一种用于鉴定纹身墨水成分及假冒产品的两步热解-气相色谱-质谱联用方法

摘要

这种两步热解在线联用气相色谱-质谱检测及数据评估方法可用于纹身墨水的多组分分析，并可区分假冒产品。

摘要

纹身墨水是多种成分的复杂混合物，每种成分都具有不同的化学性质，在进行化学分析时需要分别加以考虑。本方法采用两步热解并在线联用气相色谱-质谱法（py-GC-MS），在第一步解吸过程中分析挥发性化合物；在第二步中，对同一样品的干燥残留物进行热解，以分析颜料和聚合物等非挥发性化合物，这些物质可通过其特有的分解模式进行鉴定。此外，该方法还可用于区分原始墨水与假冒墨水。通过使用平均质谱图和自制的热解谱图数据库进行数据评估，可实现快速筛查，加快物质鉴定速度。结合专门用于热解GC-MS数据分析的评估软件，可快速、可靠地对完整色谱图进行比对。由于该方法以气相色谱-质谱法作为分离技术，因此仅适用于样品在解吸过程中以及热解后生成的挥发性物质。该方法无需样品前处理步骤，适用于市场监管调查中的快速物质筛查。

引言

纹身墨水是复杂的混合物，包含颜料、溶剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂，有时还包括防腐剂¹。近几十年来，纹身日益流行，促使欧洲各国制定了针对纹身墨水安全性的法规。大多数情况下，着色颜料及其杂质受到限制，因此应由国家实验室通过市场抽检进行监测，以确保其符合法律法规要求。

采用此处所述的在线热解-气相色谱-质谱联用技术（py-GC-MS），可同时鉴定多种成分。由于挥发性、半挥发性和非挥发性化合物可在同一过程中实现分离与分析，因此相较于其他用于纹身墨水分析的方法，该方法可检测的目标化合物种类更多。液相色谱法通常需将颜料溶解于有机溶剂中进行分析²。拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）已被描述为适用于颜料和聚合物鉴定的工具，但在分析多组分混合物时存在局限性，因为在标准实验室应用中未结合分离技术^3,4。激光解吸/电离飞行时间质谱法（LDI-ToF-MS）也已被用于颜料和聚合物的鉴定^5,6。总体而言，大多数方法均缺乏对挥发性化合物的分析能力。缺乏合适的商用谱图数据库是所有这些方法普遍存在的缺点。无机颜料的鉴定通常采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）^7,8或能量色散X射线光谱法（EDX）^4,9。此外，FT-IR和拉曼光谱也已在其他研究领域中用于分析二氧化钛或氧化铁等无机颜料^10,11,12,13。

本研究的目的是建立一种适用于标准分析实验室的方法，该方法可在适度的财务成本下对现有且常见的设备进行升级。此处所述的热解-气相色谱-质谱联用法（Py-GC-MS）是一种用于鉴定混合物中有机成分的非定量方法。在通过Py-GC-MS筛查发现可疑物质后，可采用更专业的方法对目标物质进行定量分析。该方法特别适用于分析非挥发性和不溶性物质，如色素和聚合物。

所述方法可适用于其他应用领域的油墨和清漆。所描述的数据评估方法适用于所有热解分析研究。此外，假冒产品（主要来自亚洲市场）对消费者构成潜在风险，并给制造商带来经济负担（在第3次会议上的个人交流）^rd 德国雷根斯堡 ECTP，2017）。本文所述方法可用于将疑似伪造墨水的特性与原始墨水瓶中的墨水进行比对，类似于已发表的用于汽车漆层鉴定的法医学方法。¹⁴.

方案

1. 纹身墨水的制备与样品安装

1. 使用25 mm的空心玻璃热解管作为样品载体，并用石英棉进行样品制备。
   1. 使用专用于热解管的镊子（经烘烤去污）夹住热解管，并用尖头镊子将适量石英棉插入管中。
   2. 在热解管两侧各插入一根钢棒（经烘烤去污），将石英棉压成1–2 mm厚的塞状。该塞状物必须位于热解管底部三分之一处，以确保热解过程中受热充分。
   3. 点燃燃气喷灯，从每侧对热解管及其填充物烘烤2–3秒，以去除污染物。
      注意：操作热解管和石英棉前应佩戴洁净手套，避免触碰任何物品。烘烤热解管时需佩戴护目镜，并移除所有易燃液体和物品。本步骤完成后可暂停实验流程。将制备好的热解管存放于洁净的玻璃培养皿中，待后续使用。
2. 手动剧烈振荡纹身墨水瓶1分钟，以确保均匀混合。此外，也可将其置于超声水浴中处理1分钟。部分墨水在完成上述两步后仍可能出现颜料沉淀，可能需要更长时间的均质化处理。
3. 取一支直径小于热解管内径的2 µL微量毛细管，将毛细管尖端浸入墨水中，吸入约1 µL墨水（填充毛细管约一半体积）。
4. 将毛细管插入热解管内，使墨水染色石英棉塞。应能明显观察到颜色染色，但不得加入过多墨水。
5. 取用于自动进样装置的钢制传输适配器，并使用热解管专用镊子将已制备的热解管固定于适配器上。
   1. 检查热解管是否完全垂直，确保在振荡过程中不会脱落。
   2. 将传输适配器放置于样品盘中指定位置。
      注意：墨水可能污染连接热解管的钢制传输适配器，因此后续需进行更彻底的清洁。

2. 通过热解-气相色谱-质谱法分析墨水样品

1. 根据制造商的说明，设置配备热脱附单元（TDU）和位于冷进样系统（CIS）上方的热裂解模块的气相色谱-质谱联用系统（GC-MS）。使用70 eV的惰性电子轰击（EI）离子源，高纯度（99.999%）氦气作为载气（流速1 mL/min）。将CIS的分流比设置为1:50。
2. 安装HP-5MS色谱柱及保护柱用于分离。在仪器控制软件中设定以下分析参数：柱温箱起始温度为50 °C，保持2 min，以10 °C/min的升温速率升至320 °C，最终温度保持5 min。传输线温度设为320 °C。
3. 以无溶剂排气模式对每个样品进行一次运行，不进行热裂解，用于分析半挥发性化合物。
   1. 使用TDU/进样器的溶剂排气功能，在0.5 min后从50 °C开始以100 °C/min的速率升温至90 °C。溶剂排气在1.9 min后关闭。
   2. 以720 °C/min的速率将TDU温度升至320 °C，持续3.5 min。挥发性化合物在-150 °C下被捕集于CIS中。
   3. 保持CIS温度2 min，然后以12 °C/min的速率升至320 °C。
      注意：由于样品支架处于开放状态，样品制备与分析之间的长时间间隔会导致挥发性化合物蒸发。若目标为挥发性化合物，应在样品制备后数小时内完成分析。
4. 对同一样品进行第二次运行，使用热裂解单元以检测非挥发性化合物。
   1. 使用与第一次脱附运行相同的柱温程序。
   2. 保持CIS温度恒定在320 °C，分流比设为1:100。
   3. 将TDU温度直接从50 °C以720 °C/min的速率升至320 °C，并保持1.6 min。
   4. 在TDU的最终温度阶段，设定在目标温度（此处为800 °C）下进行6 s的热裂解。
      注意：确保使用适量的样品和合适的分流比，以防止色谱柱和质谱仪污染。根据需要调整不同仪器配置下的分流比。
5. 使用聚苯乙烯标准品检查仪器性能。每次实验前后至少运行三个聚苯乙烯样品。取2 µL浓度为4 mg/mL的聚苯乙烯二氯甲烷标准溶液注入玻璃棉中，在500 °C下进行0.33 min的热裂解。
6. 检查所得色谱图（也称为裂解色谱图）中聚苯乙烯单体与二聚体的峰面积比是否在3至4之间，且二聚体的拖尾因子低于2。保留聚苯乙烯参数的历史数据，若峰面积比超出范围，则校准热裂解温度。
   注意：聚苯乙烯单体与二聚体的峰面积比及拖尾因子的参考值应来自运行良好的仪器的历史数据。

3. 数据评估方法

注意：数据评估应根据具体的分析问题进行调整，例如，检测挥发性物质、非挥发性化合物、偶氮染料产生的有害裂解产物，或类似物质。

1. 挥发性化合物的数据评估
   1. 进行挥发性化合物的数据评估时，启动气相色谱-质谱（GC-MS）分析/质谱库检索软件（参见材料表），并打开解吸运行的色谱图。
   2. 通过点击谱图和选择库来选择商业谱图库。加载感兴趣的谱图库。
   3. 设置积分参数，并通过点击谱图和谱图库检索报告执行谱图库检索。
      注意：需特别注意将疑似鉴定化合物的谱图库谱图与墨水中分析所得谱图进行比对。尽管未知谱图中可能存在额外的分子质量峰，有时仍可获得良好的匹配结果。为明确鉴定，必须使用相同的实验装置和仪器参数分析相应的分析标准品，以确认保留时间和谱图的一致性。
2. 非挥发性化合物的快速筛查
   注意：热解产生的非挥发性化合物的鉴定基于在同一热解图（pyrogram）中存在母体化合物的多个特定分解产物。由于热解图可能包含多达数百种化合物，人工评估几乎不可行。建议首先采用平均质谱（AMS）进行快速数据评估。该方法适用于鉴定样品中最丰富的颜料或聚合物，仅适用于墨水声明欺诈的快速筛查，以及为人工热解图评估提供起点。
   1. 进行热解数据评估时，在GC-MS分析软件中（参见材料表），用鼠标右键按住并拖动以选中整个色谱图，从而获得平均质谱（AMS）。
   2. 通过点击谱图和编辑库（若无现有库，则点击创建新库），创建一个包含所有目标化合物（如颜料和聚合物）已知参考物质谱图的库。
   3. 选择添加新条目，并填写所有相关信息。
      注意：选择标准品或墨水的AMS谱图，若需将数据转发至支持质谱库检索的其他软件，可点击谱图和NIST检索。
   4. 生成待测墨水热解图的AMS，并使用谱图库检索功能与自建的AMS谱图库进行比对¹⁵。排除来自色谱柱流失或其他柱噪声的质荷比信号。
      注意：谱图库检索结果中匹配度最高的条目很可能对应墨水中最丰富的颜料或聚合物。为验证此结果，需将该物质在标准品热解中观察到的单个特征性分解产物，与所分析墨水热解图中的相应产物进行比对（参见第3.4节和补充表1）。
3. 使用专用热解图评估软件鉴定非挥发性化合物
   1. 根据软件说明，将感兴趣的热解图转换为所需格式。对热解图进行积分，使识别出的化合物数量最多不超过200个；否则，热解图评估软件中的数据处理时间将显著增加。
   2. 在计算机上建立一个文件夹，存放所有拟作为谱图库的热解图条目，例如用于颜料鉴定的颜料热解图库，或用于与疑似假冒产品比对的原始墨水热解图。
   3. 在谱图库检索标签页中，点击浏览，加载未知样品的热解图。
   4. 加载谱图库文件夹，并在检索选项中仅选择质谱匹配和保留时间匹配，因为待测热解图的整体丰度可能与参考颜料热解图存在差异。
   5. 在检索选项中点击高级，选择“仅使用具有指定质谱谱图的峰”参数，并在热解图评估软件中设置拟合阈值为850。
   6. 点击添加，将每个参考颜料或聚合物热解图中最显著的3–5个峰的质谱谱图保存至高级检索选项中（参见补充表1）。通过此方式，即使在多组分墨水中存在干扰性高丰度峰，也仅对与颜料相关的峰进行比对。
   7. 点击确定返回主窗口。
   8. 点击检索开始比对过程。
   9. 如有需要，进入色谱图匹配标签页，选择某一化合物，点击发送至NIST，将谱图转发至质谱库软件以鉴定该化合物。
      注意：点击发送至质谱选项可将谱图纳入高级检索选项中（参见步骤3.3.6）。
4. 人工物质鉴定
   注意：若无专用热解图评估软件，可使用标准质谱库检索程序结合商业谱图库、已报道的碎片信息（补充表1）以及我们提供的热解图库¹⁵进行数据评估。还需通过人工比对热解图中的化合物与已知分解产物，以验证AMS检索结果的准确性。
   1. 进行非挥发性化合物的数据评估时，启动GC-MS分析/质谱库检索软件，并打开热解运行的色谱图。
   2. 通过点击谱图和选择库，选择商业谱图库及（自制）热解图库（例如我们提供的热解图库¹⁵），并加载所有感兴趣的谱图库。
   3. 在GC-MS分析软件中对热解图进行积分，考虑所有峰面积≥总面积0.2%的峰（可根据实际情况调整，以确保积分峰数量适中，便于处理）。
   4. 通过点击谱图和谱图库检索报告启动谱图库检索。
   5. 人工比对所有谱图库匹配结果与补充表1中列出的特定颜料和聚合物分解产物，或文献中报道的碎片信息^{16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}。对于颜料，需有2至3个分解产物方可明确鉴定所用颜料。
      注意：必须仔细评估所有与谱图库的谱图匹配结果。高于分子离子峰的额外峰通常代表具有相似结构但带有附加侧链基团的化合物。如条件允许，应分析参考物质以获得该分析体系下的特异性保留时间。

结果

该方法对每个样品采用两步色谱分析流程（图1）。第一步运行中，样品在进样系统内于90 °C下干燥，随后将挥发性化合物转移至色谱柱。由于干燥过程在大多数情况下并不完全，残留溶剂和挥发性化合物也会被转移并进行分析。在第二步运行中，先前干燥的样品随后进行热解，以促进对非挥发性有机组分的分析。

图1：热解实验流程的示意图。

讨论

热解-气相色谱-质谱法（Py-GC-MS）是一种适用于纹身墨水中多种物质的有用筛查方法，也可用于其他产品的分析。与其他方法相比，Py-GC-MS 所需的样品前处理步骤极少。相较于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-ToF-MS）和能量色散X射线光谱法（EDX）等更为专业的方法，气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）在大多数分析实验室中均较为常见。

热解谱图的数据评估可能具有挑战性，因为理论上可能的成分列表是无限的，且需要进行谱库检索，同时考虑物质组合以匹配谱库中的母体化合物。本文所述的数据评估方法可实现对已添加至标准热解谱图库中的物质进行可靠且快速的筛查。相反，对于假冒产品的检测则是一种快速且直接的方法，无需预先建立的谱库即可完成，因为无需鉴定单一物质。

为了获得最佳结果，添加到热解中的墨水量既不能过高也不能过低。墨水量过高可能导致热解装置、衬管或色谱柱污染，而过低则可能导致热解图谱中缺乏足够显著的峰，从而影响正确解析。因此，强烈建议采用本方法中所述的固定体积墨水，并配合调整分流比进行操作。如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
99.999% 氦气载气	液化空气集团，Dü德国杜塞尔多夫	-
5975C 惰性 XL MSD 带三轴检测器	安捷伦科技公司，德国瓦尔德布隆	-
7890A 气相色谱仪	安捷伦科技公司，德国瓦尔德布隆	-
AMDIS 软件（版本 2.7）	美国马里兰州盖瑟斯堡国家标准与技术研究院	-	可用于GC/MS峰面积积分，例如转移至热解图分析软件进行评估
冷注射系统（CIS）	Gerstel, Mü德国哈尔海姆	-
电子轰击（EI）源	安捷伦科技公司，德国瓦尔德布隆	-
增强型化学工作站 (E02.02.1431)	安捷伦科技公司，德国瓦尔德布隆	-	用于生成平均质谱图（AMS），可进行峰面积积分及标准气相色谱/质谱（GC/MS）数据库检索
J&W HP-5MS 气相色谱柱，30 m，0.25 mm，0.25 µm，5975T 柱状环形组件	安捷伦科技公司，德国瓦尔德布隆	29091S-433LTM
MassHunter 软件	安捷伦科技公司，德国瓦尔德布隆	-	未指定版本，可用于气相色谱/质谱峰积分及标准气相色谱/质谱谱库检索
微毛细管 Drummond Microcaps，体积 2 µL	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P1549-1PAK
MS ChromSearch（版本 4.0.0.11）	Axel Semrau GmbH & Co. KG，Sprockhö德国维尔	-	专用 Pyrogram 分析软件
NIST MS 搜索程序（MS Search 版本 2.0g）	美国马里兰州盖瑟斯堡国家标准与技术研究院	-	用于MS和AMS文库构建及使用自制与商业文库进行相应物质检索
NIST/EPA/NIH 质谱库（EI）mainlib & replib（数据版本：NIST v11）	美国马里兰州盖瑟斯堡国家标准与技术研究院	-	使用商业质谱库
聚苯乙烯（平均分子量 ~192,000）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	430102-1KG
热解管，管型 - 石英玻璃 - 长度 25 mm；100 个单位	Gerstel, Mü德国赫尔兴	018131-100-00
用于热解吸单元的热解器模块	Gerstel, Mü德国赫尔兴	-
石英棉	Gerstel, Mü德国赫尔兴	009970-076-00
钢棒	Gerstel, Mü德国赫尔兴	-
热脱附单元（TDU 2）	Gerstel, Mü德国赫尔兴	-
转运适配器	Gerstel, Mü德国赫尔兴	018276-010-00
热解管用镊子	Gerstel, Mü德国赫尔兴	009970-074-00
Zebron Z-Guard 高温保护柱，GC 毛细管柱 10 m × 0.25 mm，每支	Phenomenex Ltd. Deutschland，阿沙芬堡，德国	7CG-G000-00-GH0