利用离体肠系膜动脉评估血管张力反应性：重点关注血管周围脂肪组织的调节作用

摘要

本方案描述了利用导丝肌动图技术评估从小鼠分离的肠系膜动脉的透壁等长张力的方法，特别关注内皮细胞和血管周围脂肪组织释放因子的调节作用。

摘要

血管张力对病理生理刺激的反应性改变，参与了多种心血管和代谢性疾病的发生发展。内皮功能障碍是导致动脉舒张功能减弱和收缩反应增强的主要原因。包绕在动脉周围的脂肪组织在调控血管内皮依赖性舒张和/或血管平滑肌细胞收缩中发挥重要作用。内皮细胞与血管周围脂肪组织之间的相互作用，可通过离体血管环张力测定系统（wire myography）对固定后的血管进行评估。然而，对于来自不同物种、年龄、遗传背景和/或处于不同病理生理状态动物的动脉，需建立相应的最佳实验条件。

引言

动脉的扩张和收缩分别由其血管平滑肌细胞的舒张和收缩实现。小动脉血管反应性的改变通过自主神经和血液中存在的激素（如儿茶酚胺、血管紧张素II、5-羟色胺、血管加压素）参与动脉血压的稳态调节。在局部水平，平滑肌细胞的血管反应受到来自内膜内皮细胞以及动脉周围脂肪组织信号的调节（图1）。

内皮不仅是一种被动屏障，还作为血液与深层血管平滑肌细胞之间传递信号的界面。通过释放多种血管活性物质，内皮在局部调控血管张力反应中发挥关键作用¹。例如，当受到乙酰胆碱刺激时，内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）被激活，产生一氧化氮（NO），NO通过激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）引起深层血管平滑肌的舒张²。其他血管活性物质包括环氧化酶的产物（如前列环素和血栓素A₂）、脂氧合酶的产物（如12-羟基二十碳四烯酸，12-HETE）、细胞色素P450单加氧酶的产物（HETEs和环氧二十碳三烯酸，EETs）、活性氧（ROS）、血管活性肽（如内皮素-1和血管紧张素II）以及内皮源性超极化因子（EDHF）³。内皮源性血管舒张因子与血管收缩因子之间的精细平衡维持着局部血管运动张力^4,5。

内皮功能障碍的特征是内皮依赖性血管舒张功能受损⁶，这是血管老化的一个标志性表现⁷。随着年龄增长，内皮促进血管舒张的能力逐渐下降，这主要归因于一氧化氮（NO）生物利用度降低，以及内皮细胞中eNOS和血管平滑肌细胞中sGC的异常表达与功能^8,9,10。NO生物利用度降低会增强内皮依赖性血管收缩因子的生成^11,12。在老化动脉中，内皮功能障碍导致中膜增生，表现为管壁厚度增加和中膜细胞核数量显著增多，这些变化类似于临床上高血压和动脉粥样硬化患者所观察到的动脉增厚现象^13,14。此外，肥胖、糖尿病或高血压等病理生理状态会加速内皮功能障碍的发展^15,16。

血管周围脂肪组织（PVAT）可释放多种脂肪因子以调节血管结构和功能¹⁷。PVAT的抗收缩作用由多种舒张因子介导，例如脂联素、一氧化氮（NO）、过氧化氢和硫化氢^18,19,20。然而，根据解剖位置和病理生理状态的不同，PVAT也可能在多种动脉中增强收缩反应 ²¹。PVAT产生的促收缩物质包括血管紧张素II、瘦素、抵抗素和活性氧（ROS）^22,23。  在大多数离体血管研究中，PVAT通常被视为血管结构的简单支撑组织，因此在制备血管环段时被去除。由于脂肪组织功能障碍是高血压及相关心血管并发症的独立危险因素²⁴，因此在研究不同动脉的血管反应性时，应考虑血管周围的PVAT。

多丝肌动图系统已被广泛用于研究多种血管的血管运动功能，包括主动脉、肠系膜动脉、肾动脉、股动脉、脑动脉和冠状动脉^25,26。本文所述方案将采用丝状肌动图技术，评估从基因修饰小鼠模型中分离出的肠系膜动脉的血管反应性，并特别关注血管周围脂肪组织（PVAT）的调节作用。

方案

本研究使用的所有动物均由香港大学医学院实验动物部提供。实验已获得实验室动物使用教学与研究委员会（CULATR，编号：4085-16）的伦理批准。

1. 准备工作

1. 药物的制备
   1. 根据材料安全数据表（MSDS）的要求，在收到药物后立即进行适当储存。将粉末状药物溶解于溶剂中，配制成高浓度储备液，分装后于 -20 °C 保存。
      注意：大多数药物使用蒸馏水溶解以配制储备液；某些药物可能需要加热或超声处理才能完全溶解。若药物在水中无法完全溶解，可加入一滴1 M NaOH溶液；对于碱性药物，可加入一滴1 M HCl溶液。疏水性药物可用二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇溶解。在后两种情况下，应明确最终浴液中的溶剂浓度（单位为M），并设置相应的对照实验，以排除溶剂对实验结果的影响。
   2. 实验前，将药物等分试样溶解（材料表)置于含有 115 mM NaCl、4.6 mM KCl、2.5 mM CaCl₂ 的克雷布斯-林格碳酸氢盐溶液（Krebs）中₂，1.17 mM MgSO₄₄，1.17 mM KH₂PO₄，25 mM NaHCO₃_3, 11.1 mM D-葡萄糖和 0.01 mM EDTA，pH 7.4。
   3. 对于累积浓度-反应曲线，通过连续稀释法配制不同药物的储备液和工作液（表1).
2. 设置仪器
   1. 每次使用肌动图系统前，或系统每次移动后，均需对所有通道的力传感器进行校准。
      注意：详细的校准步骤因型号而异。通常情况下，将一个2克的砝码施加于钳口上，对应的力值应为9.81 ± 0.1 mN。如果读数偏差超过0.1 mN，则应重新校准传感器。对于本实验方案中所使用的系统（见下文） 材料表校准过程中，力传感器的工作值应在3000至3500之间。若传感器数值高于或低于此范围，则必须更换力传感器。
   2. 调节并校准每个腔室中的固定支架。肌动描记器腔室的持续和重复使用可能导致固定支架出现轻微错位，因此在实验前需偶尔进行调整，以确保夹具对齐正确。
      注意：调整安装支架时需格外小心，因为力传感器非常敏感且易损。
   3. 打开加热器和气体（95% O₂₂ 和5% CO₂实验前至少30分钟将腔室和缓冲液预热至37 ± 0.1 °C，并用气体混合物平衡。
      1. 检查温度计上的温度以确保加热器的准确性。可根据需要调整温度，以进行冷却或加热实验。如果温度未达到设定值，可使用仪器的偏移功能增加或减少设定值，直至达到所需温度。
   4. 实验结束时，清洗所有腔室，并关闭加热器以及通向装置的气体。
      1. 在腔室内的液体完全被抽干之前，切勿关闭气体，否则酸液或蒸馏水可能回流，并在下次使用时进入器官腔室。
      2. 为了清洁导线肌动图仪的腔室，最有效的方法是使用稀释的乙酸溶液进行酸洗。用棉签清洁腔室的边缘和内部。
      3. 洗涤后，用蒸馏水彻底冲洗小室。用湿布擦拭小室外表面以去除干燥的盐分。若实验中使用了疏水性药物，也可使用乙醇进行擦拭。
      4. 清洗步骤示例如下：将8%乙酸溶液注入腔室，孵育2分钟。使用棉签机械性清洁钢制腔室表面，避免与肌动图仪的铝制部分接触。
      5. 吸出乙酸，用蒸馏水多次冲洗肌动图仪腔室及支撑物，并使用吸水纸或棉签擦干表面。
3. 肠系膜动脉环的解剖
   注意：本研究使用的动物为喂食高脂饮食的雄性 Adipo-SIRT1 小鼠及其野生型 littermates 作为对照。实验时每只动物体重约为 45 g。
   1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）处死小鼠 mg/kg
   2. 使用手术剪和镊子进行正中腹切开术，暴露腹腔内容物。
   3. 将肠系膜弓收集至硅涂层培养皿中。
   4. 在培养皿中铺开并固定肠系膜网络，以展示肠系膜的分支结构及结缔组织网状结构。
   5. 在显微镜（10×）下，使用精细剪刀和镊子小心剥离周围结缔组织，避免损伤外膜层。必要时可保留血管周围脂肪组织用于实验。
   6. 使用精细剪刀和镊子，在冰冻的Krebs缓冲液中切除肠系膜动脉的二级分支。
      注意：每位研究人员应配备自己专用的解剖器械套装、绳子和脚蹬。每次实验结束后，应妥善保管这些工具并及时清洁，因为某些药物难以清洗，残留物可能附着在工具上。
      1. 将血管置于冰冷的Krebs缓冲液中，同时分离周围的结缔组织，包括血管周围脂肪组织（PVAT）。操作血管时应轻柔，避免对内皮造成不必要的损伤。
      2. 若实验涉及血管周围脂肪组织（PVAT）的研究，应在血管周围保留直径1.5至2 mm的PVAT球状组织。或者，可在每个实验腔室中加入等量的脂肪组织进行实验。
   7. （可选）为评估反应对内皮的依赖性，可去除离体血管的内皮作为对照。对于肠系膜动脉，可通过将其轻轻在金属丝环或毛发上滚动以去除内皮。
   8. 将上述制备的血管切成小环状（长约2 mm），放入盛有充氧（95% O₂）生理溶液的塑料培养皿中₂ 和5% CO₂用于后续将组织安装至丝状肌动描记仪腔室的克雷布斯缓冲液²⁷.
   9. 将血管环转移至显微镜下的肌动描记仪腔室中。血管环应均匀放置，上下吊钩保持平行。连接用金属丝（40 µm）应 freshly 制备，因为药物可能吸附在金属丝上。
   10. 将血管环穿入适当长度（2 cm）的金属丝上，并通过旋紧固定于灌流槽一端的夹具中以固定位置。
   11. 将第二根导丝穿过环，并固定至对侧下颌。
   12. 将环状组织穿入并固定在腔室钳口上后，将腔室安装到肌动图装置上，顺时针旋转千分尺螺钉，使两根导线相互靠近，直至用户界面上对应所安装腔室的张力读数为零或略低于零。
       注意：连接上颌的导线应尽可能短，以确保张力能够完全传递至检测器。
   13. 使用可调测微计施加力之前，将样品在 37 °C 下平衡至少 30 分钟。
   14. 评估组织在 115 mM 高钾溶液中的存活能力NaCl 替换为 KCl 以摩尔为基础的 Krebs 溶液，含有 4.6 mM NaCl、115 mM KCl、2.5 mM CaCl₂₂，1.17 mM MgSO₄₄，1.17 mM KH₂PO₄，25 mM NaHCO₃₃ pH 7.4 条件下的 11.1 mM D-葡萄糖
       注意：若分离的血管在接触收缩剂后，其在肌动图系统数据记录软件中测得的收缩力（以基线以上的偏转幅度表示）超过其静息张力的40%，则认为该血管具有活性。若动脉未能正常收缩，则可能是由于基础张力或管壁压力未调整至最佳水平，或在血管分离或安装过程中受到了损伤。
   15. （可选）通过加入苯肾上腺素使血管收缩至对KCl初始反应的50%（由数据记录软件中力传感器记录），评估内皮细胞的完整性，随后加入1 µM乙酰胆碱。
       注意：良好的血管制备对于获得一致且准确的结果至关重要。如果内皮完整性检测结果不理想，或血管环对KCl无反应（分别表明内皮功能或血管平滑肌收缩性不佳），则不应将该制备样本用于实验。在此情况下，应更换同一血管的另一血管环，或更换新的血管进行实验。

2. 标准化以确定最佳初始张力

注意：归一化程序可用于确定动脉的最佳内径（IC），在此直径下，血管承受适当的静息跨壁压（肠系膜动脉为100 mmHg或13.3 kPa），并对血管活性物质产生最大主动收缩力。

1. 打开计算机并启动数据记录软件（参见材料表）。
2. 将实验另存为新的“LabChart 数据文件”，以避免覆盖原始设置文件。
3. 打开归一化设置窗口，并将k因子设为1。接受目镜校准的默认值（若血管长度未知，则为0.3；若已知，则为1）、目标压力（13.3）、在线平均时间（2）和延迟时间（60）。点击确定以保存设置。
4. 选择感兴趣的通道，并输入金属丝直径（40 µm）、组织端点（a1：0；a2：实测的组织长度），以及归一化窗口中的初始千分尺读数。
5. 通过施加第一次被动拉伸（逆时针旋转千分尺螺丝）启动归一化程序。
6. 等待血管稳定（3 分钟），然后在归一化窗口中输入新的千分尺读数。管壁张力将自动计算，并在图表上显示为一个点。
   注意：在被动拉伸过程中使用的千分尺"步长"无需保持一致。最初的几次拉伸可每次增加20 µm。当拉伸接近等压线时，步长可减小至10 µm、5 µm、2 µm甚至更小。在调整千分尺设置时，请保持主图表窗口打开——如果在长度/张力图上出现超过等压线的大幅尖峰（表示对应预设压力值的点），应减小张力。
7. 每次被动拉伸后，用等渗高钾 Krebs 液替换对照 Krebs 液。当收缩达到平台期（约3分钟）时，通过从高钾激活的力中减去每次拉伸时的被动力来记录主动力（F）。同时计算管壁张力和内周长（IC）值。
   1. 将基线上方的偏转作为主动张力进行测量。主动张力（T）根据公式 F（mN）= T（mN/mm）× 2 × 血管长度（mm）计算。内周长（IC）值根据千分尺数据计算（IC = 205.6 µm + 2 × “间隙”）。
8. 用新鲜 Krebs 液洗去高钾条件，重复洗涤三次，每次间隔5分钟。
9. 重复步骤 2.5 至 2.8（交替进行被动拉伸和主动收缩），直至主动张力开始下降（图2）。
10. 经过多轮交替拉伸后，被动长度/张力曲线与等压线的交点可得出 IC100 值，即跨壁压为 100 mmHg 时血管的内周长。
    注意：每次被动拉伸过程中的千分尺数值需手动输入软件的归一化模块。程序会自动记录相应的力测量值，生成被动长度/张力曲线，并以与等压线的交点确定 IC100 值（图2，右侧面板）。最后一个点应尽可能接近但略高于等压线，以实现最佳归一化效果，同时不损伤血管。若该点远高于等压线，可能对固定好的血管造成物理损伤，导致实验结果不可靠。
11. 绘制主动长度/张力曲线以确定 IC1 值，并计算归一化k因子（IC1/IC100 的比值），该因子将在后续同类血管的肌动图实验中使用。
    注意：主动长度/张力曲线通过将根据千分尺数据计算出的 IC 值作为横坐标、主动张力作为纵坐标绘制而成。IC1 是位于峰值平台区域内的数值（图2右侧面板中的红色轨迹）。在绘制主动长度/张力曲线并确定 IC1 后，归一化k因子即为 IC1 与 IC100 的比值。根据该归一化k因子，可在被动长度/张力曲线上标出作为基线的最佳 IC 值（即 IC1）。该 IC 对应的千分尺设置会显示在曲线下方，应在后续肌动图实验中用于设定微调装置。初始张力（T）等于目标压力（Pi）× IC / 2π，施加于血管的最佳力（F）等于 T × 2 × 血管长度。
12. 彻底洗去高钾 Krebs 液，并让组织再平衡 30 至 45 分钟。将基础张力重置为"零"，以便在后续实验中仅记录主动收缩反应。

3. 去氧肾上腺素诱导的收缩反应

注意：可用于诱导血管收缩反应的药物包括非特异性肾上腺素受体激动剂去甲肾上腺素、选择性α-1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素、肽类激素血管紧张素II，以及单胺类神经递质5-羟色胺。本实验方案中选用苯肾上腺素进行检测（材料表）。

1. 按照第1.3节所述方法，从每条动脉的相邻节段分别制备并安装成对的动脉环，其中一个保留外膜血管周围脂肪组织（PVAT），另一个则去除PVAT，用于实验。
2. 完成标准化处理后（见第2节），通过向浴槽中加入含115 mM KCl的高钾Krebs缓冲液，使动脉节段预先收缩。
3. 等待收缩达到平台期（约3分钟），随后洗去高钾溶液，并更换为新鲜的充氧Krebs缓冲液。在5分钟内重复清洗三次。
4. 重复进行三次KCl刺激与清洗过程，并通过从KCl引起的张力中减去基础张力，记录KCl诱导的最大收缩反应/张力。
5. 最后一次收缩和清洗后，重新向浴槽中加入温热且充氧的Krebs缓冲液，使动脉恢复约30分钟，再进行下一步操作。
6. 向每个浴槽中逐级加入去氧肾上腺素（phenylephrine）（浓度按半对数递增，从10^-10 至 10^-4 M），以诱导静息状态下血管环张力的浓度依赖性升高。
7. 首先加入低浓度激动剂至浴槽中。待收缩稳定（3–5分钟）后，再加入下一浓度。依次重复此步骤，逐步提高去氧肾上腺素浓度。
8. 加入最后一剂激动剂（去氧肾上腺素）后，彻底洗去药物，并用新鲜Krebs缓冲液重新填充浴槽。将浓度依赖性反应以KCl诱导的最大收缩张力的百分比递增形式绘图表示（图3）。
9. （可选）为评估一氧化氮（NO）的作用，在加入去氧肾上腺素前，先将组织孵育于一氧化氮合酶抑制剂L-NAME（10^-4 M）中30分钟。L-NAME可增强肠系膜动脉静息状态下对去氧肾上腺素的收缩反应（图4）。
   注意：抑制剂或拮抗剂需有足够时间达到平衡，通常为30–45分钟（同一组实验中应保持一致）。
10. 若需在同一样本上连续进行第二次浓度-反应曲线测定，应彻底并反复清洗浴槽，完全去除前次使用的激动剂，直至血管张力无进一步变化。
    注意：平行实验是指将来自同一血管的至少两个动脉环同时暴露于激动剂下，一个在对照条件下，另一个在抑制剂存在下；每个动脉环仅进行一次浓度-反应曲线测定。推荐采用平行实验设计，因其能更好地控制药物效应及血管敏感性。序列实验则是在单个动脉环上先测定激动剂的浓度-反应曲线，洗脱后改变实验条件（如添加抑制剂），再在同一动脉环上重复测定浓度-反应曲线。此时需设置时间对照，以证明药物反应并非由组织随时间变化所致。无法保证组织在经历一次浓度-反应实验后仍处于完全相同的状态。必须给予足够时间（至少30–60分钟），使血管节段恢复至静息（基础）张力水平，尽管在某些情况下，高亲和力激动剂从受体解离后，恢复可能不会立即完成。此外，可在连续的累积浓度-反应曲线之间施加高钾Krebs溶液，以减少脱敏现象²⁸。需注意大多数拮抗剂无法被完全洗脱，因此在后续实验中应持续添加。

4. 内皮依赖性舒张/收缩

1. 预先收缩一个新安装的动脉节段（如步骤 3.2 至 3.5 所述）。再次通过从 KCl 引起的张力中减去基础张力，记录对 KCl 的最大收缩反应/张力。
2. （可选）在加入 U46619 前，用一氧化氮合酶抑制剂 L-NAME（10^-4 M）孵育组织 30 分钟。
3. 将预先计算好的 U46619 浓度加入浴槽中，使动脉节段产生稳定且持续的收缩。
   注意：在肠系膜动脉中，血管舒张反应是在预先收缩至 115 mM KCl 最大反应约 80% 的情况下诱导的。可通过激活其特异性受体使用不同的激动剂诱导收缩。此处，使用血栓素 A2 受体激动剂 U46619（1–3 × 10^-8 M；材料表）对含有或不含 PVAT 的血管节段进行预收缩，以诱导稳定且持续的平滑肌收缩。
4. 向器官浴槽中逐次加入乙酰胆碱（10^-10 至 10^-4 M）的累积浓度。动脉节段的浓度依赖性血管舒张反应以 U46619 诱导的收缩反应的百分比表示（图 5）。
   注意：在大多数实验中，当观察到平台期时应立即加入下一个浓度的舒张激动剂，以防止张力反弹。为校正不同动脉节段之间神经支配和直径的微小差异，动脉节段的浓度依赖性血管舒张反应被标准化为 U46619 诱导收缩反应的百分比（图 5）。当统计分析六次或更多次实验时，来自同一血管的不同环之间反应性的微小差异将变得极小。当将反应表示为个体组织自身最大收缩的百分比时，采用配对分析（例如配对 Student t 检验）来比较不同动物相同类型组织的反应，与比较单个组织干预前后的反应同样合适。在分析 PVAT 效应时，采用双因素方差分析（two-way ANOVA），随后进行多重比较检验。
5. 加入舒张激动剂的最终剂量后，从每个浴槽中移除药物，并重新注入新鲜的 Krebs 缓冲液。用 Krebs 缓冲液彻底清洗浴槽，并让动脉稳定至少 45 分钟，然后再进行其他实验。

结果

测定长度/张力关系以获得归一化因子k

施加于血管段的牵张程度会影响肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的程度，从而影响所产生的最大主动收缩力。因此，对于每种类型的血管，必须确定产生最大主动收缩力所需的牵张程度，以确保血管肌张力实验的准确性。本文对从小鼠模型中分离的肠系膜动脉进行了长度/张力关系的标准化处理（图2）。将动脉段悬挂在四腔丝状肌张力测定系统（见材料表）的不锈钢针（直径40 μm）上。通过连接至装有记录程序计算机的模数转换器记录等长张力。每个腔室含有5 mL Krebs缓冲液，维持在37 °C，并以95% O₂ 和5% CO₂ 持续通气，以在整个实验过程中将pH值维持在7.4。通过逐步牵张动脉段建立被动的长度/张力关系，直至达到相当于100 mmHg跨壁压的内周长（I...

讨论

除了内皮细胞外，源自血管周围脂肪组织（PVAT）的信号在调控平滑肌张力反应性方面也发挥着重要作用³⁰。健康的PVAT会释放一氧化氮（NO）和具有抗炎作用的脂联素，对动脉产生抗收缩效应；但在肥胖和代谢综合征等病理状态下，这种效应会丧失^31,32。在疾病状态下，PVAT可促进内皮功能障碍及其他心血管异常的发生发展^33,34。已有研究报道，在肥胖动物的动脉PVAT中，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达和功能均出现异常^35,36。由于内皮功能障碍和PVAT功能障碍均参与心血管及代谢异常的发生发展^23,37，因此在进行离体血管实验时，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰胆碱	Sigma-Aldrich	A6625	储备浓度: 10-1 M 工作浓度: 10-10 至 10-5 M
L-NAME（Nω-硝基-L-精氨酸甲酯）	Sigma-Aldrich	N5751	储备浓度: 3 × 10-2 M 工作浓度: 10-4 M
去氧肾上腺素	Sigma-Aldrich	P6126	储备浓度: 10-2 M 工作浓度: 10-10 至 10-5 M
U46619（9,11-二脱氧-9α,11α亚甲基环氧前列腺素 F2α）	Enzo	BML-PG023-0001	储备浓度: 10-5 M 工作浓度: 1-3 × 10-8 M
多丝肌动描记仪	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 野生型小鼠	中国香港大学实验动物部	CULATR 编号：4085-16
硅涂层培养皿	Danish MyoTechnology (DMT)
钨丝	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
手术器械