本报告介绍了用于免疫组织化学（IHC）的冷冻小鼠视网膜切片制备的全面方法。所述方法包括眼球后杯的解剖、多聚甲醛固定、在最佳切割温度（OCT）包埋剂中包埋及组织定位、切片以及免疫染色。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
制备高质量的小鼠眼球切片用于免疫组织化学（IHC）分析，对于评估视网膜结构与功能以及阐明视网膜疾病的发生机制至关重要。在整个组织制备过程中维持结构完整性，是获得可重复的视网膜IHC数据的关键，但由于视网膜细胞结构的脆弱性和复杂性，这一过程具有挑战性。强效固定剂（如10%甲醛或Bouin液）虽能理想地保存视网膜结构，但常因增强背景荧光和/或削弱抗体与抗原表位的结合（即表位掩蔽）而妨碍IHC分析。而使用较温和的固定剂（如4%多聚甲醛）可减少背景荧光和表位掩蔽，但必须采用精细的解剖技术以保持视网膜结构完整。本文介绍一种全面的小鼠眼后段杯状组织制备方法，适用于IHC分析，可在不破坏视网膜结构完整性的前提下，充分保留大多数抗体-抗原表位的结合。我们提供了针对多种视网膜细胞类型标志物的代表性IHC结果，以展示在最佳与非最佳条件下组织的保存状况和定位方向。本研究的目标是通过提供从眼后段杯状组织解剖到IHC染色的完整实验方案，优化视网膜的IHC研究。
引言
免疫组织化学（IHC）是一种强大的技术，可用于原位定位组织中特定的蛋白质和细胞结构1,2,3。不恰当的固定方法以及对复杂组织进行次优切片可能会破坏组织结构，导致背景染色过高或削弱抗体与抗原表位的相互作用，从而产生染色假象，并引发对IHC数据的错误解读4。脊椎动物的视网膜是一种结构复杂且高度有序的神经器官，由相互连接的光感受器、中间神经元和节细胞分层构成，因此非常脆弱，在解剖和切片过程中极易受损。从鼠眼解剖与定位到免疫染色的详细、标准化且经过验证的操作流程，将显著减少IHC染色假象，提高实验结果的可靠性，并有助于更准确地进行数据比较分析。
组织免疫组化（IHC）制备有多种方案，但并非所有方法均适用于视网膜组织。强效固定剂（如10%福尔马林或Bouin液）可在解剖和切片过程中较好地保存视网膜结构5。然而，强效固定剂常因对抗原表位的化学修饰而导致背景荧光增强和表位遮蔽6。相比之下，较温和的固定剂（如4%多聚甲醛（PFA））可减轻部分此类人工假象，但需要精细的解剖和切片操作以维持最佳的视网膜结构。PFA可快速渗透组织，但蛋白质交联速度较慢，从而降低表位遮蔽的风险。由于短时间PFA孵育属于相对温和的固定方式，组织通常需要迅速冷冻以保存抗原。在组织冷冻过程中应避免冰晶形成，因为冰晶会扭曲并破坏细胞和组织的完整性7。
本文详细描述了小鼠眼球后杯的解剖、固定和冷冻保护的标准化操作流程，可获得一致且可靠的免疫组织化学（IHC）数据。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有方法均严格遵循国家卫生研究院实验室动物资源研究所发布的《实验动物护理和使用指南》中的建议，并已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。
方法所用的全部工具和设备如图1所示，并在材料表中列出。
1 . 小鼠眼球摘除、眼球杯解剖及包埋
- 使用二氧化碳（CO2）处死小鼠，随后对出生后0至11天（P0–P11）的小鼠进行断头处理，或对出生后大于11天（>P11）的成年小鼠进行颈椎脱位。对于P0–P14阶段的小鼠，眼睛被皮肤覆盖，需确保在后续操作前将皮肤完全去除。
- 使用尾部电灼器轻微灼烧角膜，以标记眼球的颞侧部位（图2A）。操作时应极轻地接触角膜，持续时间不超过瞬间，避免在角膜上灼烧出孔洞。
- 立即使用弯头Dumont #5/45镊子摘除小鼠眼球。将眼球置于含1 mL 4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于1.5 mL冻存管内冰上固定15分钟。
- 经4% PFA固定15分钟后，使用弯头Dumont #5/45镊子将眼球转移至盛有PBS的改良35 mm解剖皿中（见材料表和图1C），并置于体视显微镜下。
- 使用微型刀具在灼烧标记处作一小切口，切口方向垂直于角膜缘（角膜边界），并略高于角膜缘。
- 将弯头剪刀插入切口，沿角膜缘对角膜进行环形切割（图2B）。
- 移除角膜，并用细头Dumont #5镊子取出晶状体（图2B），轻柔地将其从眼球后部提起。玻璃体（填充于晶状体与视网膜之间透明的凝胶状物质）将随晶状体一同被取出（图2B），此时视网膜将暴露为覆盖在眼球后杯状结构内表面的白色区域。需确保视网膜无可见损伤，如孔洞或撕裂（图2C）。
- 将眼球杯状结构在1 mL PBS中室温洗涤两次，每次10分钟。
- 将眼球杯状结构置于含15%蔗糖的PBS溶液中，4 °C条件下过夜平衡，直至组织沉底，以实现冷冻保护。
- 将眼球杯状结构转移至含30%蔗糖的PBS溶液中，于4 °C孵育2–3小时，直至组织沉底。
- 将眼球杯状结构包埋于OCT包埋剂中，置于10 × 10 mm的冷冻模具内（图3A）。在体视显微镜下，沿眼球的背腹轴方向调整其在模具中的位置（图2D、图3A），旋转眼球使灼烧标记位于上方，视神经位于左侧，模具的开口部分朝向右侧（图2D）。操作时注意避免组织周围产生气泡。
注：操作眼球杯状结构时，建议使用由钛丝连接移液器吸头制成的钛探针。 - 为快速冷冻视网膜组织，将冷冻模具浸入盛有异戊烷的金属杯中至少5分钟，并将金属杯置于液氮或干冰/100%乙醇浴中（液面高度不超过金属杯高度的1/3）。
注：冷冻模具应浸入异戊烷中超过其高度的一半，但无需完全浸没。 - 取出冷冻组织块，并用铝箔包裹。
- 于-80 °C保存。
- 使用记号笔在冷冻组织块上标记，以记录其方向（图3B）。
2 . 使用冷冻切片机进行切片
- 调节恒冷切片机温度（-20 至 -25 °C）后，将含有包埋眼杯的模具置于恒冷切片机中，平衡至该温度约 1 小时。
- 安装组织块时保持背腹方向（图 3C），连续切片，厚度为 10 µm。小心地将视网膜切片贴附于已标注并编号的载玻片上。
- 将载玻片存放在 -20 °C 或 -80 °C 的玻片盒中，直至进行免疫组化（IHC）操作。
3 . 使用载片架进行荧光免疫染色
注意：载玻片架系统（例如 Sequenza）通过盖板固定玻璃显微镜载玻片，从而在载玻片与盖板之间形成约 100 µL 的毛细间隙。
- 在室温下解冻冷冻切片2至4小时，使其干燥并附着于显微镜载玻片上。
注意：也可在 30–37 °C 下干燥 30 分钟至 1 小时。 - 将载玻片放入载玻片架中，用100–200 µL PBS洗涤视网膜切片，每次2分钟，共洗涤两次。
- 用含 0.25% Triton-X 和 0.05% NaN3 的溶液孵育视网膜切片以进行透化处理3在室温下用 PBS 洗涤 5 分钟。
- 加入100 µL封闭液至载玻片上。
- 向切片中加入100 µL用封闭液稀释的一抗。
- 4 ˚C 下孵育视网膜切片过夜。
注意：在此期间，应盖住载片架，以避免切片干燥。 - 用 200 µL PBS 洗涤视网膜切片，每次 15 分钟，共洗涤 3 次。
注意：在 PBS 中加入 0.001–0.002% 的 Triton-X100（即 PBS-T）可实现更严格的洗涤，但可能破坏某些膜结构和细胞结构。 - 将视网膜切片在荧光标记的二抗中室温孵育1小时。此后步骤均需避光。
- 将视网膜切片洗涤3次，每次15分钟。
- 在室温下用 Hoechst 33342 或 DAPI 溶液等核标记物孵育视网膜切片 5 分钟。
- 将视网膜切片洗涤1次，每次15分钟。
- 将盖玻片放置在实验台上的纸巾上。
- 在盖玻片中央加入2滴抗荧光淬灭封片剂。
- 将切片翻转，使视网膜冷冻切片朝下。
- 以约45˚角将盖玻片缓慢倾斜地放置在封片剂上，小心地完成封片。
注意：放置盖玻片时应避免产生气泡。 - 使用厚重的书籍或目录（见下文）对载玻片和盖玻片组合施加均匀压力，以去除多余的封片介质。
注意：为确保样本制备的一致性，在载玻片封片过程中，应始终使用同一物体（例如同一本书或目录）对盖玻片施加均匀压力。 - 保持平放，于室温避光条件下静置过夜使其硬化。将载玻片平放于4 °C长期保存。
- 通过宽场或共聚焦荧光显微镜成像（图 4).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为了说明这些方案如何确保免疫组化（IHC）中视网膜的最佳保存效果，我们使用针对视紫红质（rhodopsin，一种光感受器标志物）8、谷氨酸脱羧酶65（Gad65，一种无长突细胞标志物）9、谷氨酰胺合成酶（GS，一种 Müller 细胞标志物）10 和钙结合蛋白（calbindin，一种水平细胞标志物）11 的抗体，对 P28 野生型小鼠（C57BL/6N）的视网膜切片进行了检测（图4）。免疫组化结果显示，我们的方案 consistently 获得高质量且保存良好的视网膜切片。值得注意的是，富含视紫红质的内节和外节保持垂直且完整，与上方的视网膜色素上皮层（RPE）几乎无分离（图4A）。此外，Müller 细胞保存良好，其胞体排列整齐，胞质突起从神经节细胞层（GCL）延...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于小鼠眼睛体积小、形状特殊以及视网膜组织脆弱，小鼠视网膜解剖是一项精细的操作。尽管高质量的解剖操作需要经验积累，但制定详细的实验方案并提供高效的实验方法与技巧，对于获得适用于免疫组化（IHC）的视网膜切片至关重要。除本文所述的实验步骤外，还有一些关键技巧可帮助稳定地制备高质量视网膜切片，从而实现可重复的免疫组化结果。
在开始解剖之前，应确保操作者处于舒适、放松的状态，并将房间的照明调节至适合小鼠眼球显微解剖的最佳视觉条件。为了在解剖过程中维持小鼠眼杯的形态，建议将眼球置于经特制蜡涂层处理的解剖皿中的磷酸盐缓冲液（PBS）下进行操作。我们建议使用浅粉色牙科蜡对直径35 mm的解剖皿进行涂层处理（图1C）。实际上，浅粉色牙科蜡能提供足够的对比度，便于在解剖显微镜下清晰观察眼球结构；而通过将微量离心管底部压入蜡中形成的眼球大小的凹槽，可在解剖过程中固定眼杯位置，同时允许解剖工具围绕眼杯进行适当旋转。此外，在移除晶状体时，应尽可能彻底清除眼杯中的玻璃体液，因为残留的玻璃体液在组织包埋冷冻步骤中容易形成破坏组织的冰晶。通常我们使用...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：RO1-GMO97327）和宾夕法尼亚大学研究基金会（UPenn）的资金支持。我们特别感谢Svetlana Savina在免疫组织化学实验方案开发中的帮助，感谢Gordon Ruthel（宾夕法尼亚大学）以及宾夕法尼亚大学兽医学院影像核心设施在显微成像方面的协助，同时感谢Leslie King博士对本文稿的审阅与宝贵意见。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6夸脱不锈钢烧杯（185 × 218 mm） | Gilson | #MA-48 | 对于液氮（图1E） |
| 铝箔 | |||
| 电灼器 | Bovie | #AA01 | 标记眼睛方位（图1A） |
| 弯头镊子，Dumont #5/45 镊子，45度弯曲 | 电子显微镜科学公司 | #72703-D | 用于小鼠眼球摘除与维持（图1A） |
| 弯头剪刀，Vannas弹簧剪 - 2.5毫米刃口 | Fine Science Tools | #15002-08 | 环形切割角膜（图1B） |
| 牙科蜡涂层35毫米解剖皿 | 用于眼杯解剖（图1C） | ||
| 解剖显微镜 | Leica，休斯顿，美国 | MZ12.5 高性能体视显微镜 | |
| 微型刀具 - 塑料手柄 | Fine Science Tools | #10315-12 | 在烧伤标记处做一个小切口（图1A） |
| 粉红色牙科蜡 | 电子显微镜科学公司 | #72660 | 用于包被解剖皿 |
| 载玻片架和盖板 | Ted Pella | #36107 | 用于视网膜免疫组化（图1G） |
| 不锈钢烧杯（89 × 114 mm） | Gilson | #MA-40 | 用于异戊烷浴（图1E） |
| 泡沫箱 | 用于保温冷藏箱 | ||
| 精细镊子 Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | 去除角膜并提取晶状体（图1B） |
| Tissue-Tek 冷冻模具 （10 mm × 10 mm × 5 mm） | 电子显微镜科学 | #62534-10 | OCT包埋模具 |
| <强>缓冲液与试剂 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| 封闭液 | 2% 正常马血清，1.5% 冷鱼皮明胶（溶于 H2O，浓度 40-50%，货号 #G7765），5% 牛血清白蛋白（货号 #AK1391-0100），溶于通透缓冲液中。 | ||
| Gelvatol（抗荧光淬灭封片剂） | 在通风橱中，将 0.337 g DABCO（Sigma 货号 #D2522-25G）溶解于 10 mL Fluoromount G（Fisher 货号 #OB100-01）中。 用12 N HCl调节pH至8-8.5（约5滴）。 储存在4℃的棕色滴瓶中°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000倍储存液 | 赛默飞世尔科技 | #62249 | 1 mg/ml（PBS 中，1000 倍浓缩液）。分装后避光保存于 4 ℃°C可保存长达1年或在-20°长期储存请置于 C。使用前新鲜配制 在 1 ug/mL（1x）条件下 |
| 异戊烷，99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| 液氮 | |||
| PBS中的多聚甲醛（PFA） | 电子显微镜科学公司 | #15710 | 现配4% PFA，由16% PFA储备液稀释而成。将剩余的16% PFA储存在4℃°暗处的 C。 |
| 透化溶液 | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO 货号 #0694-1L) + 0.05% NaN3 现配现用。 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl，0.02 g/L KH2PO4，0.8 g/L NaCl，0.216 g/L Na2HPO4，pH 7.4 由10倍浓度储备液配制 |
| 蔗糖溶液 | Fisher Scientific | #S-5-500 | 溶解适量蔗糖于 37°C PBS（溶解约需15分钟）。可在4℃保存数天。°C. |
| Tissue-Tek OCT包埋剂 | 樱花 | #4583 | |
| <强>抗体 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| 抗钙结合蛋白 | Sigma-Aldrich | C8666 | 标记水平细胞 |
| 抗GAD65 | Chemicon | AB5082 | 标记GABA能无长突细胞 |
| 抗GS | BD 转导 | 610517 | 对M进行标记üller细胞 |
| 抗视紫红质 | Millipore | MAB5316 | 标记杆状物 |
参考文献
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
