本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。
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摘要
摘要
帕金森病（PD）是由于中脑腹侧黑质致密部（SNpc）的多巴胺能（DA）神经元退化所致。细胞替代疗法在治疗帕金森病方面具有广阔前景。近年来，诱导性神经干细胞（iNSCs）因其成瘤风险较低，并具有分化为区域特异性神经元和胶质细胞的可塑性，成为细胞替代疗法的潜在候选细胞。iNSCs可通过重编程自体体细胞来源（如成纤维细胞、外周血单个核细胞（PBMNCs）及其他多种细胞类型）获得。与其他类型的体细胞相比，PBMNCs是一种理想的起始细胞类型，因其易于获取且可在体外培养中扩增。编码重编程因子（包括人OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC）的仙台病毒（SeV）是一种RNA非整合型病毒，具有负链、单链、非分段的基因组，不会整合到宿主基因组中，仅在感染细胞的细胞质内复制，因此是一种高效且安全的重编程载体。本研究中，我们描述了一种通过重编程PBMNCs获得iNSCs，并采用两阶段方法将其分化为特化的中脑腹侧DA神经元的实验方案。随后将DA前体细胞移植至单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病小鼠模型中，以评估其治疗帕金森病的安全性和有效性。该方法为在体外和体内研究患者特异性DA神经细胞的功能及治疗效应提供了平台。
引言
帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，由中脑腹侧黑质致密部（SNpc）多巴胺能（DA）神经元变性所致，在60岁以上人群中患病率超过1%1,2。在过去十年中，细胞治疗作为一种旨在替代变性或受损细胞，或滋养变性神经元周围微环境的策略，在PD治疗中展现出潜力3。与此同时，重编程技术取得了显著进展4，为替代疗法提供了有前景的细胞来源。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）和胚胎干细胞（ESCs）已被证实可分化为DA神经细胞，移植至大鼠和非人灵长类PD模型后，这些细胞能够存活、成熟并改善运动功能5,6,7,8。iPSCs是细胞重编程技术发展中的一个里程碑，在细胞移植领域具有巨大潜力；然而，仍存在未完全分化细胞可能导致肿瘤形成的风险担忧。另一种用于细胞移植的细胞来源是通过直接重编程获得的谱系定向成体干细胞，例如诱导性神经干细胞（iNSCs），其可来源于不稳定的中间态细胞，从而绕过多能性阶段9,
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方案
所有操作必须遵循机构人体研究伦理委员会的指南。在采集血液前，必须从患者或健康志愿者处获得知情同意。本方案已获该机构人体研究伦理委员会批准，并根据该机构关于动物护理和使用的指南进行。
1. 外周血单个核细胞的采集、分离与扩增
- 外周血单个核细胞（PBMNCs）的采集
- 使用含肝素钠抗凝剂的采血管，通过静脉穿刺采集供体外周静脉血10–20 mL。
注意：血液样本应于室温（RT）保存或运输，并在24小时内处理。
- 使用含肝素钠抗凝剂的采血管，通过静脉穿刺采集供体外周静脉血10–20 mL。
- 培养基的制备
- 通过混合以下组分制备无血清培养基（SFM）：245 mL Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）、240 mL Ham’s F-12培养基、5 mL 胰岛素-转铁蛋白-硒-X添加剂（ITS-X）、5 mL 100倍谷氨酰胺储备液（材料表）、5 mL 化学成分明确的脂质浓缩液、2.5 g 胎牛血清、0.025 g 抗坏血酸和9 μL 1-巯基甘油。过滤培养基后于4 °C保存。
注意：抗坏血酸和1-巯基甘油经皮肤接触或吸入具有毒性。 - 为制备单个核细胞（MNC）培养基，在SFM中添加以下成分：10 ng/mL人白细胞介素3（IL-3）、2 U/mL促红细胞生成素（EPO）、100 ng....
- 通过混合以下组分制备无血清培养基（SFM）：245 mL Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）、240 mL Ham’s F-12培养基、5 mL 胰岛素-转铁蛋白-硒-X添加剂（ITS-X）、5 mL 100倍谷氨酰胺储备液（材料表）、5 mL 化学成分明确的脂质浓缩液、2.5 g 胎牛血清、0.025 g 抗坏血酸和9 μL 1-巯基甘油。过滤培养基后于4 °C保存。
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结果
本文报道了一种用于治疗帕金森病（PD）模型的iNSC-DA细胞疗法的完整实验方案，涵盖多个不同阶段。首先，分离并扩增外周血单个核细胞（PBMNCs），并通过SeV病毒感染将其重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）。PBMNC扩增及iNSC诱导过程的示意图见图1。在第-14天，使用密度梯度介质（材料表）分离PBMNCs。离心前，将磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的血液与密度梯度介质分层，形成两层液体。离心后出现四层梯度（从底部到顶部）：底层为粒细胞和红细胞；第二层为密度梯度介质；第三层为PBMNCs（红色箭头所示）；顶层为富血小板血浆（图2A）。经过14天的扩增后，在第0天用SeV病毒感染PBMNCs。在第1天，移除含SeV的培养基（图2B）。如图2B所示，预期细胞数量逐渐减.......
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讨论
本文介绍了一种针对帕金森病（PD）模型的iNSC-DA细胞治疗方案，涵盖多个阶段。该方案的关键步骤包括：（1）外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离与扩增，以及通过SeV病毒感染将PBMNCs重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）；（2）将iNSCs分化为多巴胺能（DA）神经元；（3）建立单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病小鼠模型并进行行为学评估；（4）多巴胺能前体细胞的移植及后续行为学评估。
在本实验方案中，第一部分涉及在无血清培养基（MNC培养基）中采集并扩增外周血单个核细胞（PBMNCs），该培养基优先扩增成红细胞系，且不支持淋巴细胞增殖。在以往的研究中，多种体细胞已被重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）或诱导性神经干细胞（iNSCs）12,13,14。与其他类型的体细胞相比，PBMNCs具有若干优势。其中最显著的优势是其有利的基因表达模式和表观遗传特征。PBMNCs在体内寿.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得以下基金资助：干细胞及转化医学国家重点研发计划（2016YFA0101403）、国家自然科学基金（81661130160、81422014、81561138004）、北京市自然科学基金（5142005）、北京市人才发展基金（2017000021223TD03）、北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划“十三五”时期项目（CIT & TCD20180333）、北京市卫生系统高层次人才奖励项目（2015-3-063）、北京市卫生健康委员会基金（PXM 2018_026283_000002）、北京市“百千万人才工程”项目（2018A03）、北京市医院管理局临床医学发展专项经费支持（ZYLX201706）以及英国皇家学会-牛顿高级学者基金（NA150482）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 毫升锥形管 | Corning | 430052 | |
| 1-硫代甘油 | Sigma-Aldrich | M6145 | 吸入和皮肤接触有毒 |
| 24 孔板 | Corning | 3337 | |
| 50 毫升锥形管 | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6 孔板 | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | 细胞解离试剂 |
| 阿扑吗啡 | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A92902 | 皮肤接触有毒 |
| B27 添加剂 | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 脑源性神经营养因子 |
| 含肝素钠的采血管 | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | 胎牛血清 |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | 二丁酰环磷酸腺苷 |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | 用作 PBMNCs 的冷冻保存液 |
| 化学成分明确的脂质浓缩液 | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| 盖玻片 | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| 驴血清 | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | 人促红细胞生成素 |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077，密度梯度介质 |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 胶质细胞源性神经营养因子 |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × 谷氨酰胺储备液 |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | 平衡盐溶液 |
| 人白血病抑制因子 | Millpore | LIF1010 | |
| 人重组 SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | 人胰岛素样生长因子 |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | 人白细胞介素 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove 改良杜尔贝科培养基 |
| 胰岛素 | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | 胰岛素-转铁蛋白-硒-X 添加剂 |
| Knockout 血清替代物 | Gibco | 10828028 | 无血清基础培养基 |
| 层粘连蛋白 | Roche | 11243217001 | |
| 微量注射器 | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 添加剂 | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | 非必需氨基酸 |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | 基础培养基 |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | 聚-D-赖氨酸 |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | 避光保存于 -20? |
| 仙台病毒 | Life Technologies | MAN0009378 | |
| 蔗糖 | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | 转化生长因子 β? |
| 转铁蛋白 | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| 吐温 X-100 | baiaoshengke | 非离子型表面活性剂 | |
| 台盼蓝 | Gibco | T10282 | |
| 赛拉嗪 | Sigma-Aldrich | X1126 |
参考文献
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to m....
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重印与许可
