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方法文章

小鼠睾丸中高效鉴定蛋白结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法

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DOI：

10.3791/59681

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2019年5月10日

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1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种eCLIP实验方案，用于鉴定睾丸中RNA结合蛋白候选分子的主要RNA靶标。

摘要

精子发生定义了哺乳动物雄性生殖细胞分化的一个高度有序的过程。在睾丸中，转录与翻译过程是分离的，这凸显了由RNA结合蛋白（RBPs）协调的基因表达转录后调控的重要性。为了阐明RNA结合蛋白的作用机制，可采用交联免疫沉淀（CLIP）技术来捕获其内源性的直接RNA靶标，并确定实际的相互作用位点。增强型CLIP（eCLIP）是一种新开发的方法，相较于传统的CLIP技术具有多项优势。然而，迄今为止eCLIP的应用仅限于细胞系，亟需拓展其应用范围。在此，我们采用eCLIP技术研究了小鼠睾丸中的两种已知RNA结合解旋酶MOV10和MOV10L1。结果表明，MOV10主要结合于mRNA的3'非翻译区（UTRs），而MOV10L1则选择性地结合Piwi相互作用RNA（piRNA）前体转录本。我们的eCLIP方法可通过亚克隆的小规模测序快速确定不同RNA结合蛋白所结合的主要RNA种类，从而评估文库质量是否合格，以决定是否进行深度测序。本研究为eCLIP技术在哺乳动物睾丸组织中的应用奠定了可行的基础。

引言

哺乳动物睾丸是一个理想的发育模型，其中复杂的细胞分化程序呈周期性进行，以产生大量精子。该模型的独特价值在于，在精子发生过程中的某些阶段会出现转录失活现象，典型情况包括减数分裂性染色体失活（MSCI）的发生1,2，以及在精子形成过程中，圆形精子细胞经历剧烈的核压缩3。这些非连续性的转录事件需要转录后基因调控，而RNA结合蛋白（RBPs）在其中发挥关键作用，调控转录组并维持雄性生育力。

为了在体内鉴定单个RNA结合蛋白（RBP）的真实RNA靶标，研究人员开发了交联免疫沉淀（CLIP）方法4,5，该方法在常规RNA免疫沉淀（RIP）6,7的基础上进一步优化，引入了若干关键步骤，包括紫外（UV）交联、严格洗涤以及凝胶转膜，以提高信号特异性。CLIP技术与高通量测序相结合的进阶应用，已引起广泛关注，可用于在全基因组水平上分析蛋白-RNA相互作用8。除了遗传学研究外，这类能够鉴定内源性蛋白与RNA直接相互作用的生物化学方法，对于准确阐明RBP在RNA调控中的功能至关重要。例如，MOV10L1是一种睾丸特异表达的RNA解旋酶，对雄性生育力和Piwi相互作用RNA（piRNA）的生成至关重要9。其旁系同源蛋白MOV10则是一种广泛表达且具有多种功能的RNA解旋酶，在RNA生物学的多个方面发挥重要作用10,11,12,13,14,15,16,17,18。通过应用传统的CLIP-seq技术，我们发现MOV10L1可结合并调控初级piRNA前体，从而启动早期piRNA加工过程19,20，而MOV10则可在睾丸生殖细胞中结合mRNA的3'非翻译区（UTR）以及多种非编码RNA（数据未显示）。

然而，CLIP 最初是一种费力且依赖放射性的实验流程，随后进行测序文库构建时会导致大量的 CLIP 标签丢失。在传统的 CLIP 方法中，通过在 RNA 两端连接接头来构建 cDNA 文库。在蛋白质消化后，交联的短肽仍附着在 RNA 片段上。这种交联位点在 cDNA 合成过程中部分阻碍逆转录酶（RTase）的延伸，导致产生截短的 cDNA，这类产物约占 cDNA 文库总量的 80%21,22。因此，只有逆转录酶成功越过交联位点（通读）而生成的 cDNA 片段才能被测序。近年来，已发展出多种 CLIP 技术，如 PAR-CLIP、iCLIP、eCLIP 和 uvCLAP，用于鉴定活细胞中 RNA 结合蛋白（RBP）的交联位点。PAR-CLIP 采用 365 nm 紫外光照射并结合光活化核苷酸类似物，因此仅适用于培养中的活细胞；此外，核苷酸类似物掺入新合成的转录本中可能导致在 RNA 与蛋白质发生物理相互作用的区域产生偏倚23,24。在 iCLIP 中，仅在交联 RNA 片段的 3' 末端连接一个单一接头。逆转录（RT）后，通过分子内环化及重新线性化，再经聚合酶链式反应（PCR）扩增，可同时获得截短型和通读型的 cDNA25,26。然而，分子内环化的效率相对较低。尽管早期的 CLIP 方案需要使用放射性同位素标记交联 RNA，但紫外交联与亲和纯化技术（uvCLAP）通过严格的串联亲和纯化流程，无需依赖放射性标记27。然而，uvCLAP 仅限于可转染携带 3x FLAG-HBH 标签表达载体以进行串联亲和纯化的培养细胞。

在eCLIP中，首先在RNA的3'末端连接接头，随后进行逆转录（RT），接着以分子间模式在cDNA的3'末端连接接头。因此，eCLIP能够捕获所有截短和通读的cDNA28。此外，该方法在原理上既不受限于放射性标记，也不局限于使用细胞系，同时仍保持单核苷酸分辨率。

本文提供了一种适用于小鼠睾丸组织的eCLIP实验方案的逐步说明。简言之，该eCLIP流程起始于睾丸曲细精管的紫外交联，随后进行部分RNase消化，并利用特异性识别目标蛋白的抗体开展免疫沉淀。接着，对蛋白结合的RNA进行去磷酸化处理，并在其3'端连接接头序列。 经过蛋白质凝胶电泳及转膜后，通过切割预期大小范围的膜区域来分离RNA。逆转录（RT）完成后，在cDNA的3'端连接DNA接头，随后进行PCR扩增。在高通量测序前对亚克隆进行筛选，作为文库质量控制步骤。该方案能够高效鉴定RNA结合蛋白（RBP）所结合的主要RNA种类，以两种在睾丸中表达的RNA解旋酶MOV10L1和MOV10为例证。

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方案

所有动物实验均已获得南京医科大学委员会的批准。雄性C57BL/6小鼠在受控的光周期条件下饲养，并自由供应食物和水。

1. 组织收获与紫外交联

  1. 使用二氧化碳（CO2）对2只成年小鼠实施安乐死，持续1-2分钟或直至呼吸停止。随后对每只小鼠进行颈椎脱位。
  2. 从合适年龄的小鼠中采集约100 mg睾丸组织（本研究中为一只成年小鼠的睾丸），用于每次免疫沉淀实验，并将组织置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  3. 用一对尖头镊子轻轻去除白膜。
  4. 在组织研磨器中加入3 mL冰预冷的PBS，使用松配合玻璃研杵（A型玻璃研杵）通过轻柔的机械力研磨组织。
    注意：此步骤的目的并非裂解细胞，而是将组织分散开。保持细胞活力和完整性至关重要。
  5. 将组织悬液转移至细胞培养皿（直径10 cm），并加入冰预冷的PBS至总体积6 mL。
  6. 快速振荡培养皿，使液体均匀覆盖皿底。若组织研磨充分，可见均匀分布的曲细精管；若存在组织团块，则表明组织分散效果不理想。
  7. 将悬液置于冰上，于254 nm波长下以400 mJ/cm2剂量进行三次交联照射，每次照射之间充分混匀悬液。
    注意：每次新实验均应优化交联条件。
  8. 将悬液收集至15 mL锥形离心管中，在4 °C、1,200 × g条件下离心5分钟，弃上清液。将沉淀重悬于1 mL PBS中，转移至1.5 mL离心管，在4 °C、1,000 × g条件下离心2分钟，弃上清液。
  9. 此时可立即继续后续实验步骤，或将沉淀在液氮中速冻后于-80 °C保存备用。

2. 磁珠准备

  1. 每份样品（沉淀）加入 125 µL 蛋白 A 磁珠至新的离心管中。
    注意：针对小鼠抗体，请使用蛋白 G 磁珠。
  2. 将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。10 秒后吸除上清液。用 1 mL 冰冷裂解缓冲液洗涤磁珠两次。
    注意：后续蛋白 A 磁珠的分离均按此步骤进行。裂解缓冲液成分为：50 mM Tris-HCl，pH 7.5；100 mM NaCl；1% NP-40；0.1% SDS；0.5% 脱氧胆酸钠；1/50 体积的不含乙二胺四乙酸（EDTA）的蛋白酶抑制剂混合物（新鲜添加）。
  3. 将磁珠重悬于含 10 µg eCLIP 抗体的 100 µL 冷裂解缓冲液中。室温下旋转孵育 45 分钟。
    注意：免疫沉淀的最终抗体浓度为 10 µg/mL。若抗体浓度未知，应优化抗体使用量。
  4. 用 1 mL 冰冷裂解缓冲液洗涤磁珠两次。

3. 组织裂解与部分RNA消化

  1. 用1 mL冷裂解缓冲液重悬组织沉淀（向1 mL裂解缓冲液中加入22 µL 50倍浓度的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物和11 µL RNase抑制剂）。
    1. 每组实验分别重悬两个紫外交联沉淀和两个非交联沉淀：紫外交联-1沉淀用于eCLIP文库（UV-1）；紫外交联-2沉淀用于eCLIP文库（UV-2）；非交联-1沉淀作为对照用于eCLIP文库（non-UV）；非交联-2沉淀用于IgG免疫沉淀以验证抗体的特异性。
      注：对于紫外交联野生型睾丸的eCLIP文库，理想对照应为同窝小鼠的紫外交联基因敲除型睾丸。
  2. 将样品置于冰上裂解15分钟（以防止蛋白质和RNA降解）。
  3. 在数字超声仪中以10%振幅超声处理5分钟，工作30秒，间歇30秒。每次处理之间需将样品置于冰上，并用无核酸酶水清洗探头。
  4. 向每管中加入4 µL DNase，充分混匀。在37 °C孵育10分钟，以1,200 rpm振荡。
  5. 加入10 µL稀释后的RNase I（PBS中稀释至4 U/µL），充分混匀。在37 °C孵育5分钟，以1,200 rpm振荡。
  6. 在4 °C下以15,000 x g离心20分钟，澄清裂解液。
  7. 小心收集上清液。保留50 µL裂解液，并连同沉淀一起弃去。
  8. 保存输入样品用于RWB（用于Western blot检测）和RRI（用于RNA提取）。将UV-1、UV-2、non-UV和IgG样品各取20 µL（2%）作为RWB上样输入样品；将UV-1或UV-2样品取20 µL（2%）作为RRI上样输入样品。

4. 免疫沉淀

  1. 取1 mL裂解液（来自步骤3.7）加入珠子中（第2部分制备），在4 °C下旋转孵育样品2小时或过夜。
  2. 使用磁力架收集珠子，弃去上清液。用900 µL高盐缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5；1 M NaCl；1 mM EDTA；1% NP-40；0.1% SDS；0.5%脱氧胆酸钠）洗涤珠子两次，再用900 µL洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5；10 mM MgCl2；0.2% Tween-20）洗涤珠子两次。
    注意： 对于IgG样品，此处暂停操作，将珠子置于冰上保存在洗涤缓冲液中。
  3. 用500 µL 1×去磷酸化缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；5 mM MgCl2；100 mM KCl；0.02% Triton X-100）洗涤珠子一次。

5. RNA 3'末端的去磷酸化

  1. 使用磁力架收集磁珠，并弃去上清液。用细尖移液枪头去除残留液体。向每个样品中加入 100 µL 去磷酸化主混合液（10 µL 10× 去磷酸化缓冲液 [100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 50 mM MgCl2; 1 M KCl; 0.2% Triton X-100; 1 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA)]；78 µL 无核酸酶水；2 µL RNase 抑制剂；2 µL DNase；8 µL 碱性磷酸酶），在 37 °C 下孵育 15 分钟，以 1,200 rpm 振荡。
  2. 向每个样品中加入 300 µL 多核苷酸激酶（PNK）主混合液（60 µL 5× PNK pH 6.5 缓冲液 [350 mM Tris-HCl, pH 6.5; 50 mM MgCl2]；223 µL 无核酸酶水；5 µL RNase 抑制剂；2 µL DNase；7 µL PNK 酶；3 µL 0.1 M 二硫苏糖醇），在 37 °C 下孵育 20 分钟，以 1,200 rpm 振荡。
  3. 使用磁力架收集磁珠，并弃去上清液。用 500 µL 冷洗涤缓冲液洗涤磁珠一次，然后用 500 µL 冷高盐缓冲液洗涤一次。按此顺序重复洗涤一次。
  4. 用 500 µL 冷洗涤缓冲液洗涤磁珠一次，然后用 300 µL 冷 1× 连接缓冲液（不含二硫苏糖醇，50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM MgCl2）洗涤两次。

6. RNA 3'末端与RNA接头连接

  1. 弃去上清液，并用细尖移液器吸头去除残留液体。向每个样品中加入 25 µL 的 3' 连接主混合液。通过移液小心混匀。此步骤容易产生气泡。
    注意： 连接主混合液包含 3 µL 的 10x 连接缓冲液 [500 mM Tris-HCl，pH 7.5；100 mM MgCl2]；9 µL 无核酸酶水；0.4 µL RNase 抑制剂；0.3 µL 0.1 M ATP；0.8 µL 二甲基亚砜（DMSO）；9 µL 50% 聚乙二醇（PEG）8000；2.5 µL RNA 连接酶 [30 U/µL]。
  2. 向每个样品中加入 2.5 µL RNA 接头 X1A（表 1）和 2.5 µL RNA 接头 X1B（表 1）。通过移液或轻弹管壁小心混匀，并在 25 °C 下孵育 75 分钟，每 10 分钟轻弹混匀一次。
  3. 用 500 µL 冷洗涤缓冲液将磁珠洗涤一次（IgG 样品从此处继续）。
  4. 先用 500 µL 冷高盐缓冲液洗涤磁珠一次，再用 500 µL 冷洗涤缓冲液洗涤一次。重复此洗涤步骤一次。
  5. 将磁珠磁力分离，并用细尖移液器吸头去除残留液体。
  6. 将磁珠重悬于 100 µL 冷洗涤缓冲液中（IgG 样品在此暂停，置于冰上保存于洗涤缓冲液中）。取 20 µL 转移至新管中作为 RWB 样品。将剩余的 80 µL 磁力分离后作为 RRI 样品。弃去 RRI 样品的上清液，并将磁珠重悬于 20 µL 洗涤缓冲液中。
  7. 向 IgG 样品中加入 37.5 µL 4x 十二烷基硫酸锂（LDS）上样缓冲液和 15 µL 10x 样品还原剂。向（剩余的）样品中加入 7.5 µL 4x LDS 上样缓冲液和 3 µL 10x 样品还原剂。（不要通过移液混匀）。在 70 °C 下孵育 10 分钟，以 1,200 rpm 振荡。在冰上冷却 1 分钟，然后在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 1 分钟。

7. SDS-PAGE 和膜转移

  1. 上样凝胶。
    1. 对于RRI凝胶（4-12% Bis-Tris蛋白凝胶，10孔，1.5 mm），将离心管置于磁力架上，使蛋白洗脱液与磁珠分离。每孔上样30 µL。样品之间间隔预染蛋白分子量标准品。
    2. 对于RWB凝胶（4-12% Bis-Tris蛋白凝胶，10孔，1.5 mm），将离心管置于磁力架上，使蛋白洗脱液与磁珠分离。每孔上样15 µL。剩余样品保存于-20 °C作为备份。
  2. 在500 mL的1×SDS电泳缓冲液中加入500 µL抗氧化剂。在1×SDS电泳缓冲液中以200 V电压电泳50分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。
    注意： 抗氧化剂含有N,N-二甲基甲酰胺和亚硫酸氢钠，可随还原态蛋白迁移，防止甲硫氨酸和色氨酸等敏感氨基酸重新氧化。
  3. 在含有10%甲醇（体积比）的1×转移缓冲液中，以10 V电压将凝胶中的蛋白-RNA复合物转印至硝酸纤维素膜上，持续70分钟。用预冷的PBS冲洗RRI膜，用塑料膜包裹后于-80 °C保存。
  4. 将RWB膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭1小时。用TBST冲洗膜后，在4 °C下用一抗TBST溶液孵育过夜。用TBST洗涤两次，每次5分钟。在室温下用二抗（1:5,000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG）TBST溶液孵育1小时。再用TBST分别洗涤5分钟、10分钟和15分钟，共三次。
  5. 取等体积的化学发光（ECL）缓冲液A与缓冲液B混合，加入膜上并孵育1分钟。用塑料膜覆盖膜，在室温下曝光X光片2-3分钟，随后显影。
    注意： 过度曝光的X光片会清晰显示膜边缘的轮廓，据此可将X光片重新对准RWB膜。然后根据标记物的位置，将RWB膜与RRI膜对齐。从下至上依次为X光片、RWB膜和RRI膜。

8. RNA 提取

  1. 根据RWB膜和胶片的指示，从蛋白条带处向上切取至75 kDa（约220个核苷酸的RNA）的区域。
    注意：由于蛋白保护的RNA分子最大长度可能为225个碱基，每个碱基平均分子量约为340 Da，因此切取RBP条带以上约75 kDa的区域是合理的，以确保回收所有蛋白-RNA复合物。
  2. 将切下的膜片切成若干小片，放入一个新的1.5 mL离心管中。向膜片中加入200 µL蛋白酶K（PK）缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.5；50 mM NaCl；10 mM EDTA）和40 µL蛋白酶K。混匀后于37 °C孵育20分钟，以1,200 rpm振荡。
  3. 向每个样品中加入200 µL PK尿素缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.4；50 mM NaCl；10 mM EDTA；7 M尿素），于37 °C孵育20分钟，以1,200 rpm振荡。
  4. 向每个样品中加入400 µL酸性酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀后于37 °C孵育5分钟，以1,200 rpm振荡。
  5. 将2 mL相分离锁紧凝胶（PLG）重相管放入离心机，以15,000 × g离心25秒。
  6. 将除膜片外的所有内容物转移至PLG重相管中，于37 °C孵育5分钟，以1,200 rpm振荡。
  7. 在室温下以15,000 × g离心15分钟，将水相转移至新的15 mL锥形管中。
  8. 使用RNA纯化与浓缩柱提取RNA。
    1. 向每个样品（步骤8.7所得）中加入2倍体积（800 µL）的RNA结合缓冲液，混匀。再加入等体积（1200 µL）的100%乙醇，混匀。
    2. 取750 µL样品（来自步骤8.8.1）转移至收集管中的RNA纯化与浓缩柱中，以15,000 × g离心30秒，弃去穿流液。
    3. 重复步骤8.8.2，直至所有样品均通过柱子。向柱中加入400 µL RNA预洗缓冲液，以15,000 × g离心30秒；弃去穿流液。再加入700 µL RNA洗涤缓冲液，以15,000 × g离心30秒，弃去穿流液。
    4. 向柱中加入400 µL RNA洗涤缓冲液，以15,000 × g离心2分钟。小心将柱子转移至新的1.5 mL离心管中。向柱基质中加入10 µL无核酸酶水，静置2分钟，然后以15,000 × g离心30秒。将eCLIP样品储存于-80 °C，直至进行逆转录（步骤11.1）。

9. 输入RNA 3'末端的去磷酸化

  1. 向10 µL上样样本（来自步骤8.8.4）中加入15 µL去磷酸化主混合液（包含2.5 µL 10x去磷酸化缓冲液[100 mM Tris-HCl，pH 8.0；50 mM MgCl2；1 M KCl；0.2% Triton X-100；1 mg/mL BSA]；9.5 µL无核酸酶水；0.5 µL RNase抑制剂；2.5 µL碱性磷酸酶）。在37 °C孵育15分钟，以1,200 rpm振荡。
  2. 向样本中加入75 µL PNK主混合液（包含20 µL 5x PNK PH 6.5缓冲液[350 mM Tris-HCl，pH 6.5；50 mM MgCl2]；44 µL无核酸酶水；1 µL RNase抑制剂；2 µL DNase；7 µL PNK酶；1 µL 0.1 M二硫苏糖醇）。在37 °C孵育20分钟，以1,200 rpm振荡。
  3. 输入RNA的纯化
    1. 在管中重悬核酸提取磁珠（涡旋振荡超过30秒）。向每个新管中加入20 µL核酸提取磁珠。使用磁力架收集磁珠，并弃去上清液。
    2. 用1 mL RNA纯化裂解缓冲液（RLT缓冲液）洗涤磁珠一次。将管置于磁力架上30秒，弃去上清液。
      注意：后续核酸提取磁珠的分离均依照此步骤进行。
    3. 用300 µL RLT缓冲液重悬磁珠，并加入样本中。加入10 µL 5 M NaCl和615 µL 100%乙醇（EtOH），并通过移液混匀。室温旋转孵育15分钟。磁力分离磁珠后，移除上清液。
    4. 用1 mL 75% EtOH重悬磁珠，并转移至新管中。30秒后，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液。用75% EtOH洗涤两次，每次磁力分离磁珠后，用细尖移液器吸头去除残留液体。室温晾干5分钟（避免过度干燥）。
    5. 用10 µL无核酸酶水重悬磁珠，孵育5分钟。磁力分离磁珠后，将5 µL上清液转移至新管中（用于后续3'接头连接）。剩余RNA可作为备份储存于-80 °C。

10. RNA 接头连接至输入 RNA 的 3' 末端

  1. 向5 µL输入RNA（来自步骤9.3.5）中加入1.5 µL DMSO和0.5 µL RiL19接头（表1），在65 °C孵育2分钟，然后置于冰上超过1分钟。向每个样本中加入13.5 µL 3'连接主混合液，用移液器混匀，于25 °C孵育75分钟，每15分钟轻弹混匀一次。
    注意：连接主混合液包含：2 µL 10x连接缓冲液[500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM MgCl2; 10 mM二硫苏糖醇]；1.5 µL无核酸酶水；0.2 µL RNase抑制剂；0.2 µL 0.1 M ATP；0.3 µL DMSO；8 µL 50% PEG8000；1.3 µL RNA连接酶[30 U/µL]。
  2. 连接后输入RNA的纯化
    1. 将每个样本的20 µL核酸提取磁珠进行磁力分离，弃去上清液。用1 mL RLT缓冲液洗涤磁珠一次。
    2. 将磁珠重悬于61.6 µL RLT缓冲液中，并将悬液转移至各样本中。加入61.6 µL 100% EtOH。每5分钟用移液器混匀一次，持续15分钟。磁力分离磁珠后，弃去上清液。
    3. 重复步骤9.3.4。
    4. 用10 µL无核酸酶水重悬磁珠，静置5分钟。磁力分离磁珠后，将10 µL上清液转移至新管中。
      注意：此处可作为暂停点（输入样本可在-80 °C保存至次日）。

11. 逆转录及DNA接头连接至cDNA 3'末端

  1. 分别向10 µL输入RNA（来自步骤10.2.4）和10 µL CLIP RNA（来自步骤8.8.4）中加入0.5 µL RT引物（表1），在预热至65 °C的PCR仪中孵育2分钟，随后置于冰上超过1分钟。
  2. 向每个样品中加入10 µL RT预混液（2 µL RT缓冲液[500 mM Tris-HCl, pH 8.3; 750 mM KCl; 30 mM MgCl2]；4 µL无核酸酶水；0.3 µL RNase抑制剂；2 µL 0.1 M二硫苏糖醇；0.2 µL 0.1 M dATP；0.2 µL 0.1 M dCTP；0.2 µL 0.1 M dGTP；0.2 µL 0.1 M dTTP；0.9 µL逆转录酶），混匀后在预热的PCR仪中于55 °C孵育45分钟。
  3. 将20 µL逆转录反应产物与3.5 µL PCR产物纯化试剂混合，在37 °C孵育15分钟。
  4. 加入1 µL 0.5 M EDTA，用移液器吹打混匀；再加入3 µL 1 M NaOH，吹打混匀，并在PCR仪中于70 °C孵育12分钟以水解模板RNA。
  5. 加入3 µL 1 M HCl，用移液器吹打混匀以中和缓冲液。
  6. cDNA纯化
    1. 对每个样品磁性分离10 µL核酸提取磁珠，弃去上清液。用500 µL RLT缓冲液洗涤一次。
    2. 将磁珠重悬于93 µL RLT缓冲液中，转移悬浮液至样品中。加入111.6 µL 100% EtOH，孵育5分钟，每2分钟用移液器吹打混匀一次。使用磁力架收集磁珠并弃去上清液。用1 mL 80% EtOH重悬磁珠，并转移至新管中。
    3. 30秒后，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液。用80% EtOH洗涤两次。磁性分离后用细尖吸头吸除残留液体。室温晾干5分钟（避免过度干燥）。将磁珠重悬于5 µL 5 mM Tris-HCl中，孵育5分钟。
  7. 向磁珠中加入0.8 µL DNA接头（表1）和1 µL DMSO，在75 °C孵育2分钟。随后置于冰上超过1分钟。
  8. 配制12.8 µL连接预混液（2 µL 10×连接缓冲液[500 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM二硫苏糖醇]；1.1 µL无核酸酶水；0.2 µL 0.1 M ATP；9 µL 50% PEG8000；0.5 µL RNA连接酶[30 U/µL]），轻弹混匀，短暂离心，然后加入每个样品中，用移液器枪头缓慢搅拌混匀。
  9. 向每个样品中再加入1 µL RNA连接酶[30 U/µL]，轻弹混匀。在25 °C孵育30秒，以1,200 rpm振荡。随后在25 °C过夜孵育。每隔一小时轻轻弹击混合5至6次。
  10. 连接后cDNA纯化
    1. 对每个样品磁性分离5 µL核酸提取磁珠，弃去上清液。
    2. 用500 µL RLT缓冲液洗涤一次。
    3. 将磁珠重悬于60 µL RLT缓冲液中，转移悬浮液至每个样品中。加入60 µL 100% EtOH，孵育5分钟，每2分钟用移液器吹打混匀一次。磁性分离后弃去上清液。
    4. 重复步骤9.3.4。
    5. 用27 µL 10 mM Tris-HCl重悬磁珠，孵育5分钟。磁性分离后，将25 µL样品转移至新管中。在新管中将1 µL连接后的cDNA用9 µL无核酸酶水稀释。将剩余样品储存于-20 °C，直至步骤13.1使用。

12. 通过实时定量 PCR（qPCR）对 cDNA 进行定量

  1. 向96孔qPCR板中加入9 µL qPCR预混液（含5 µL 2x预混液、3.6 µL无核酸酶水、0.4 µL引物混合液[10 µM PCR-F-D50X 和 10 µM PCR-R-D70X]）。加入1 µL用H2O按1:10稀释的cDNA（来自步骤11.10.5），密封并混匀。
  2. 在热循环仪中运行qPCR程序：50 °C孵育2 min；95 °C孵育2 min；95 °C变性3 s，68 °C退火延伸30 s，共40个循环；然后95 °C 15 s，68 °C 60 s，再95 °C 15 s，1个循环。记录Ct（循环阈值）值。

13. cDNA 的 PCR 扩增

  1. 将35 µL PCR预混液（25 µL的2x PCR预混液；5 µL无核酸酶水；5 µL引物混合液[20 µM PCR-F-D50X和20 µM PCR-R-D70X]）加入8联管中。对于CLIP组，加入12.5 µL CLIP样品和2.5 µL H2O；对于input组，加入10 µL input样品和5 µL H2O。充分混匀后短暂离心。
  2. 运行PCR程序：98 °C下30 s；98 °C下15 s，68 °C下30 s，72 °C下40 s，进行6个循环；98 °C下15 s，72 °C下60 s，进行N个循环 = (qPCR Ct值-3)-6；72 °C下60 s；4 °C保存。
    注意：对于前几次CLIP实验，建议多增加1至2个PCR循环。

14. 凝胶纯化

  1. 将样品上样至3%高分辨率琼脂糖凝胶中，样品之间留出1个空孔，并在凝胶两侧使用DNA分子量标准。在1×Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液中以100 V电压电泳75分钟。
  2. 在蓝光照射下，使用新的剃须刀片为每个样品切取175–350 bp的凝胶条带，放入15 mL锥形管中。
    1. 称量凝胶条带，使用凝胶回收试剂盒进行DNA洗脱。
    2. 按每100 mg凝胶加入600 µL凝胶溶解缓冲液的比例加入6倍体积的凝胶溶解缓冲液以溶解凝胶。室温下溶解凝胶（每15分钟振荡混匀一次，直至凝胶完全溶解）。加入1个体积的100%异丙醇，充分混匀。
    3. 将750 µL样品（来自步骤14.2.2）转移至收集管中的离心柱内，在17,900 × g 条件下离心1分钟。弃去穿流液。
    4. 重复步骤14.2.3，直至所有样品均通过离心柱，然后用500 µL凝胶溶解缓冲液洗涤一次。
    5. 向离心柱中加入750 µL洗涤缓冲液（来自凝胶回收试剂盒），在17,900 × g 条件下离心1分钟。弃去穿流液，再在17,900 × g 条件下离心2分钟。将离心柱转移至新的1.5 mL离心管中。
    6. 彻底去除离心柱塑料紫色边缘残留的洗涤缓冲液，室温下晾干2分钟。向膜中心加入12.5 µL无核酸酶水，室温静置2分钟，然后在17,900 × g 条件下离心1分钟（为提高回收率，可重复洗脱步骤）。

15. PCR产物的TOPO克隆

  1. 配制TOPO克隆反应体系（1 µL 来自步骤14.2.6的PCR产物；1 µL 克隆混合液；3 µL 无菌水）。轻轻混匀，于20–37 °C孵育5分钟。冰上冷却。
  2. 将化学感受态E. coli细菌在冰上解冻。向100 µL感受态细菌中加入5 µL TOPO克隆产物29，轻轻充分混匀，冰上孵育30分钟。
  3. 42 °C热激60秒，随后冰上冷却2分钟。加入900 µL溶菌肉汤（LB）培养基，于37 °C、225 rpm振荡培养1小时。以1,000 × g离心1分钟，弃去900 µL上清液，重悬剩余液体。
  4. 将转化后的细菌涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL）的1.5% LB琼脂平板，37 °C过夜培养。
  5. 为每个构建体准备至少20个1.5 mL离心管。其中一组每管加入500 µL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基。用无菌枪头随机刮取单个细菌菌落，通过移液混匀于500 µL LB培养基中。于37 °C、225 rpm振荡培养5小时。
  6. 使用M13反向引物：CAGGAAACAGCTATGAC，通过Sanger测序法对插入片段进行测序30。

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结果

eCLIP 实验流程及结果如图所示 图1, 图2, 图3, 图4小鼠通过二氧化碳安乐死，随后使用手术剪在下腹部做一小切口。图2A,B）。小鼠睾丸被取出后去白膜，研磨后再进行紫外交联（图 2C-I）。在睾丸组织中使用两种已知的RNA结合解旋酶的代表性eCLIP结果如图所示 图3 和

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讨论

随着对RNA结合蛋白（RBPs）在生物学和病理学背景下普遍作用的深入理解，CLIP技术已被广泛用于揭示RBPs的分子功能20,32,33,34,35。本文所述方案代表了eCLIP方法在小鼠睾丸组织中的一种改进应用。

在睾丸组织中进行eCLIP实验的一个挑战是维持新鲜睾丸细胞的活性和完整性，这对于有效的交联同样至关重要。使用松散研杵施加温和的机械力研磨睾丸组织，可防止细胞裂解32,36。RNA的充分消化对于成功完成eCLIP检测也极为关键。RNA消化后的片段应具有更高的集中性，但长度小于20 bp的片段可通过文库测序读段的预处理步骤予以去除。为了...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Eric L Van Nostrand 和 Gene W Yeo 在原始实验方案中提供的有益指导。K.Z. 受到国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2016YFA0500902，2018YFC1003500），国家自然科学基金（31771653）。L.Y. 获国家自然科学基金（81471502，31871503）和江苏省创新创业计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
抗小鼠 MOV10  抗体Proteintech, 中国10370-1-AP
抗小鼠 MOV10L1 抗体Zheng et al.20109多克隆抗血清 UP2175由宾夕法尼亚大学 P. Jeremy Wang 实验室提供
HRP标记的山羊抗兔IgG ABclonalAS014
兔IgGBeyotime，中国A7016
设备
离心Eppendorf，德国汉堡5242R
数字超声波破碎仪BRANSON，美国BBV12081048A450 瓦特；50/60 赫兹
DynaMag-2 磁力架Invitrogen，美国12321D
迷你转印模块Invitrogen，美国B1000
小型凝胶电泳槽Invitrogen，美国A25977
摇床培养箱Eppendorf，德国汉堡Thermomixer comfort 
组织研磨器，DouncePYREX，美国1234F35仅  的 "松散" 本方案中使用研杵
专业标准 96 梯度德国 Biometra序列号：2604323
Tube Revolver 美国序列号：3406051
紫外光交联仪UVP，美国CL-1000
材料
TC处理的培养皿康宁，美国430167100 mm 
管子康宁，美国43079115 mL
微量离心管AXYGEN，美国MCT-150-C1.5 mL 
试剂 
酸性苯酚/氯仿/异戊醇 Solarbio，中国P101125:24:01
AffinityScript 酶Agilent，美国600107
抗氧化剂Invitrogen，美国NP0005
DH5α 感受态细菌美国赛默飞世尔科技公司18265017这些经济型细胞产生 >1 × 106 转化子/µ每50微克对照DNA µL反应。
DMSOSigma-Aldrich，美国D8418
DNA LadderInvitrogen，美国10416014
dNTPSigma-Aldrich，美国DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A Invitrogen，美国10002D
ECL 试剂Vazyme，中国E411-04
EDTAInvitrogen，美国AM9260G
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Roche，美国04693132001加入新鲜的
Exo-SAP-ITAffymetrix，美国78201PCR产物纯化试剂 
FastAP 酶美国赛默飞世尔科技公司EF0652
LDS 样品缓冲液美国赛默飞世尔科技公司NP0007
MetaPhor 琼脂糖 lonza，瑞士50180
MgCl₂2Invitrogen，美国AM9530G
MiniElute 凝胶回收QIAGEN，德国286044 ℃下柱储存；缓冲液QG = 胶溶解缓冲液；缓冲液PE = 洗涤缓冲液（步骤14）
MyONE 硅烷化磁珠Thermo Scientific，美国37002D核酸提取磁珠
NaClInvitrogen，美国AM9759
 
NP-40Amresco，美国M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris 蛋白凝胶Invitrogen，美国NP0336BOX4%–12%，1.5 mm，15孔
NuPAGE MOPS SDS 缓冲液试剂盒 Invitrogen，美国NP0050
PBSGibco，美国10010023
相锁定凝胶（PLG）重管  TIANGEN，中国WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master MixApplied Biosystems，美国A25742
蛋白酶KNEB，新英格兰 P8107S
Q5 PCR预混液 NEB，新英格兰 M0492L
RLT缓冲液德国 QIAGEN79216RNA纯化裂解缓冲液 
RNA 纯化 & 浓缩仪-5 柱 ZYMO RESEARCH，美国R1016RNA纯化与浓缩柱
RNase I Invitrogen，美国AM2295
RNase抑制剂Promega，美国N251B
RQ1 DNasePromega，美国M610A
样品还原剂Invitrogen，美国NP0009
SDS 溶液Invitrogen，美国1555302710%
脱氧胆酸钠Sigma-Aldrich，美国30970避光
T4 PNK酶NEB，新英格兰 M0201L
T4 RNA连接酶1高浓度NEB，新英格兰 M0437M
TA/Blunt-Zero 连接克隆混合液Vazyme，中国C601-01
TBEInvitrogen，美国AM9863
Tris-HCl缓冲液Invitrogen，美国15567027
Triton X-100Sangon Biotech，中国A600198 
Tween-20Sangon Biotech，中国A600560
尿素Sigma-Aldrich，美国U5378
X射线胶片Caresteam，加拿大6535876

参考文献

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CLIP RNA MOV10 MOV10L1 Piwi RNA 3
小鼠睾丸中高效鉴定蛋白结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法
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