本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。
本文内容
摘要
摘要
缺乏相关的体外神经模型是神经病理学医学进展的重要障碍。建立相关的细胞模型对于深入理解这些疾病的病理机制以及发现新的治疗靶点和策略至关重要。为了具有相关性，体外模型必须能够再现人类疾病的病理特征。然而，在神经退行性疾病的背景下，一个相关的体外模型还应提供神经细胞替代，作为一种有价值的治疗途径。
此类模型不仅可用于治疗性分子的筛选，还可用于优化神经分化方案（例如在帕金森病（PD）细胞移植治疗中的应用）。本研究描述了两种体外实验方案：1）在人源神经类器官（NO）中构建人源胶质母细胞瘤；2）生成三维（3D）类器官的多巴胺能（DA）神经元分化。为此，我们建立了一种高度标准化的实验流程，可由人胚胎干细胞（hESC）分化产生大小均一的神经球。第一种模型可用于揭示胶质母细胞瘤在神经类器官内发育过程中发生的分子与细胞事件；而DA类器官不仅可作为帕金森病细胞治疗中多巴胺能神经元的适宜来源，还可用于药物筛选测试。
引言
世界卫生组织（WHO）将星形细胞瘤分为低级别（I级至II级）和高级别（III级和IV级）。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种IV级星形细胞瘤，是所有原发性脑肿瘤中致死性最高的类型，对目前所有治疗手段均具有耐药性1。尽管标准治疗方案包括神经外科手术、化疗和放疗，GBM仍具有致命性，且过去15年中，患者的总体生存率在15个月左右并未发生显著改善2。为了在理解GBM发病机制方面取得重大进展，使用合适的模型至关重要。迄今为止，GBM的研究主要依赖于细胞系、啮齿类动物脑组织切片、将患者来源的细胞异种移植至小鼠体内，或使用可自发形成肿瘤的转基因小鼠模型3,4。尽管这些模型在研究脑转移和肿瘤侵袭性方面具有一定的价值，但其应用受到物种间差异的限制，由此得出的结论可能无法准确外推至人类组织。此外，现有的含有人类细胞的模型也因缺乏宿主组织与肿瘤之间的相互作用而受到局限3,4。实验模型对于从基础科学研究向治疗靶点转化至关重要。因此，描述一种在体外培养人源神经类器官并与胶质瘤起始细胞（GICs）共培养的实验方案，可提供一个能够模拟GBM发育过程中形态学和功能特征的相关系统。该系统可重现GBM在体内 的部分特征，例如肿瘤细胞的弥漫性迁移和坏死区域的形成，并能揭示与肿瘤生物学相关的基因表达变化。如先前研究所揭示的，某些关键的微小RNA（microRNA）在GICs于三维神经组织中发育过程中被诱导表达5,6。
帕金森病（PD）是一种主要的神经退行性疾病，与多种神经元亚型的变性相关7。尽管该疾病以症状的渐进性发展为特征（例如运动迟缓、非对称性静止性震颤、肌强直和姿势不稳），但其确切病因尚未明确。事实上，许多研究已表明，主要风险因素可能由遗传和环境因素共同作用所致。帕金森症状与黑质（substantia nigra, SN）中多巴胺能神经元的双侧变性相关，导致投射至纹状体的多巴胺能（DA）轴突消失8,9。因此，纹状体中多巴胺水平的降低与帕金森病患者运动功能障碍的进展呈正相关。多巴胺能神经元含有酪氨酸羟化酶（TH），该酶是儿茶酚胺类神经递质合成过程中的关键酶，可将氨基酸L-酪氨酸转化为L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA，即多巴胺前体），再进一步转化为多巴胺10。TH活性的早期丧失，继而出现TH蛋白表达下降，是帕金森病的典型特征。
本研究描述了两种利用人源神经类器官的实验方案，其中一种特别针对富含TH阳性细胞的中脑样表型。
方案
本方案遵循日内瓦大学人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 未分化人胚胎干细胞（hESCs）的维持与培养
- 通过使用特定细胞外基质预包被培养皿，在无饲养层条件下进行hSECs的维持和扩增。
- 在4 °C下解冻300 µL细胞外基质（典型浓度范围为18-22 mg/mL，解冻时置于冰上），并轻轻加入15 mL冷DMEM培养基中，以防止细胞外基质过早凝胶化。将7.5 mL细胞外基质分别加入两个T150培养瓶中。
- 将包被有细胞外基质的培养皿在37 °C孵育至少1小时（最长可过夜）。
- 移除培养基，并以6.5 × 104 个细胞/cm2的密度接种hESCs。
- 将H1（hESC细胞系）维持在hESC培养基中，并添加1%青霉素/链霉素。
- 采用酶法传代细胞：在37 °C条件下，于1-2分钟内向T75 cm2培养瓶中加入7.5 mL酶解溶液。待细胞完全脱落时，加入7.5 mL DMEM-F12培养基，随后在300 × g条件下离心5分钟。为提高细胞存活率，将细胞以所需密度重新接种至包被有细胞外基质的培养皿中，并在培养基中加入Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（10 µM），继续培养24小时。
2. 用于胶质母细胞瘤研究的人胚胎干细胞衍生神经类器官
- 开始三维培养前24小时，将hESC培养基更换为添加了10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基（这两种成分对于支持细胞存活以及在微孔板中聚集阶段自发形成神经球至关重要）。细胞汇合度应达到60%。第二天（第0天），将hESC集落消化为单细胞：移除培养基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤，加入5 mL酶解溶液，在37 °C孵育1-2分钟。
- 用含10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基收集细胞，并在300 x g条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于10 mL含10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基中并进行计数。
- 同时，用每孔2 mL无血清培养基冲洗微孔板，并在1200 x g条件下离心5分钟以去除所有气泡，防止气泡影响神经球的形成。
- 将28.2 × 106个细胞重悬于12.5 mL含10 µM ROCK抑制剂的无血清培养基中，按每微孔1000个细胞进行接种。在300 x g条件下离心5分钟，随后将微孔板置于37 °C培养箱中过夜（最长不超过36小时）。例如：若需获得30个人类神经类器官，可使用一个汇合度为70%-80%的T150培养瓶（约含3000万个细胞）。
- 第二天（第1天），用P1000移液器收集神经球并转移至6孔板中。每孔加入2 mL B27培养基与DMEM-F12 GlutaMAX及Neurobasal培养基的1:1混合液，并补充1% B27添加剂和1%非必需氨基酸（NEAA）。为促进快速神经诱导，需在培养基中添加双-SMAD抑制剂混合物，包括10 µM TGFβ/Activin/Nodal抑制剂和0.5 µM骨形态发生蛋白（BMP）抑制剂。从本步骤起，神经球需在旋转条件下培养（60 rpm，轨道摇床）。旋转培养至关重要，可防止神经球相互粘连或贴附于孔板。
- 每2-3天更换一次培养基：将孔板倾斜，使神经球沉降5分钟，移除一半培养基（2 mL），再加入2 mL新鲜的含生长因子和抑制剂的B27培养基。切勿对神经球进行离心。
- 按照以下时间进程进行神经诱导：
- 第1-4天，在含双-SMAD抑制剂的B27培养基中培养神经球。双-SMAD抑制剂混合物（10 µM TGFβ/Activin/Nodal抑制剂和0.5 µM BMP抑制剂）可促进神经诱导。
- 第4-11天，在含双-SMAD抑制剂混合物的B27培养基中添加10 ng/mL表皮生长因子（EGF）和10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），以促进由hESC衍生的神经玫瑰花环结构（位于神经球内）的增殖。
注：第11天时，大多数细胞应呈Nestin阳性。 - 第11-13天，在含0.5 µM BMP抑制剂的B27培养基中培养神经球。
- 第13-21天，在含10 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、10 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）和1 µM γ-分泌酶抑制剂的B27培养基中培养神经球。GDNF和BDNF可促进神经元和胶质细胞的分化，而γ-分泌酶抑制剂有助于提高神经成熟度。
- 第21天，将神经球（约1000个）接种于置于6孔板培养插件上的亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜（直径6 mm，孔径0.4 µm）上。自此步骤起停止旋转培养。在明场显微镜下观察到玫瑰花环结构的存在，表明神经分化已启动。神经玫瑰花环结构通常在神经球接种至PTFE膜后2-3天内可见。
- 此后三周的分化期间，每隔2-3天（通常为周一、周三、周五），在膜插件下方的每孔中加入1 mL含生长因子和抑制剂（如下所述）的B27培养基。
- 第21-25天，在相同的神经成熟培养基中培养人类神经类器官（参见步骤2.7.4）。
- 第25-28天，仅在B27培养基中补充1 µM γ-分泌酶抑制剂。
- 第28-39天，停止添加γ-分泌酶抑制剂，仅使用B27培养基继续培养人类神经类器官。
注：三周后，神经类器官即可用于GIC移植。在神经成熟过程中，可观察到未成熟神经标志物Nestin表达减少，而成熟神经标志物β3-微管蛋白和GFAP表达增加。
3. 胶质母细胞瘤起始细胞（GICs）的分离与培养
- 通过剪碎高级别人类胶质母细胞瘤（GBM）活检组织来分离GICs。将肿瘤组织块转移至含有0.25%胰蛋白酶和0.1 mM EDTA（4:1）的烧杯中，于37 °C缓慢搅拌消化30–60分钟（根据肿瘤大小决定）。
- 将解离的细胞接种于75 cm²培养瓶中2 组织培养瓶，接种密度为每平方厘米2,500-5,000个细胞2 在GIC培养基中：DMEM/F-12培养基（1:1），添加1% N2、1% B27和1% G5补充剂（以促进GIC存活），并补充bFGF和EGF（均为10 ng/mL，以维持干性）以及1%青霉素/链霉素。
- 一旦胶质瘤干细胞（GIC）稳定建立并开始增殖，从GIC培养基中去除N2和G5添加剂。
- 在将细胞接种到类器官前一天，消化GICs并进行计数。
- 用 2 mL GIC 培养基冲洗微孔板，并以最大速度离心以去除气泡（1000 × g） g）。将GICs以每微孔1,000个细胞的密度接种，以获得每个微孔一个胶质瘤球。在37 °C下孵育过夜（图1C）。此步骤至关重要，可确保获得校准良好的GICs（图中展示了坏死和过大的GICs示例 图2A,C).
- 为启动胶质母细胞瘤侵袭，使用大孔径移液器吸头将一个胶质瘤球体置于神经组织表面（图1F小心地将6孔板放回培养箱中。
4. 用于帕金森病研究的人胚胎干细胞衍生多巴胺能类器官
- 第0天：将人胚胎干细胞（hESCs）在二维培养中扩增至约60%汇合度（第0天），随后将维持hESCs多能性特征的干细胞培养基更换为无血清培养基。通过在培养基中添加0.5 µM BMP抑制剂和10 µM TGFβ/Activin/Nodal抑制剂（双-SMAD抑制剂组合）启动神经诱导，并加入10 µM ROCK抑制剂处理24小时，以提高细胞传代过程中的存活率。
- 第1天：在微孔板中每孔加入2.5 mL无血清培养基，并补充0.5 µM BMP抑制剂、10 µM TGFβ/Activin/Nodal抑制剂和10 µM ROCK抑制剂。为诱导细胞向神经管腹侧模式特化，额外添加100 ng/mL Sonic Hedgehog（SHH）、100 ng/mL成纤维细胞生长因子8（FGF8）和2 µM smoothened激动剂。将微孔板（仅含培养基，不含细胞）在1200 × g条件下离心5分钟，以去除微孔中的气泡。
- 在二维条件下进行神经诱导1天后，吸除培养基，并用不含Ca2+/MgCl2+的PBS快速洗涤。在T75 cm2培养瓶中加入7.5 mL重组酶溶液，将细胞集落消化为单细胞悬液。37 °C孵育2分钟，随后加入7.5 mL DMEM-F12终止消化。
- 收集细胞悬液，在300 × g条件下离心5分钟。弃上清，用配制微孔板所用的相同培养基重悬并计数细胞。
- 调整培养基体积，使细胞悬液浓度可形成每微孔含1000个细胞的神经球（例如，本实验所用微孔板每孔含4,700个微孔）。因此，将470万个细胞重悬于2.5 mL培养基中，加入此前已置于微孔板中的2.5 mL培养基中。
- 为使细胞均匀分布至各微孔，轻轻振荡微孔板，并在300 × g条件下离心5分钟。将微孔板置于37 °C培养24小时以形成神经球。
- 第2天：用培养基轻柔冲洗微孔，收集神经球并转移至经组织培养处理的六孔板中。更换为Neurobasal培养基，并补充1% B27、1× NEAA、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素。此外，继续添加区域化因子SHH、FGF8、smoothened激动剂以及双-SMAD抑制小分子。
- 将神经球置于37 °C旋转培养（60 rpm，轨道摇床），每2–3天更换一半新鲜补充因子的培养基。
- 第3天：为增强神经诱导并促使神经前体细胞获得中脑特征，向培养基中添加3 µM GSK-3β抑制剂，以激活Wnt/β-catenin信号通路。将GSK-3β抑制剂保留在培养基中直至第13天。将细胞分至两个新的经组织培养处理的六孔板中，以降低每孔神经球密度，避免神经球聚集。
注意：至第8天时，大多数细胞应呈Nestin阳性。 - 第8天：开始神经成熟阶段：将区域化因子SHH、FGF8、smoothened激动剂及双-SMAD抑制剂组合替换为0.5 mM二丁酰环磷酸腺苷（dibutyryl cAMP，促进成熟）、20 nM组蛋白去乙酰化酶抑制剂（促进细胞周期退出）、1 µM γ-分泌酶抑制剂以及生长因子，包括10 ng/mL GDNF、10 ng/mL BDNF、1 ng/mL转化生长因子β3（TGFβ3）和5 ng/mL FGF20（均有利于多巴胺前体细胞存活）。每2–3天更换一次培养基。
- 第21天：生成神经类器官：将约100个神经球接种于聚四氟乙烯（PTFE）膜（直径6 mm）上，置于气-液界面条件下。将膜转移至培养板插入物（0.4 mm）中，并加入1.2 mL此前所述用于神经球分化的神经成熟培养基。
- 从本步骤起停止旋转培养。每2–3天更换一次培养基，直至达到所需的分化时间点。
注意：在神经成熟过程中，可观察到神经未成熟标志物Nestin表达下降，成熟神经标志物β3-微管蛋白和GFAP表达上升。同时观察到TH和NURR1的高表达（图3C），证实神经类器官已成熟11。
- 从本步骤起停止旋转培养。每2–3天更换一次培养基，直至达到所需的分化时间点。
5. 多巴胺能分化验证中 TH 和 Nurr1 基因表达的定量分析
- RNA 提取：在指定的分化时间点，用 350 µL RLT 缓冲液（RNA 提取试剂盒提供）加入 3.5 µL 2-巯基乙醇裂解 40 个神经球。按照试剂盒说明书，使用 RNA 提取试剂盒从裂解后的神经球中提取 RNA。
- 测定总 RNA 浓度。
- 使用逆转录试剂盒对 300 ng 总 RNA 进行逆转录，用于定量实时聚合酶链式反应（qPCR），并遵循试剂盒说明书操作。
- 在基于不对称花青染料检测的实时 PCR 检测系统上进行 qPCR 分析。使用看家基因：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和延伸因子 1-α（EF1）对数据进行归一化处理。引物序列见表 1。
6. 高效液相色谱（HPLC）检测
- 采用高效液相色谱法（HPLC）结合电化学检测来检测多巴胺的存在。通过在4 °C条件下，将神经类器官在100 mL 0.1 N高氯酸（HClO4）中裂解15分钟（每5分钟剧烈涡旋一次）来提取多巴胺。离心后，收集上清液并储存在-20 °C，用于多巴胺定量分析。
- 使用C-18色谱柱（5 µm，4.6 mm × 150 mm），在等度洗脱模式下以1 mL/分钟的流速通过反相HPLC分离待测物。多巴胺的检测应采用库仑检测器，其中调节池的电位设定为+200 mV。
7. 使用微电极阵列（MEA）平台记录原始数据
- 使用解剖显微镜将神经球转移至多孔微电极阵列（MEA）装置的中心位置。
- 使用放大器和数据采集系统进行电生理记录。以5分钟记录期间电压的标准差作为信噪比（SNR），信号值取相同5分钟内记录到的动作电位峰-峰值电压的平均值。
结果
该方案的关键步骤必须明确识别并妥善处理。因此，图 1A 和 3A 分别展示了 NO 加 GBM 和 DA 神经类器官分化方案中各步骤的时间进程及所用化合物的培养条件示意图。图 1B、C、D、E、F 展示了细胞、球体及神经类器官，并呈现了每个步骤的典型形态。图 1G、H、I 展示了部分神经标志物的免疫荧光染色结果。
图1：人源神经类器官（NO） 分化方案。（A）由人胚胎干细胞（hESC）衍生神经类器官（NO）的标准化方案。（B）hESC在细胞外基质上，使用hESC培养基进行维持。（C）采用微孔板生成标准化的神经球。培养2周后，将神经球接种至含有聚四氟乙烯（PTFE）膜的插入式培养小室中（比例尺 = 50 µm）。（D）在6孔板的一个孔中，插入式培养小室内的NO宏观图像。在培养初期可观察到玫瑰花环样结构（黑色箭头）（E）。（F）NO顶部共培养胶质瘤干细胞球（GIC sphere）的宏观图像。（G-I）NO与GIC球共培养结构的免疫荧光分析（EGFR阳性；比例尺 = 50 µm）（G），以及单独NO的免疫荧光分析，显示其对神经元标志物βIII-微管蛋白呈免疫阳性，对巢蛋白（nestin）呈弱阳性；然而，突触素1（synapsin 1）信号较弱（H,I）（比例尺分别为100 µm和50 µm）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：坏死类球体与未成熟神经类器官（NO）示意图。 当培养孔中类球体数量过多或体积过大时，神经球 (A) 和神经类器官（NO）(B) 可能发生坏死 (C)（比例尺 = 10 µm）。(D) 携带番茄荧光报告基因的一种胶质瘤干细胞（GIC），可用于追踪肿瘤细胞在神经类器官中的侵袭行为（比例尺 = 10 µm）。未成熟神经类器官的示例，显示含有神经管结构 (E) 与不含神经管结构 (F) 的情况（比例尺 = 50 µm）。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：多巴胺能神经类器官的标准化制备流程及其电生理与形态学分析 。（A）多巴胺能神经类器官的标准化制备流程。（B）多巴胺能神经类器官的免疫荧光分析；TH免疫阳性细胞共表达中脑特异性标志物Nurr1（比例尺 = 50 µm）。数据以均值 ± 标准误表示（n = 3）。（C）图表表示通过qRT-PCR检测的TH和Nurr1基因表达动力学。（D）代表性高效液相色谱图：从多巴胺能神经类器官裂解液中通过HPLC检测到多巴胺峰（箭头所示）。（E）使用MEA平台记录的原始数据示例。每个尖峰由一条垂直线（时间戳）表示，其余信号为噪声。（F）置于MEA电极阵列上的神经球图像。（G）从原始数据中检测到的典型尖峰（蓝色和红色曲线）的叠加图。粗黑线表示对应红色曲线的平均值。（H）点阵图显示检测到的每个尖峰对应的时间戳，不同颜色代表不同电极。请点击此处查看该图的高清版本。
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 |
| Nurr1 | GGCTGAAGCCATGCCTTGT | GTGAGGTCCATGCTAAACTTGACA |
| TH | GCACCTTCGCGCAGTTCT | CCCGAACTCCACCGTGAA |
| EEF1 | AGCAAAAATGACCCACCAATG | GCCTGGATGGTTCAGGATA |
| GAPDH | GCACAAGAGGAAAGAGAGAGAACC | AGGGGAGATTCAGTGTGGGT |
表1：本方案中使用的引物。
讨论
该方案中最关键的环节之一是在细胞培养过程中维持hESC的多能性，并密切监测类球体及神经类器官的形态。hESC非常敏感，任何操作都可能导致过早的非可控性分化以及细胞死亡。为了提高实验的可重复性并避免异常核型事件的发生，建议在确认染色体稳定性后，于最低传代次数时将多批次hESC进行冻存。此外，建议每次实验均使用新复苏的细胞，并每天观察细胞的生长状态。如果类球体折光性降低且体积异常增大，则很可能开始发生聚集并出现死亡。
对该系统的一种改进是采用灌注方式或构建血管化系统（通过添加内皮细胞或在三维流体微芯片中实现）12,13。然而，控制神经类器官的厚度（≤300 µm）可实现氧气和营养物质的有效被动扩散，从而防止坏死。另一种改进是引入免疫细胞（小胶质细胞）。考虑到这些局限性，神经类器官结合GIC系统可能在多个方面具有重要意义。首先，该系统可用于药物筛选，以监测治疗化合物对类器官或肿瘤细胞的影响。其次，可研究细胞间的相互作用，并可视化和探索个体性与集体性侵袭背后的微环境决定因素5,6,13。
在帕金森病的研究背景下，富含多巴胺能神经元（DA神经元）的神经类器官可作为研究疾病发生发展的相关且精确的三维模型。在以往的研究中，已利用帕金森病患者来源的诱导性多能干细胞分化为DA神经元，以研究受累的神经元亚型。值得注意的是，已观察到一些与疾病相关的表型，例如α-突触核蛋白的积聚以及对氧化应激的敏感性14,15。此外，神经类器官还可作为筛选治疗性分子的工具。然而，需要建立特异且相关的检测指标，以评估DA神经元的存活率和功能状态，例如多巴胺的生成以及电生理活性。总体而言，本实验方案提供了两种标准化且精确的基于干细胞的方法，用于生成神经类器官。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者感谢瑞士日内瓦抗癌联盟（日内瓦，瑞士）、瑞士洛桑ISREC基金会以及美国德克萨斯州休斯顿克拉顿研究基金会提供的经费支持。此外，作者感谢HES-HO和怀斯中心提供的经费支持。我们感谢Krause实验室给予的有益讨论和支持，感谢Halah Kutaish博士对文稿的校对。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔板 (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
| ABI Prism 7900 HT 检测系统 (实时荧光定量PCR检测系统) | Applied Biosystems | 已停产 | |
| Aggrewell 400 (微孔培养板) | StemCell Technologies | 34421 | |
| 放大器 (W2100-HS32) (放大器) | Multi Channel Systems | ||
| 抗EGFR（磷酸化Y1101）抗体 | Abcam | ab76195 | 1/100 稀释 |
| 抗GFAP抗体 | Dako | Z334 | 1/1000 稀释 |
| 抗Nestin人源抗体 | Millipore | ABD69 | 1/400 稀释 |
| 抗Synapsin I 抗体 | Chemicon | AB1543P | 1/500 稀释 |
| B27添加剂 (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | 两种方案均使用，储存液为100倍浓度，终浓度为1倍 |
| 脑源性神经营养因子 (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | 两种方案均使用， 储存液为100 µg/mL 纯水溶液，终浓度为20 ng/mL |
| CHIR-99021 (GSK-3β 抑制剂) | Axon Medchem | ct99021 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为7.5 mM DMSO溶液，终浓度为3 µM |
| Compound E，一种 γ–分泌酶抑制剂 (γ–分泌酶抑制剂) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | 两种方案均使用（γ-分泌酶抑制剂XXI）， 储存液为5 mM DMSO溶液，终浓度为1 µM |
| Coulochem III (库仑检测器参数) | Thermo scientific | ||
| 二丁酰环磷酸腺苷 (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为0.5 M DMSO溶液，终浓度为0.5 mM |
| 纯二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | 化合物溶剂，可直接使用 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | 用于细胞培养，可直接使用 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基/F-12混合物 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | 用于细胞培养，可直接使用 |
| EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | 用于细胞培养，可直接使用 |
| 表皮生长因子 (EGF) | Gibco | PHG0313 | 用于GIC培养， 储存液为100 µg/mL 纯水溶液，终浓度为10 ng/mL |
| 成纤维细胞生长因子20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为100 µg/mL 纯水溶液，终浓度为5 ng/mL |
| 成纤维细胞生长因子8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为100 µg/mL 纯水溶液，终浓度为100 ng/mL |
| 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) | Gibco | PHG0024 | 用于GIC培养， 储存液为100 µg/mL 纯水溶液，终浓度为10 ng/mL |
| G5添加剂 (G5) | Invitrogen | 17503012 | 用于GIC培养，储存液为100倍浓度，终浓度为1倍 |
| 胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | 两种方案均使用， 储存液为100 µg/mL 纯水溶液，终浓度为20 ng/mL |
| 亲水性聚四氟乙烯 膜 (PTFE膜) | BioCell-Interface | 已停产 | |
| LDN-193189 (BMP抑制剂) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | 双重/Smad抑制， 储存液为5 mM DMSO溶液，终浓度为0.5 µM |
| L-谷氨酰胺 (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-谷氨酰胺 (200 mM)，储存液为200 mM，终浓度为2 mM |
| Matrigel (细胞外基质) | BD Biosciences | 354277 | 适用于hESC的基质，储存液浓度为18-22 mg/mL，终浓度为180-220 µg/mL |
| Millicell-CM 培养板插件 (0.4 µm) (培养板插件) | Millipore | PICM03050 | |
| 单克隆抗β-微管蛋白III抗体 | Sigma | T8660 | 1/1000 稀释 |
| MS轨道摇床，MS-NOR-30 (轨道摇床) | Major Science | MS-NRC-30 | |
| N2添加剂 (N2) | Invitrogen | 17502-048 | 用于GIC培养，储存液为100倍浓度，终浓度为1倍 |
| Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | 已停产 | |
| Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | 用于胚胎神经细胞群体的维持与成熟 ，可直接使用 |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | Gibco | 11140 | 非必需氨基酸100X，储存液为100倍浓度，终浓度为1倍 |
| Nurr1抗体 (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 稀释 |
| Nutristem (hESC培养基) | Biological Industries | 05-100-1A | 干细胞培养基，可直接使用 |
| 青霉素/链霉素 (Penicilin / Streptomycin) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | 用于细胞培养，储存液为5 mg/mL，终浓度为50 µg/mL |
| 0.1N高氯酸 (HCLO4) | Merck | 100519 | 用于HPLC，可直接使用 |
| 不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸盐缓冲液 (PBS without Ca²⁺/Mg²⁺) | Life Technologies | 14190250 | 用于细胞培养，可直接使用 |
| PrimeScript RT-PCR试剂盒 (逆转录试剂盒) | Takara | RR014A | |
| 普莫菲明 (smoothened激动剂) | Calbiochem | SML0868 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为10 mM DMSO溶液，终浓度为2 µM |
| Rho相关激酶Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | ROCK抑制剂， 储存液为50 mM DMSO溶液，终浓度为10 µM |
| RNeasy小型试剂盒 (RNA提取试剂盒) | Qiagen | 74104 | |
| SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal抑制剂) | Ascent | Asc- 163 | 双重Smad抑制， 储存液为50 mM DMSO溶液，终浓度为10 µM |
| 音猬因子 (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为100 µg/mL 纯水溶液，终浓度为100 ng/mL |
| StemPro Accutase (hESC酶解液) | Gibco | A11105-01 | hESC酶解液，可直接使用 |
| Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (反相色谱柱) | Waters Corporation | ||
| T150培养瓶 (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
| TH抗体 (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 稀释 |
| 转化生长因子β3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为100 µg/mL 纯乙醇溶液，终浓度为1 ng/mL |
| 曲古抑菌素A (组蛋白去乙酰化酶抑制剂) | Sigma | T8552 | 用于多巴胺能分化方案， 储存液为100 µM DMSO溶液，终浓度为20 nM |
| TrypLE (重组酶解液) | Invitrogen | 12604021 | 重组酶解液，可直接使用 |
| 0.25%胰蛋白酶 (酶解液) | Life Technologies | 15050065 | 酶解液，可直接使用 |
| W2100, Multi Channel Systems (数据采集系统) | WAT045905 | ||
| X-vivo (无血清培养基) | Lonza | BE04-743Q | 无血清培养基，可直接使用 |
参考文献
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