方法文章

从外周单核细胞生成诱导神经干细胞,分化至多巴胺能神经元前体,用于移植研究

DOI：

10.3791/59690

⸱

2019年7月11日

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

本文内容

摘要

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该协议提出了外周血单核细胞的重新编程,以诱导神经干细胞由仙台病毒感染,将iNSCs分化为多巴胺能神经元,将DA前体移植到单方面病变帕金森病小鼠模型,并评价iNSC衍生DA前体用于PD治疗的安全性和有效性。

摘要

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帕金森病 (PD) 是由心内脑素 (VM) 中基拉多巴胺能 (DA) 神经元的退化引起的。细胞替代疗法对PD的治疗大有希望。 最近,诱导神经干细胞(iNSCs)由于肿瘤形成的风险降低和可塑性增加而成为细胞替代治疗的潜在候选者。区域特定的神经元和胶质。iNSCs可以从自体体细胞源(如成纤维细胞、外周血单核细胞(PBMC)和各种其他类型的细胞)重新编程。与其他类型的体细胞相比,PBMC是一个有吸引力的起始细胞类型,因为易于访问和扩展的培养。仙台病毒(SeV),一种RNA非整合性病毒,编码重新编程的因素,包括人类OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC,具有负感,单链,非分段基因组,不集成到宿主基因组,但仅在受感染细胞的细胞质中复制,为重新编程提供了高效和安全的工具。在本研究中,我们描述了一种协议,其中通过重新编程PBMC获得iNSC,并通过两阶段方法分化成专门的VM DA神经元。然后DA前体被移植到单方面的6-羟基多巴胺(6-OHDA)病变PD小鼠模型中,以评估PD治疗的安全性和有效性。该方法为研究患者特异性DA神经细胞在体外和体内的功能和治疗效果提供了一个平台。

引言

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帕金森病 (PD) 是一种常见的神经退行性疾病,由心内脑素 (VM) 的底状尼格拉帕压实 (SNpc) 的多巴胺能 (DA) 神经元退化引起,60 岁以上人群的患病率超过 1%1,2.在过去十年中,细胞疗法,旨在取代退行性或受损的细胞,或滋养退化神经元周围的微环境,在PD3的治疗中显示出潜力。同时,重新编程技术也取得了显著进展,为替代疗法提供了有前途的细胞源。人类诱导多能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs)已被证明能够分化成DA神经细胞,当移植到大鼠和非人类灵长类动物PD模型中时,这些神经细胞可以存活、成熟,并改善运动功能5 ,6,7,8.iPSC是细胞再编程技术的一个里程碑,在细胞移植方面有着巨大的潜力;然而,人们仍然担心肿瘤从不完全分化的细胞形成的风险。细胞移植的替代细胞来源是通过直接重新编程获得的系世型成人干细胞,如诱导神经干细胞(icCS),可以从不稳定的中间体中提取,绕过多能性阶段9,

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方案

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所有程序都必须遵守机构人类研究伦理委员会的指导方针。采血前必须征得患者或健康志愿者的知情同意。该协议由该机构的人类研究伦理委员会批准,并根据该机构的虐待和使用动物指南执行。

1. PBMC的收集、隔离和扩展

  1. PBMC 的收集
    1. 收集10-20 mL的供体的外周静脉血,用肝素钠防腐剂小瓶进行静脉穿刺。
      注:血液样本应在室温(RT)下储存或运送。在24小时内处理血液样本。
  2. 培养媒介的准备
    1. 通过组合以下成分制备无血清介质(SFM):245 mL 的 Iscove 改良 Dulbeco 介质 (IMDM),240 mL 的火腿的 F-12,5 mL 的胰岛素转移素-硒-X 补充剂 (ITS-X),5 mL 的 100x 谷氨酰胺库存溶液(表材料),5 mL化学定义的脂精,2.5克胎儿牛血清,0.025克抗坏血酸和9μL的1-硫甘油。过滤介质并将其存储在 4°C。
      注意:抗坏血酸和1-硫甘油对皮肤接触和吸入有毒。
    2. 要制备单核细胞(MNC)介质,补充SFM介质10纳克/mL人白细胞介素3(IL-3),2 U/mL红细胞生成素(EPO),100纳克/mL人类干细胞因子(SCF),40纳克/mL人类胰岛素样生长因子1(IGF-1),100微克/mL霍洛转移素....

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结果

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在这里,我们报告一个协议,涵盖iNSC-DA细胞治疗的不同阶段,以治疗PD模型。首先,对PBMC进行分离和扩展,并通过SeV感染重新编程为iNSC。图1显示了使用PBMNC扩展和iNSC感应的过程的示意图。在-14日,使用密度梯度介质(材料表)对PBMC进行隔离。离心前,用PBS稀释的血液和密度梯度介质被分成两层。离心后,出现四个梯度层(从下到上):底层包含粒细胞和红细胞;第二层包含密度梯度介质;第三个包含PBMC(红色箭头);顶层包含富含血小板的等离子体(图2A)。经过14天的扩展,PBMC在0日感染了SeV。第 1 天,使用 SeV 的介质被移除 (图 2B)。如图2B所示,预计细胞数量会逐渐减少。细胞严重死亡(>60%)直到第5天(

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讨论

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在这里,我们提出了一个协议,涵盖了PD模型的iNSC-DA细胞治疗的不同阶段。该协议的关键方面包括:(1) PBMC 的隔离和扩展,以及通过 SeV 感染将 PBMC 重新编程到 iNSC;(2) 将 iNSC 分化为 DA 神经元,(3) 建立单方面 6-OHDA 病变 PD 小鼠模型和行为评估,以及(4)DA前体的细胞移植和行为评估。

在此协议中,第一部分涉及在无血清介质(MNC介质)中收集和扩展PBMC,该介质优先扩展红细胞,不支持淋巴细胞增殖。在以前的研究中,几种体细胞类型被重新编程为iPSC或iNSCs12,13,14。与其他类型的体细胞相比,PBMC具有若干优点。最显著的优势是它们有利的基因表达模式和表观遗传特征。PBMC 在体内寿命短,经常从活化造血干细胞补充,并且可能比皮肤成纤维细胞积累更少的突变。此外,对PBMC的采样方法比对成纤维细胞的侵入性要小,并且需要更短的时间来扩展PBM.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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该课题资助项目为:干细胞与翻译国家重点项目(2016YFA0101403)、国家自然科学基金(81661130160、81422014、81561138004)、北京市自然科学基金(5142005)、北京人才基金会(201700021223TD03),北京市"十三五"期间高层次人才资助项目(CIT&TCD20180333),北京医疗系统高层次人才奖(2015-3-063),北京市卫生局基金(PXM 2018_026283_000002)、北京市百千人才基金(2018A03)、北京市医院临床医学发展专项资金支持(ZYLX201706)和皇家学会-牛顿高级奖学金(NA150482)。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 ml 锥形管Corning430052
1-硫代甘油Sigma-AldrichM6145对吸入和皮肤接触有毒
24 孔板Corning3337
50 ml 锥形管 康宁430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6 孔板康宁3516
AccutaseInvitrogenA11105-01细胞解离试剂
阿扑吗啡Sigma-AldrichA4393
抗坏血酸Sigma-AldrichA92902皮肤接触有毒 
B27 补充剂 Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02脑源性神经营养因子
含有肝素钠BD367871
BSA益生36106es60胎牛血清
cAMPSigma-AldrichD0627二丁酰腺苷环磷酸
CellBanker 2ZENOAQ100ml用作 PBMNCs 的冷冻培养基
化学定义的脂质浓缩Invitrogen11905031
CHIR99021基因作04-0004
盖玻片Fisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
地塞米松Sigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
驴血清Jackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UG人促红细胞生成素
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077，密度梯度培养基
GDNFPeprotech450-10神经胶质衍生神经营养因子
GlutaMAXInvitrogen21051024100 &谷氨酰胺储备液
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079平衡盐溶液
人白血病抑制因子MillporeLIF1010
人重组 SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UG人胰岛素样生长因素 
IL-3Peprotech200-03-10UG人白细胞介素 3
IMDMGibco215056-023Iscove 改良的 Dulbecco 培养基
罗氏胰岛素 
ITS-XInvitrogen51500-056胰岛素-转铁蛋白-硒-X 添加剂
基因敲除血清替代物Gibco10828028无血清基础培养基
层粘连蛋白Roche 
MicrosyringeHamilton7653-01
N2 补充剂 Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050非必需氨基酸
NeurobasalGibco10888碱性培养基
PDLSigma-AldrichP7280多聚-D-赖氨酸
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542基因作04-0010-10mg避光储存在 -20 度？
仙台病毒Life TechnologiesMAN0009378
蔗糖baiaoshengke
TGFβ？Peprotech100-36E转化生长因子  β？
转铁蛋白R&D Systems2914-HT-100G
Triton X 100百奥盛科非离子表面活性剂
台盼蓝GibcoT10282
甲苯噻嗪Sigma-AldrichX1126
的采血管 物 1258501411243217001

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to m....

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