C烘箱中固化PDMS 6小时（或过夜）。
    4. 切割一块包含一根金属管的PDMS块。
    5. 在第2层上打孔，作为进样口。
    6. 使用等离子清洗仪对PDMS块和第2层进行表面活化，时间为1分钟。
    7. 将PDMS块连接至第2层的进样口部位，并将整个驱动单元置于80 °C烘箱中过夜。

3. 藻酸盐-软骨细胞（或微珠）构建物

  1. 氨基硅烷化玻璃板
    1. 使用金刚石划片器将一块玻璃板（50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 mm）切割成两块半尺寸的玻璃板（50.8 mm × 38.1 mm × 1.2 mm）。
    2. 将玻璃板置于 0.2 M 盐酸（HCl）中，轻轻振荡（例如，55 rpm）过夜。
    3. 用去离子水（diH2O）冲洗玻璃板。
    4. 将玻璃板在 0.1 M 氢氧化钠（NaOH）中以 55 rpm 振荡 1 小时，并用去离子水（diH2O）冲洗。
    5. 将玻璃板在 1%（v/v）3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTES）中以 55 rpm 振荡 1 小时，并用去离子水（diH2O）冲洗。
    6. 将氨基硅烷化玻璃板在通风橱中干燥过夜。
  2. 用于藻酸盐凝胶结构的琼脂糖凝胶模具
    1. 在去离子水（diH2O）中混合 5%（w/v）琼脂糖和 200 mM 氯化钙（CaCl2）。
    2. 使用微波炉（或加热板）煮沸琼脂糖凝胶溶液。煮沸时间根据琼脂糖凝胶溶液的体积以及微波炉功率（或加热板温度）而定。
    3. 将煮沸的琼脂糖凝胶溶液倒入铝制模具中（见补充图 S2），并用玻璃板夹紧。
    4. 等待 5 分钟后，将固化的琼脂糖凝胶从铝制模具中脱模。
  3. 生长板软骨细胞的获取
    1. 从新生小鼠后肢中分离出生长板。
    2. 将生长板置于 1 mL 0.25% 胶原酶中，在 37 °C 和 8% 二氧化碳（CO2）的培养箱中孵育 3 小时，以去除细胞外基质（ECM）。
    3. 将消化后的样品在 125 x g 条件下离心 5 分钟，形成软骨细胞沉淀，并去除上清液。此处，1 x g 为重力加速度。
    4. 用 1 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）重悬软骨细胞沉淀。
    5. 使用细胞计数器测定 DMEM 中软骨细胞的数量。
    6. 将 DMEM 中的软骨细胞在 125 x g 条件下离心 5 分钟，再次形成软骨细胞沉淀，并去除上清液。
    7. 可选：将软骨细胞沉淀重悬于含 2 μM 钙黄绿素 AM 的软骨细胞培养基（CCM）34 中，在 37 °C 下孵育 30 分钟。重复步骤 3.3.6，然后进入步骤 3.3.8。
    8. 将软骨细胞沉淀重悬于适量 CCM 中，并在 37 °C 和 8% CO2 的培养箱中保存待用。
  4. 藻酸盐-软骨细胞（或微珠）结构（图 2c）
    1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 1.5%（w/v）藻酸盐溶液，并加入 5 mg/mL 的磺基-NHS 和 10 mg/mL 的 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）。
    2. 将 8 × 106 个软骨细胞加入 1 mL 藻酸盐凝胶溶液中［或在 1 mL 藻酸盐凝胶溶液（0.3%（v/v））中加入 3 μL 直径为 1 μm 的荧光微珠（542/612 nm）］。
    3. 将 150 μL 藻酸盐-软骨细胞（或微珠）溶液滴加至第 3.1 步制备的氨基硅烷化玻璃板上。
    4. 用琼脂糖凝胶模具覆盖藻酸盐凝胶溶液，持续 3 分钟。
    5. 用刀片刮除从琼脂糖凝胶模具溢出的多余藻酸盐凝胶溶液，然后移除琼脂糖凝胶模具。此时，在氨基硅烷化玻璃板上获得圆柱形藻酸盐-软骨细胞（或微珠）结构。
    6. 将藻酸盐-软骨细胞结构置于交联溶液（50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl 溶于去离子水（diH2O））中 1 分钟，以完成进一步聚合。

4. 装置组装（图2d）

注意：PDMS 间隔片和 3D 打印夹具需单独制备。

  1. 在驱动单元的第二层四个角落放置四个厚度为1 mm的PDMS垫片。
  2. 加入700 μL CCM，覆盖第二层的气室。
  3. 将海藻酸盐-软骨细胞（或微珠）构建物放置在第二层上，同时仔细对齐构建物与气室的位置。
  4. 使用3D打印夹具夹紧装置（图1c）。

5. 装置的驱动

  1. 使用硅胶管将气泵的出口（参见材料表）连接至电磁阀的入口。
  2. 使用硅胶管将电磁阀的出口连接至已组装设备的入口。
  3. 将电磁阀连接至信号发生器。
  4. 通过信号发生器产生的方波信号（例如，1 Hz）控制电磁阀。
  5. 打开气泵，以气动方式驱动设备。

6. 软骨细胞在装置中的成像

注意：为了获得良好的图像质量，应通过玻璃板2对藻酸盐凝胶中的软骨细胞（或荧光微球）进行成像，因为膨胀的PDMS气囊和空气腔室可能会扭曲光学图像。如果使用倒置显微镜进行成像，需将装置放置成玻璃板2朝下的方向。

  1. 按照前文所述步骤，将软骨细胞（或荧光微珠）接种至装置中。
  2. 取 z分别在压缩前和压缩过程中，使用共聚焦显微镜采集软骨细胞（或荧光微球）的叠层图像。选择一个 z基于所用共聚焦成像系统的景深确定步长。
  3. 软骨细胞（或海藻酸盐微珠结构）的高度可通过先前文献中所述的自动图像处理方法进行测量26,35.

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结果

本文展示了微流控软骨细胞压缩装置制备的详细步骤（图2）。该装置包含一个5 × 5排列的圆柱形海藻酸盐-软骨细胞结构阵列，这些结构可受到五种不同幅度的压缩（图1、图3和图4）。气动微通道的高度约为90 μm，PDMS气囊的直径分别为1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mm。通过共聚焦显微镜在静态压缩条件下结合图像处理对装置性能进行了量化。由于共聚焦显微镜的z轴层扫成像需要数分钟时间，因此在动态压缩过程中进行定量成像速度过慢，故采用静态压缩进行显微成像。

图3a 显示了在2号玻璃板上制备的5 × 5海藻酸盐水凝胶柱阵列（直径：约0.8 mm，高度：约1 mm）。通过在凝胶中添加荧光微球对这些凝胶结构进行成像。图3b

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讨论

为了研究压缩应力对生长板软骨细胞的影响，我们开发了微流控软骨细胞压缩装置（图1），可在高通量条件下对包裹于海藻酸盐水凝胶支架中的软骨细胞施加不同水平的压缩应力，以进行三维培养。为帮助其他研究人员采用本装置或开发类似装置，本文详细提供了该装置的制备步骤。

本方案中的关键步骤包括：1）制备不含任何气泡的带有气动微通道的PDMS层（第1层），因为第1层中的气泡在剥离背衬透明膜时可能损坏气动微通道；2）保持恒定的温度（例如80 °C）固化PDMS气囊（第2层），因为PDMS的弹性已知与固化温度有关36；3）将海藻酸盐凝胶结构与PDMS气囊对齐；4）在硅烷化处理后的两天内使用新鲜的氨基硅烷化玻璃板（玻璃板2），以将海藻酸盐凝胶柱牢固结合在玻璃板2上。

本方案的主要局限在于，由于涉及光刻和多次软光刻步骤，器件的制备过程相对费时费力。此外，每当使用不同类型的水凝胶和细胞时，都需要重新评估基于本方案制备的微流控细胞压缩装置的性能。这是因...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Christopher Moraes 博士和 Stephen A. Morin 博士在设备设计与制造方面提供的支持。本研究得到了内布拉斯加大学林肯分校（UNL）与内布拉斯加医学中心大学（UNMC）联合资助的“人类健康生物工程”项目以及美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）AR070242 项目的资助。我们感谢内布拉斯加医学中心先进显微镜核心设施的 Janice A. Taylor 和 James R. Talaska 在共聚焦显微镜技术方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（ATPES）Sigma-Aldrich741442-100ML
(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷United Chemical TechnologiesT2492-KG
丙烯酸板McMaster-Carr8560K354
空气泵施瓦策精密仪器SP 500 EC-LC4.5V DC我们使用的是2015年购买的型号。SP 500 EC-LC空气泵的内部设计和性能在2016年初发生了变化。此外，空气泵的性能会随着时间推移而发生变化。因此，SP 500 EC-LC空气泵在使用前应进行压力校准。
海藻酸钠粉末FMC 公司Pronova UP MVG
直型金属连接管接头PneumadyneEB40-250
Calcein AMInvitrogenC3100MP
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11960-044
染成红色的水相荧光颗粒赛默飞世尔科技R0100
EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）赛默飞世尔科技22980
泡沫垫格雷格货号 # 5GCE8
函数/任意波形发生器是德科技33210A
盐酸Fisher ChemicalA144-500
过氧化氢Fisher BioReagentsBP2633500
异丙醇BDH1174-4LPVWR
显微镜载玻片赛默飞世尔科技22-267-013
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-001
聚二甲基硅氧烷（PDMS）道康宁184 SIL ELAST KIT 0.5KG
电源是德科技E3630A
SeaKem LE 琼脂糖Lonza50004
氢氧化钠Fisher ChemicalS318-1
电磁阀组PneumadyneMSV10-1
电磁阀PneumadyneS10MM-30-12-3
旋涂仪劳雷尔科技WS-650Mz-23NPPB
SU8 显影液MicroChem 公司Y020100 4000L1PE
SU8-100MicroChem 公司Y131273 0500L1GL
SU8-5MicroChem 公司Y131252 0500L1GL
磺基-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）赛默飞世尔科技24510
硫酸EMD MilliporeMSX12445

参考文献

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