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方法文章

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

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DOI：

10.3791/59690

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2019年7月11日

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

本文内容

摘要

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。

摘要

帕金森病（PD）是由于中脑腹侧黑质致密部（SNpc）的多巴胺能（DA）神经元退化所致。细胞替代疗法在治疗帕金森病方面具有广阔前景。近年来，诱导性神经干细胞（iNSCs）因其成瘤风险较低，并具有分化为区域特异性神经元和胶质细胞的可塑性，成为细胞替代疗法的潜在候选细胞。iNSCs可通过重编程自体体细胞来源（如成纤维细胞、外周血单个核细胞（PBMNCs）及其他多种细胞类型）获得。与其他类型的体细胞相比，PBMNCs是一种理想的起始细胞类型，因其易于获取且可在体外培养中扩增。编码重编程因子（包括人OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC）的仙台病毒（SeV）是一种RNA非整合型病毒，具有负链、单链、非分段的基因组，不会整合到宿主基因组中，仅在感染细胞的细胞质内复制，因此是一种高效且安全的重编程载体。本研究中，我们描述了一种通过重编程PBMNCs获得iNSCs，并采用两阶段方法将其分化为特化的中脑腹侧DA神经元的实验方案。随后将DA前体细胞移植至单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病小鼠模型中，以评估其治疗帕金森病的安全性和有效性。该方法为在体外和体内研究患者特异性DA神经细胞的功能及治疗效应提供了平台。

引言

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，由中脑腹侧黑质致密部（SNpc）多巴胺能（DA）神经元变性所致，在60岁以上人群中患病率超过1%1,2。在过去十年中，细胞治疗作为一种旨在替代变性或受损细胞，或滋养变性神经元周围微环境的策略，在PD治疗中展现出潜力3。与此同时，重编程技术取得了显著进展4，为替代疗法提供了有前景的细胞来源。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）和胚胎干细胞（ESCs）已被证实可分化为DA神经细胞，移植至大鼠和非人灵长类PD模型后，这些细胞能够存活、成熟并改善运动功能5,6,7,8。iPSCs是细胞重编程技术发展中的一个里程碑，在细胞移植领域具有巨大潜力；然而，仍存在未完全分化细胞可能导致肿瘤形成的风险担忧。另一种用于细胞移植的细胞来源是通过直接重编程获得的谱系定向成体干细胞，例如诱导性神经干细胞（iNSCs），其可来源于不稳定的中间态细胞，从而绕过多能性阶段9,10,11。

诱导多能干细胞（iPSCs）和诱导神经干细胞（iNSCs）均可由自体细胞来源（如成纤维细胞、外周血单个核细胞（PBMNCs）以及其他多种类型的细胞）重编程获得12,13,14，从而在很大程度上降低移植细胞的免疫原性。此外，与iPSCs相比，iNSCs具有较低的成瘤风险和谱系限定的可塑性，仅能分化为神经元和胶质细胞11。在早期研究中，人或小鼠的iPSCs和iNSCs均来源于皮肤活检获取的成纤维细胞，该方法具有侵入性14,15。相比之下，PBMNCs是一种颇具吸引力的起始细胞来源，因其取样过程创伤更小，且可在较短的扩增时间内获得大量细胞16。早期的重编程研究采用整合型递送系统（如慢病毒或逆转录病毒载体），这类系统在多种细胞中效率高且易于操作17；然而，这些递送系统可能导致基因突变以及残留转基因的再激活，从而带来临床治疗应用中的安全性问题12。仙台病毒（SeV）是一种非整合型RNA病毒，具有负链单股RNA基因组，不会整合到宿主基因组中，仅在感染细胞的细胞质内复制，因此是一种高效且安全的重编程载体18,19。目前已开发出携带重编程因子（包括人源OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC）开放阅读框的重组SeV载体。此外，通过引入温度敏感型突变可进一步优化SeV病毒载体，使其在培养温度升至39 °C时迅速被清除20。本文介绍了一种利用SeV系统将PBMNCs重编程为iNSCs的实验方案。

许多研究已报道了使用不同方法从人胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSC）中获得多巴胺能神经元6,8,21。然而，目前尚缺乏详细描述如何从诱导性神经干细胞（iNSC）分化为多巴胺能神经元的实验方案。在本方案中，我们将介绍一种通过两阶段法高效生成多巴胺能神经元的方法。所获得的多巴胺能神经前体细胞可移植至帕金森病（PD）小鼠模型的纹状体中，用于安全性与有效性评估。本文将提供一份详尽的实验流程，涵盖多个阶段：利用仙台病毒诱导生成神经干细胞、iNSCs向多巴胺能神经元的分化、帕金森病小鼠模型的建立，以及将多巴胺能前体细胞移植至PD模型小鼠纹状体中的操作。通过该方案，研究人员可从患者或健康供体获得iNSCs，并进一步衍生出安全、可标准化、可规模化且均一的多巴胺能神经元，用于细胞移植治疗，或在体外建立帕金森病模型，以研究疾病发生与发展的潜在机制。

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方案

所有操作必须遵循机构人体研究伦理委员会的指南。在采集血液前，必须从患者或健康志愿者处获得知情同意。本方案已获该机构人体研究伦理委员会批准，并根据该机构关于动物护理和使用的指南进行。

1. 外周血单个核细胞的采集、分离与扩增

  1. 外周血单个核细胞（PBMNCs）的采集
    1. 使用含肝素钠抗凝剂的采血管，通过静脉穿刺采集供体外周静脉血10–20 mL。
      注意：血液样本应于室温（RT）保存或运输，并在24小时内处理。
  2. 培养基的制备
    1. 通过混合以下组分制备无血清培养基（SFM）：245 mL Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）、240 mL Ham’s F-12培养基、5 mL 胰岛素-转铁蛋白-硒-X添加剂（ITS-X）、5 mL 100倍谷氨酰胺储备液（材料表）、5 mL 化学成分明确的脂质浓缩液、2.5 g 胎牛血清、0.025 g 抗坏血酸和9 μL 1-巯基甘油。过滤培养基后于4 °C保存。
      注意：抗坏血酸和1-巯基甘油经皮肤接触或吸入具有毒性。
    2. 为制备单个核细胞（MNC）培养基，在SFM中添加以下成分：10 ng/mL人白细胞介素3（IL-3）、2 U/mL促红细胞生成素（EPO）、100 ng/mL人干细胞因子（SCF）、40 ng/mL人胰岛素样生长因子1（IGF-1）、100 μg/mL全转铁蛋白和1 μM地塞米松。过滤后于4 °C保存。
      注意：应在使用前立即配制该培养基。
  3. 外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离
    1. 使用前对超净工作台进行紫外线灭菌。用75%酒精对所有表面和设备进行消毒。所有枪头均需通过高压灭菌器灭菌。
    2. 将外周血（PB）转移至50 mL锥形管中，并用等体积的无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS）稀释。
    3. 在另一支50 mL锥形管中加入15 mL灭菌的密度梯度介质（材料表）。
      注意：为提高PBMNCs的分离效率，应将密度梯度介质和外周血保持在室温。
    4. 将装有密度梯度介质的锥形管倾斜至45°角，然后缓慢而小心地将30 mL稀释后的外周血沿管壁加入，使其覆盖在密度梯度介质上层。
      注意：操作时应谨慎，使血液沿管壁缓慢流下，避免破坏界面。红细胞将沉降至管底。倾斜操作时应小心，以尽量减少对分层界面的扰动。
    5. 将离心管在室温下以800 × g离心15分钟，离心机刹车设置为"关闭"状态。吸除上层黄色血浆层并弃去。然后用10 mL移液器将含有单个核细胞（MNCs）的白色云雾状薄层转移至新的50 mL锥形管中。
      注意：关闭离心机制动装置对MNCs的分离至关重要。
    6. 向含有MNCs的管中加入30 mL D-PBS，于4 °C以600 × g离心10分钟。弃去上清液，再加入45 mL D-PBS重悬细胞。随后于4 °C以400 × g离心10分钟。
      注意：此步骤及后续所有离心步骤中，离心机制动装置应处于开启状态。由于细胞沉淀较致密，可先加入1–2 mL D-PBS轻柔重悬沉淀，再补加D-PBS至45 mL。
    7. 弃去上清液，用5 mL D-PBS重悬细胞，并采用台盼蓝排斥法计数活细胞。
    8. 将用于扩增的MNCs保留后，其余细胞加入冻存液（材料表）中，每管1 mL，至少可冻存5 × 106个MNCs，以备后续使用。
      注意：本实验流程可在此处暂停。
  4. MNCs的扩增
    1. 第-14天：将MNCs以每毫升2–3 × 106个细胞的密度接种于6孔板的一个孔中，加入1.5 mL预热（37 °C）的MNC培养基。于37 °C、5% CO2条件下培养2天。
    2. 第-11天：用无菌移液器收集细胞和培养基，转移至新的15 mL锥形管中。于室温下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，用1 mL预热（37 °C）的MNC培养基重悬细胞。
    3. 用台盼蓝染色法计数活细胞。将MNCs以每毫升1 × 106个细胞的密度接种于预热的MNC培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养3天。
      注意：第-11天时，细胞总数可能有所减少。
    4. 第-8天：重复步骤1.4.2–1.4.3，继续培养3天。
    5. 第-4天：再次重复步骤1.4.2–1.4.3，继续培养3天。
      注意：经过14天培养后，培养体系中应保留相等或更多的MNCs数量。

2. 通过SeV感染将PBMNC重编程为iNSC

  1. 溶液与培养基的制备
    1. 通过将100 mg聚-D-赖氨酸（PDL）溶于100 mL H2O中，配制浓度为1 mg/mL的PDL储备液。分装为1 mL每份，于-20 °C保存。
    2. 通过将100 mg胰岛素溶于20 mL 0.01 N HCl中，配制浓度为5 mg/mL的胰岛素储备液。分装为1 mL每份，于-20 °C保存。
    3. 配制200 mL iNSC基础培养基时，将96 mL DMEM-F12和96 mL基础培养基（材料表）混合，加入2 mL 100倍谷氨酰胺储备液、2 mL非必需氨基酸（NEAA）、2 mL N2补充剂和2 mL B27补充剂。使用前加入10 ng/mL重组人白血病抑制因子、3 μM CHIR99021和2 μM SB431542。过滤培养基后于4 °C保存。
      注意：请在两周内使用该培养基。使用前立即加入重组人白血病抑制因子、CHIR99021和SB431542。
  2. 通过SeV感染将PBMNC重编程为iNSC
    1. 使用前，用紫外线对洁净工作台进行灭菌。用75%酒精对所有表面和设备进行消毒。所有枪头需经高压灭菌处理。
    2. 第0天，收集MNC培养基中的细胞，转移至15 mL锥形管中。以200 × g离心5分钟。吸除上清液，用1 mL预热的MNC培养基重悬细胞。
    3. 用台盼蓝计数活细胞。将细胞用预热（37 °C）的MNC培养基重悬，调整浓度为每孔2 × 105个细胞，接种于24孔板中。
    4. 从-80 °C取出SeV管后，将其在37 °C水浴中解冻5–10秒，随后在室温下继续解冻。解冻完成后立即置于冰上。
    5. 向各孔加入编码人Klf4, Oct3/4, SOX2和c-MyC的SeV，感染复数（MOI）为10。将细胞连同培养板以1,000 × g离心30分钟，以促进细胞贴附。保留孔中培养基和细胞，将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中。
      注意：所有涉及SeV的操作必须在生物安全柜中进行，所有枪头和离心管在丢弃前需用乙醇或次氯酸钠处理。
    6. 第1天，将培养基和细胞转移至15 mL离心管中。用1 mL MNC培养基冲洗孔壁。将细胞悬液以200 × g离心5分钟。吸除上清液，用500 μL新鲜预热的MNC培养基重悬细胞，接种于24孔板中。
      注意：使用低吸附性24孔板，以防止细胞在接种至PDL/层粘连蛋白包被板前发生贴附。
    7. 第2天，将1 mL 1 mg/mL PDL用19 mL D-PBS稀释至50 μg/mL。用50 μg/mL PDL在室温下包被6孔板，至少2小时。
    8. 将200 μL 0.5 mg/mL层粘连蛋白用20 mL D-PBS稀释至5 μg/mL。吸除6孔板中的PDL溶液，在垂直洁净工作台上晾干。
    9. 用5 μg/mL层粘连蛋白包被6孔板，37 °C孵育4–6小时。使用前用D-PBS洗涤。
    10. 第3天，将步骤2.2.6获得的转导细胞接种于PDL/层粘连蛋白包被的6孔板中，使用iNSC培养基。
      注意：细胞接种至PDL/层粘连蛋白包被板后，如需移动培养板，应轻柔操作，避免干扰细胞贴附。
    11. 第5天，向6孔板每孔轻柔加入1 mL预热（37 °C）的iNSC培养基。
      注意：此时细胞将经历显著死亡（>60%）。
    12. 第7天，向6孔板每孔轻柔加入1 mL预热（37 °C）的iNSC培养基。
    13. 从第9天至第28天，每天更换为新鲜预热（37 °C）的iNSC培养基。观察iNSC克隆的出现。约2–3周后挑取并转移iNSC克隆进行扩增。使用烧制的玻璃移液管挑取具有适当形态的克隆，排除可能的污染细胞，并用200 μL枪头吸出克隆。
      注意：特征明确的iNSC可冻存以备将来使用，每管含2–5个克隆。冻存液由无血清基础培养基（材料表）与二甲基亚砜按9:1比例混合而成，应在使用前立即配制。本实验方案可在此处暂停。

3. 将iNSCs分化为多巴胺能神经元

  1. 溶液与培养基的制备
    1. 通过将192 mL DMEM-F12、2 mL 100x 谷氨酰胺储备液、2 mL NEAA、2 mL N2添加剂和2 mL B27添加剂混合，配制200 mL iNSC分化基础培养基。
      注意：请在2周内使用该培养基。
    2. 在iNSC分化基础培养基中添加1 μM SAG1和100 ng/mL FGF8b，制备iNSC分化第一阶段培养基。
      注意：请在2周内使用该培养基。
    3. 在iNSC分化基础培养基中添加0.5 mM环磷酸腺苷（cAMP）、0.2 mM抗坏血酸、10 μM DAPT、10 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）、10 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和1 ng/mL转化生长因子βIII（TGF-βIII），制备iNSC分化第二阶段培养基。
      注意：请在2周内使用该培养基。
  2. 包被培养皿
    1. 使用前对洁净工作台进行紫外线灭菌。用75%酒精对所有表面和设备进行消毒。所有枪头需经高压灭菌处理。
    2. 进行PDL包被时，至少在细胞传代前一天，将1 mL 1 mg/mL的PDL用19 mL D-PBS稀释至50 μg/mL。将经75%酒精灭菌的12 mm玻璃盖玻片置于24孔板中，加入50 μg/mL PDL溶液，在室温下包被至少2小时。
    3. 进行层粘连蛋白（laminin）包被时，将200 μL 0.5 mg/mL的层粘连蛋白用20 mL D-PBS稀释至5 μg/mL。吸除PDL溶液，并在洁净工作台中将孔内干燥。加入5 μg/mL层粘连蛋白溶液包被12 mm盖玻片，37 °C孵育4–6小时。使用前用D-PBS洗涤。
  3. 传代细胞以进行分化。
    1. 当培养的iNSCs融合度达到70–90%时，吸除培养板中的培养基，加入1 mL D-PBS洗涤细胞。每孔加入1 mL预热（37 °C）的细胞解离试剂（材料表），37 °C孵育3分钟以解离细胞。
    2. 孵育3分钟后，细胞呈半悬浮状态；每孔加入3 mL预热（37 °C）的DMEM-F12培养基，反复吹打使细胞团解离为单细胞。
    3. 将细胞转移至15 mL锥形管中，250 × g离心3分钟。吸除上清液，根据细胞数量用适量预热（37 °C）的iNSC培养基重悬细胞。
    4. 采用台盼蓝排斥法计数细胞。每12 mm玻璃盖玻片接种5 × 103个细胞于24孔板中，37 °C、5% CO2条件下培养。
  4. 将iNSCs分化为多巴胺能神经元。
    1. 细胞接种至PDL/层粘连蛋白包被的盖玻片后24小时开始分化。吸除培养基，用D-PBS洗涤细胞一次，每孔加入600 μL预热的分化第一阶段培养基（24孔板），37 °C、5% CO2条件下培养。
    2. 在分化的第一阶段（第1天至第10天），每天更换一次培养基。
    3. 第10天，吸除培养基，用D-PBS洗涤细胞一次。每孔加入600 μL预热（37 °C）的分化第二阶段培养基（24孔板），37 °C、5% CO2条件下培养。
    4. 在分化的第二阶段（第11天至第25天），每隔一天更换一次培养基。可在不同时间点用多聚甲醛固定分化细胞以进行分析。
    5. 进行免疫荧光染色时，在分化第11至25天的选定时间点，用D-PBS轻柔洗涤细胞三次。
    6. 将300 μL非离子型表面活性剂（材料表）加入100 mL PBS中，配制成含0.3%非离子型表面活性剂的PBS溶液。
      注意：非离子型表面活性剂经皮肤接触或吸入具有毒性。
    7. 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，然后用含0.3% 的PBS洗涤三次。
      注意：多聚甲醛经皮肤接触或吸入具有毒性。
    8. 用3%驴血清在室温下封闭细胞2小时。
    9. 将一抗用1%驴血清按适当浓度稀释，轻柔吹打混匀。每孔加入300 μL一抗溶液，4 °C孵育过夜。用含0.3%非离子型表面活性剂的PBS洗涤细胞三次。
    10. 将二抗用1%驴血清按适当浓度稀释，轻柔吹打混匀。每孔加入300 μL二抗溶液，在室温下避光孵育2小时。
    11. 用含0.3%非离子型表面活性剂的PBS洗涤细胞三次。将4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用PBS按1:500稀释。每孔加入300 μL稀释后的DAPI溶液，在室温下避光孵育15分钟。再用含0.3%非离子型表面活性剂的PBS洗涤三次。
    12. 用镊子轻柔取出盖玻片，室温避光干燥过夜。置于荧光显微镜下观察并封片。

4. 建立单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病小鼠模型

  1. 为进行细胞移植，使用体重为20-25 g的成年雄性SCID-beige小鼠制备帕金森病（PD）小鼠模型，并对其进行6-OHDA注射。
  2. 手术用药准备
    1. 将0.2 g抗坏血酸溶解于100 mL无菌生理盐水（0.9%）中，配制0.2%抗坏血酸溶液，并于-80 °C保存备用。手术当天，将0.2%抗坏血酸溶液稀释10倍，得到0.02%抗坏血酸溶液。
      注意：添加抗坏血酸是为了防止6-OHDA氧化为无活性形式。
    2. 配制6-OHDA溶液时，称取适量6-OHDA加入无菌1 mL离心管中，加入适量0.02%抗坏血酸溶液，配制成5 μg/μL的6-OHDA溶液。涡旋混合至完全溶解。将6-OHDA溶液置于冰上避光保存，直至使用。
      注意：6-OHDA对温度和光照敏感。使用前应避免光照并始终保持在冰上。
  3. 手术前通过高压灭菌法准备无菌手术器械。安装立体定位仪时，使用乙醇清洁所有器械和操作表面。在加热灯下设置小鼠恢复笼。
  4. 进行手术以建立单侧6-OHDA损毁的小鼠模型。
    1. 称量每只小鼠体重，记录数据并计算所需给药剂量。每只小鼠在手术前20分钟接受0.5 mg/kg的阿托品腹腔注射。
    2. 通过腹腔注射给予0.5 mg/kg阿托品。
    3. 在给予阿托品20分钟后，通过腹腔注射给予80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪以麻醉小鼠。
    4. 将小鼠放入密闭麻醉舱中。3-5分钟后，小鼠将进入深度麻醉状态，对后肢夹捏无反应。
      注意：接受麻醉的小鼠可能会经历一段兴奋期，此为正常现象。
    5. 剃除小鼠头部毛发，并在其眼睛上涂抹红霉素眼膏，以预防角膜溃疡。
    6. 将小鼠固定于立体定位仪上。首先使用门齿杆固定小鼠头部，正确插入耳棒，使小鼠头部保持水平且稳固。
    7. 使用聚维酮碘和异丙醇对小鼠头部进行消毒。用手术刀在颅骨表面做一条矢状切口（约1.5 cm），暴露颅骨。调节门齿杆和耳棒，使前囟（bregma）与后囟（lambda）之间的高度差小于0.1 mm。
      注意：小鼠前囟位于冠状缝与矢状缝的交点，后囟位于人字缝与矢状缝的交点。
    8. 缓慢移动并降低针尖至前囟位置，并将前囟设为零点。将针尖移至相对于前囟A/P +0.5 mm、M/L -2.1 mm的坐标位置。回撤针尖并标记该点，在颅骨上钻一小孔。
    9. 用微量注射器吸取2 μL浓度为5 μg/μL的6-OHDA溶液（材料表）。将针头重新定位至标记点，并插入至D/V -3.2 mm深度。
    10. 以1 μL/min的速度注射2 μL浓度为5 μg/μL的6-OHDA溶液（总量10 μg）。注射完成后，留针5分钟，然后缓慢撤出注射针头。
    11. 用缝线闭合切口，并在小鼠眼睛上涂抹红霉素眼膏。皮下注射0.5 mL生理盐水以防止脱水，并将抗生素软膏直接涂抹于缝合部位皮肤。
    12. 将小鼠从立体定位仪中取出，放入恢复笼中。待其恢复意识前，提供食物和饮水。术后每日在饮水中添加镇痛药物，持续2-3天，推荐布洛芬剂量为每日0.03 mg/g体重。
    13. 术后每日观察小鼠状况。

5. 单侧6-OHDA损毁后的行为学评估

  1. 手术后两到三周，进行行为学评估以评估帕金森病症状。称量每只小鼠的体重，记录体重并计算所需给药剂量（评估前给予0.5 mg/kg的阿扑吗啡）。
  2. 在评估前通过皮下注射给予0.5 mg/kg的阿扑吗啡，并将小鼠放入玻璃圆筒中。
  3. 经过5分钟的适应期后，记录每分钟相对于损伤侧的对侧和同侧旋转次数，并用摄像机记录其活动情况。
  4. 对侧旋转次数减去同侧旋转次数大于>7转/分钟的小鼠被视为造模成功，可作为细胞移植实验的候选动物。休息30分钟后将小鼠放回饲养笼中。
    注意：若小鼠造模成功，注射6-OHDA后的小鼠会表现出更明显的向对侧旋转倾向，因为多巴胺受体激动剂主要激活了损伤侧去神经支配后超敏的纹状体。
  5. 在细胞移植前一周以及移植后2、4、6、8、12、16周进行行为学评估。

6. 多巴胺能前体细胞的移植

  1. 准备用于移植的细胞悬液。为进行细胞移植，将 D10 和 D13 多巴胺前体细胞按 1:7 的比例混合，取 2 × 105 个多巴胺前体细胞，重悬于 4 μL 含 5 g L-1 葡萄糖的 平衡盐溶液（材料表）移植缓冲液中。
  2. 按照第 4.4 节所述步骤进行细胞移植手术，唯一区别是用多巴胺前体细胞悬液或缓冲液替代 6-OHDA。
  3. 在多巴胺前体细胞移植后第 2、4、6、8、12 和 16 周，按照第 5 节所述步骤进行行为学评估。记录每分钟阿扑吗啡诱导的对侧（相对于损伤侧）旋转次数，并使用摄像机记录其活动情况。
    注意：移植后，对侧旋转频率降低提示运动功能有所改善。
  4. 在细胞移植后的第 4、8、12 和 16 周，对小鼠实施深度麻醉后用 4% 多聚甲醛灌流，直至小鼠身体变僵硬且肝脏变苍白。
  5. 小心分离小鼠脑组织，将脑放入 4% 多聚甲醛中，于 4 °C 过夜固定。
  6. 第二天，将脑组织转移至 30% 蔗糖溶液中脱水，直至脑组织沉入底部。
  7. 使用冷冻切片机将脑组织切成 40 μm 厚的切片。
  8. 按照步骤 3.4.5–3.4.12 中先前描述的方法进行免疫染色。

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结果

本文报道了一种用于治疗帕金森病（PD）模型的iNSC-DA细胞疗法的完整实验方案，涵盖多个不同阶段。首先，分离并扩增外周血单个核细胞（PBMNCs），并通过SeV病毒感染将其重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）。PBMNC扩增及iNSC诱导过程的示意图见图1。在第-14天，使用密度梯度介质（材料表）分离PBMNCs。离心前，将磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的血液与密度梯度介质分层，形成两层液体。离心后出现四层梯度（从底部到顶部）：底层为粒细胞和红细胞；第二层为密度梯度介质；第三层为PBMNCs（红色箭头所示）；顶层为富血小板血浆（图2A）。经过14天的扩增后，在第0天用SeV病毒感染PBMNCs。在第1天，移除含SeV的培养基（图2B）。如图2B所示，预期细胞数量逐渐减...

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讨论

本文介绍了一种针对帕金森病（PD）模型的iNSC-DA细胞治疗方案，涵盖多个阶段。该方案的关键步骤包括：（1）外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离与扩增，以及通过SeV病毒感染将PBMNCs重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）；（2）将iNSCs分化为多巴胺能（DA）神经元；（3）建立单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病小鼠模型并进行行为学评估；（4）多巴胺能前体细胞的移植及后续行为学评估。

在本实验方案中，第一部分涉及在无血清培养基（MNC培养基）中采集并扩增外周血单个核细胞（PBMNCs），该培养基优先扩增成红细胞系，且不支持淋巴细胞增殖。在以往的研究中，多种体细胞已被重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）或诱导性神经干细胞（iNSCs）12,13,14。与其他类型的体细胞相比，PBMNCs具有若干优势。其中最显著的优势是其有利的基因表达模式和表观遗传特征。PBMNCs在体内寿...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得以下基金资助：干细胞及转化医学国家重点研发计划（2016YFA0101403）、国家自然科学基金（81661130160、81422014、81561138004）、北京市自然科学基金（5142005）、北京市人才发展基金（2017000021223TD03）、北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划“十三五”时期项目（CIT & TCD20180333）、北京市卫生系统高层次人才奖励项目（2015-3-063）、北京市卫生健康委员会基金（PXM 2018_026283_000002）、北京市“百千万人才工程”项目（2018A03）、北京市医院管理局临床医学发展专项经费支持（ZYLX201706）以及英国皇家学会-牛顿高级学者基金（NA150482）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 毫升锥形管Corning430052
1-硫代甘油Sigma-AldrichM6145吸入和皮肤接触有毒
24 孔板Corning3337
50 毫升锥形管 Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6 孔板Corning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01细胞解离试剂
阿扑吗啡Sigma-AldrichA4393
抗坏血酸Sigma-AldrichA92902皮肤接触有毒 
B27 添加剂 Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02脑源性神经营养因子
含肝素钠的采血管BD367871
BSAyisheng36106es60胎牛血清
cAMPSigma-AldrichD0627二丁酰环磷酸腺苷
CellBanker 2ZENOAQ100ml用作 PBMNCs 的冷冻保存液
化学成分明确的脂质浓缩液Invitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
盖玻片Fisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
地塞米松Sigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
驴血清Jackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UG人促红细胞生成素
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077，密度梯度介质
GDNFPeprotech450-10胶质细胞源性神经营养因子
GlutaMAXInvitrogen21051024100 × 谷氨酰胺储备液
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079平衡盐溶液
人白血病抑制因子MillporeLIF1010
人重组 SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UG人胰岛素样生长因子 
IL-3Peprotech200-03-10UG人白细胞介素 3
IMDMGibco215056-023Iscove 改良杜尔贝科培养基
胰岛素Roche 12585014
ITS-XInvitrogen51500-056胰岛素-转铁蛋白-硒-X 添加剂
Knockout 血清替代物Gibco10828028无血清基础培养基
层粘连蛋白Roche 11243217001
微量注射器Hamilton7653-01
N2 添加剂 Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050非必需氨基酸
NeurobasalGibco10888基础培养基
PDLSigma-AldrichP7280聚-D-赖氨酸
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Gene Operation04-0010-10mg避光保存于 -20?
仙台病毒Life TechnologiesMAN0009378
蔗糖baiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36E转化生长因子  β?
转铁蛋白R&D Systems2914-HT-100G
吐温 X-100baiaoshengke非离子型表面活性剂
台盼蓝GibcoT10282
赛拉嗪Sigma-AldrichX1126

参考文献

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外周血单个核细胞多巴胺能神经元分化仙台病毒重编程6-羟基多巴胺损毁模型细胞移植方案酪氨酸羟化酶标记物FOXA2表达神经干细胞扩增帕金森病治疗
从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究
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