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方法文章

使用电压敏感性染料在脑片中进行全场单光子光学记录

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DOI：

10.3791/59692

⸱

2019年6月20日

 ,  ,  , 
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

本文内容

摘要

我们介绍了一种使用电压敏感染料对脑片进行可重复且稳定的光学记录方法。本文描述了利用常规海马脑片制备技术进行电压敏感染料染色及光学信号记录的过程。

摘要

全视野单光子电压敏感染料（VSD）成像技术是评估神经回路功能连接性的有效工具。由于光信号的变化幅度较小，该方法以往难以作为定量分析手段使用。本文介绍了一套特殊的光学系统和脑片处理装置，使该技术变得稳定且可靠。文章详细演示了染色后海马脑片的制备、染色及记录过程。该系统能够长时间维持脑片的生理状态，实现良好的染色效果，并防止记录过程中脑片发生机械性位移。此外，该系统可在使用极少量染料的情况下完成脑片染色。光学系统在低放大倍数下实现了高数值孔径，可在100像素 × 100像素的空间分辨率下以最高10 kHz的帧率记录VSD信号。得益于高帧率和高空间分辨率，该技术可应用记录后的滤波处理，从而获得足够的信噪比，用于评估神经回路中的动态变化。

引言

宽场单光子电压敏感染料（VSD）成像技术已成为定量评估整体染色脑片制备中神经回路动态的有用工具1,2,3,4。在分析了膜兴奋引起的光学特性变化之后5,6,7，VSD成像技术于20世纪70年代初由Cohen等人首次描述6,8,9。该方法适用于实时监测脑功能，因为染料可直接探测膜电位变化（即神经元的主要信号）。

最早的电压敏感染料（VSD）具备理解脑系统的理想特性，例如具有快速的时间常数，能够追踪神经元膜电位变化的快速动力学过程，并且膜电位变化与信号之间具有良好的线性关系9,10,11,12,13,14,15。与其他成像实验类似，该技术需要对相机、光学系统、软件以及脑片生理状态等多个参数进行广泛而精确的优化，才能获得理想的结果。由于这些技术难点的存在，最初尝试该技术的大多数非专业实验室并未实现预期的成果。

造成该技术难题的根本原因是，当电压敏感染料（VSD）用于脑片标本的整体染色时，其对膜电位变化的灵敏度较低。在生理条件下，光学信号（即荧光的相对变化量）的幅度通常仅为对照信号（F0）的10-4至10-3。神经元膜电位变化的时间尺度约为数毫秒至数百毫秒。为了测量神经元膜电位的变化，用于记录的相机必须能够以高速（10 kHz至100 Hz）采集图像。由于VSD的灵敏度较低，且需要高速追踪神经信号，因此要求在高速成像的同时，相机收集到足够强的光信号，并具有较高的信噪比（S/N）2,16。

记录系统的光学器件也是确保收集足够光信号并提高信噪比的关键因素。光学系统实现的放大倍数通常过低，例如1X到10X，难以清晰观察局部功能神经回路。例如，若要观察海马体回路的动态变化，约5倍的放大倍数较为合适。然而，如此低的放大倍数荧光效率较低，因此，采用先进的光学系统将有利于此类记录。

此外，切片的生理状态也至关重要。由于成像分析要求切片保持完整，因此需要谨慎操作切片17。此外，采取措施以更长时间地维持切片的活性也非常重要18。

本文描述了脑片制备、电压敏感染料（VSD）染色及测量的实验方案。同时概述了对电压敏感染料、成像设备和光学系统等方面的改进，以及其他对实验系统的进一步优化，这些改进使得该方法成为一种简便、强大且可定量的手段，用于可视化观察脑功能的改变19,20,21,22,23,24,25。该技术也可广泛应用于海马脑片CA1区的长时程增强（LTP）研究1。此外，该技术还可用于单个神经元膜电位的光学记录26。

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方案

所有动物实验均按照德岛文理大学动物护理与使用委员会批准的方案进行。以下脑片制备方案几乎为标准操作流程27，但对VSD染色与记录的方案进行了修改。

1. 实验前的准备工作

  1. 配制储备液 A（表 1）、储备液 B（表 2）和储备液 C（表 3），并储存于冰箱中。
  2. 配制 1 L 人工脑脊液（ACSF）（表 4，见步骤 3），并保存在冰箱中。
  3. 配制 1 L 改良 ACSF（表 5），并保存在冰箱中。
  4. 将胎牛血清（FBS）以 500 µL 分装至 2 mL 瓶中，储存于冷冻柜中。
  5. 在微波炉中将 4% 琼脂粉溶解于 ACSF（约 120 mL）中，并倒入一次性 90 mm 培养皿中。琼脂平板在进一步使用前应冷藏。
  6. 在实验前一天将以下物品放入冷冻柜：手术托盘、切片容器和铝制冷却块（120 × 120 × 20 mm3）。
  7. 确保有足够的带膜滤器的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）环，用于切片处理系统17,28（见步骤 6.12）。
  8. 在微波炉中将 2% 琼脂粉溶解于 50 mL 3 M KCl 溶液中。使用移液器吸取约 85 µL 温热的琼脂-KCl 溶液至 200 µL 吸头中，用于接地电极。将吸头插入仍处于温热状态的 3 M KCl 琼脂凝胶中。重复此步骤，制备约 20–40 个含 2% 琼脂的吸头。

2. VSD（di-4-ANEPPS）储备液的制备

  1. 用超纯水配制1 mL的10%聚氧乙烯化蓖麻油溶液。
  2. 向一支含二-4-ANEPPS（5 mg/瓶）的小瓶中加入1 mL乙醇，涡旋混匀并超声10分钟。溶液将变为深红色，可能残留少量二-4-ANEPPS晶体。
    注意：此步骤中使用的乙醇应为新开封的。
  3. 将溶液转移至带O型圈的2 mL微量离心管中，离心沉淀后加入500 µL 10%聚氧乙烯化蓖麻油溶液。
    注意：该染料具有高度亲脂性。DMSO和泊洛沙姆也可用于溶解二-4-ANEPPS，但在膜电位变化引起的光学信号方面，我们发现乙醇-聚氧乙烯化蓖麻油体系具有更高的信噪比。这可能与溶剂向细胞膜的转移速率有关。
  4. 涡旋并超声至染料完全溶解。
  5. 避免光照，置于冰箱中保存，切勿冷冻。储备液可保存数月。
    注意：实验当天，请按步骤3-9进行操作。

3. ACSF 的每日配制（1 L）（表 4）

  1. 在烧瓶中称取 NaCl、NaHCO3 和葡萄糖。
  2. 向烧瓶中加入 950 mL 蒸馏水，并开始用 95% O2/5% CO2 气体通气。
  3. 向烧瓶中加入 2.5 mL 储存液 A，室温下孵育约 10 分钟。
  4. 向烧瓶中加入 2.5 mL 储存液 C。
  5. 加入蒸馏水定容至 1 L。

4. 染色VSD溶液的每日配制

  1. 将500 µL的FBS和VSD储备液（步骤2）置于超声波破碎仪中，超声处理5分钟。
  2. 向FBS小瓶中加入500 µL freshly prepared ACSF。
  3. 向小瓶中加入20 µL（小鼠）或40 µL（大鼠）的VSD储备液。
  4. 对小瓶进行超声处理并涡旋振荡，直至溶液变为淡橙色。

5. 手术准备

  1. 分别取 100 mL 冰冷的 ACSF 置于一个 300 mL 不锈钢容器、一个 300 mL 烧杯和一个塑料容器中，并放入冰箱冷冻。另取 150 mL 冰冷的改良 ACSF（表 2）倒入另一个烧杯中，也放入冰箱冷冻。等待溶液冷却；所需时间应事先测量并确定。
  2. 将剃刀刀片（碳钢，工业级，厚度 0.13 mm，双面刃）对折，用于切片机。
    注意： 另一半刀片可在合适的刀片夹持器中用于解剖。
  3. 使用调节夹具从 ACSF 4% 琼脂平板上制备琼脂块（图 1）。
  4. 准备一个湿润的孵育室（界面型孵育室；经改良的 1.2 L 密封盒，配有硅胶密封圈），用于维持脑片的生理活性（图 2）；在小容器中加入 ACSF，并用 95% O2/5% CO2 气体碳酸化，再将 ACSF 加满至一个 90 mm × 20 mm 的培养皿中。
    注意： 应将一个较小的培养皿（60 mm × 20 mm）置于 90 mm 培养皿中央，以支撑其上的滤纸。
  5. 将盒子放在加热装置上，等待 20 分钟，使其升温至 28 ˚C。
  6. 将碎冰加入切片机的容器中。将以下器械置于一个小型不锈钢容器内并置于冰上：手术刀、刀片夹持器、环形镊子、琼脂块以及切片机载物台。将冷冻的 ACSF 和改良 ACSF 置于冰上，并用 95% O2/5% CO2 气体（又称碳合气）持续通气。
  7. 将以下器械置于一个较大的容器中：剪刀（大、小号）、镊子、刮勺、勺子和斜口钳。

6. 手术（小鼠）

  1. 在通风橱中使用异氟烷麻醉小鼠。通过轻捏脚趾并检查动物的足底反射来评估麻醉深度。
  2. 将小鼠断头，并将其头部浸入不锈钢手术托盘中的冰冻人工脑脊液（ACSF）中。
  3. 在1分钟内取出脑组织，放入盛有冷ACSF的烧杯中，浸泡5分钟。
  4. 将脑组织从烧杯中取出，使用解剖刀修整脑块（图3A）。
  5. 将脑块放置于4%琼脂块上（步骤5.3，图3B）。两个半球均可固定在同一个琼脂块上。用滤纸擦去脑块表面多余的ACSF。
  6. 在切片台上涂抹少量黏合剂（速干胶）。将琼脂块置于其上，并用滤纸擦去多余的黏合剂。
  7. 使用移液器从脑-琼脂复合体顶部轻轻加入少量冰冻ACSF（约5 mL）。这有助于固化多余的速干胶，防止胶水覆盖脑组织并干扰切片过程。
  8. 将切片台固定到切片槽中（图3C），然后倒入改良型ACSF。
  9. 将切片机设置为低速运行，刀片频率调至最大。
  10. 设定切片厚度为350–400 µm，并开始切片（图3C）。将切片按顺序放置在切片槽的一角，以便于区分各切片的深度。通常每个半球可获得三至五片切片。
  11. 使用30 G针头切除脑干部分（图3D）。
    注意：如有需要，此时可在双目显微镜下对脑切片进行显微手术操作，例如在CA3与CA1边界之间进行切割。
  12. 使用细头小画笔将切片转移至由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）环固定的膜滤器中央（孔径0.45 µm，PTFE膜，直径13 mm）17（外径15 mm，内径11 mm，厚度1 mm，图3E）。将该环置于湿润恢复室中（图2），并盖紧盖子以维持内部高湿度。
    注意：切片将在30分钟内牢固黏附于滤膜上，后续在记录室中的操作可直接连同环一起处理，无需使用重物或其他固定措施来固定切片。
  13. 调整切片在环内的方向和位置，确保其居中且方向一致（参见步骤9.3）。
  14. 将样本在28 °C条件下放置30分钟，随后在室温下继续恢复至少10至30分钟。
    注意：此时切片可在良好生理状态下维持至少15小时。

7. 切片染色与漂洗（小鼠）

  1. 使用微量移液器将100–110 µL染色液（步骤4制备）轻柔地滴加到环上的每个切片上。步骤4制备的一份染色液可对8至9个切片进行染色。染色孵育20分钟。
  2. 在容器中准备50–100 mL人工脑脊液（ACSF），并将带有切片的环放入其中，以洗去染色液。
  3. 将清洗后的切片转移至另一个孵育 chamber 中。实验前至少静置1小时以恢复状态。
    注意：孵育 chamber 可从供气装置上拆下，并在密封良好的条件下转移至记录位置。切片在无供气的情况下仍可保持活性至少20分钟。若需将切片转移至其他位置进行记录，此特性非常有用。

8. 实验仪器的每日准备

  1. 打开放大器、计算机和相机系统，并检查软件是否正常运行。
  2. 将ACSF放入50 mL离心管中，并用碳氧混合气（carbogen）持续通气。
  3. 使用蠕动泵循环ACSF，调节流速至约1 mL/min。
  4. 调节吸液移液管的高度，使实验腔室内的液面始终保持恒定。
    注意：溶液液面高度对于获得稳定的记录至关重要，因此应使用显微操作器进行精确调节。
  5. 将由黄色芯片制成并填充含3 M KCl的2%琼脂（步骤1.8）的接地电极安装至带有银-氯化银（Ag-AgCl）导线及少量3 M KCl溶液的电极夹中。
  6. 使用锥形细管黄色吸头，向玻璃电极（外径1 mm，内径0.78 mm，用微电极拉制仪拉制而成）中加入少量ACSF（约为总体积的三分之二），并将电极置于电极夹中。
  7. 将电极夹固定在操纵器的金属杆上。通过放大器检测，确保电极电阻约为1 MΩ。
    注意：长柄、大开口（4–8 µm开口）的膜片钳电极适用于场电位记录及作为刺激电极。

9. 开始记录会话

  1. 用镊子从湿润室中取出切片样本。
  2. 迅速将切片置于显微镜下的实验腔室中（图4）。
  3. 将环的边缘牢固地压入硅胶O型圈中。注意不要损坏膜或实验腔室的底部。
    注意：应考虑切片方向与视野中刺激电极和记录电极方向的对应关系。健康的切片应能自然贴附于膜滤器上，因此无需使用其他固定装置（如重物或尼龙网）来固定切片。
  4. 在透射光下，通过显微镜将刺激电极和场电位记录电极的尖端放置于切片上。
  5. 使用电生理记录系统检查反应。确认在给定配置下获得正常的（未染色）电生理记录。
    注意：记录电极可省略，但有助于检测切片的生理状态。
  6. 调整激发光强度至相机最大容量的约70–80%，当以10 kHz采样频率、5倍水浸物镜和1倍PLAN APO管镜进行成像时，样品处的光强对应为13–15 mW/cm2。激发光波长为530 nm，发射滤光片必须为> 590 nm。
    注意：使用快门以最小化激发光照射量。持续光照可能损害切片的生理活性。光的潜在有害效应取决于其强度和照射时间。可通过电生理记录评估光照的影响。在13–15 mW/cm2强度下，约1秒的照射时间应为耐受上限。
  7. 使用荧光光源并通过采集系统调整焦距，因为不同波长下的焦平面可能有所差异，随后开始图像采集。
  8. 在图像采集软件中检查数据。
    注意：我们使用数值分析软件的自定义微程序包进行详细分析。

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结果

图5 显示了在小鼠海马脑片CA1区施加对Schaffer侧支电刺激后典型的光学信号。图5A 中连续的图像展示了未施加任何空间和时间滤波前的光学信号，而 图5B 则展示了对同一数据应用5 × 5 × 5立方滤波器（高斯核卷积，5 × 5空间维度和5时间维度）两次后的结果。由于帧率较高（0.1 ms/帧）且空间分辨率高（100像素 × 100像素），滤波处理并未改变信号本身，但有效去除了噪声，这一点也可在单次试验中像素记录的时间进程曲线中观察到（图5C，无滤波；图5D，有滤波；图5E，叠加显示）。

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讨论

脑片生理状态对于获取正确的信号至关重要。本方案中采用的环形膜过滤系统可确保脑片在整个实验过程中保持健康且无变形2,16,17。虽然也可使用其他系统在记录期间维持脑片生理状态，但在任何阶段均应避免脑片发生形变，因为成像要求脑片的每一部分都处于健康状态。环形膜过滤系统在染色过程中也更具优势，有助于我们最大限度地减少染色液的使用体积。此外，控制激发光强度同样重要，应根据时间占空比将其保持在较低水平。持续照明可能对样本造成损伤，因此必须合理使用快门。

VSD的毒性经常被讨论29，但其毒性是由染料浓度、激发光强度以及光照暴露时间三者之间的非线性叠加效应所导致的。本实验方案中所示的染色程序并未引起脑片生理参数的任何可测变化，例如场电位记录的输入-输出关系、长时程增强（LTP）以及成对脉冲易化（PPF）等指标均保持稳定。脑片生理状态的恶化在持续光照条件下尤为显著<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

TT 收到了日本文部科学省（MEXT）的日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI Grant）（JP16H06532、JP16K21743、JP16H06524、JP16K0038 和 JP15K00413）以及厚生劳动省（MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 和 H30 [18062156]）的资助。我们感谢 Editage（www.editage.jp）在英文语言编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高速图像采集系统Brainvision co. Ltd.MiCAM - Ultima成像系统
高速图像采集系统Brainvision co. Ltd.MiCAM 02成像系统
用于宽场成像的宏显微镜Brainvision co. Ltd.THT macroscope宏显微镜
带光电二极管稳定器的高功率LED照明系统Brainvision co. Ltd.LEX-2GLED照明
图像采集软件Brainvision co. Ltd.BV-ana图像采集软件
多功能电刺激器Brainvision co. Ltd.ESTM-8刺激隔离器+AD/DA转换器
切片机LeicaVT-1200S切片机
切片机LeicaVT-1000切片机
切片机刀片Feather Safety Razor Co., Ltd.#99027碳钢剃须刀片
用于支持脑片的膜滤器Merk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,膜滤器/0.45 13
数值分析软件Wavemetrics Inc., OR, USAIgorPro分析软件
刺激隔离器WPI Inc.A395刺激隔离器
AD/DA转换器InstrutechITC-18AD/DA转换器
电压敏感染料 Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA目录编号: D-1199电压敏感染料: Di-4-ANEPPS
泊洛沙姆Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MP泊洛沙姆/Pluronic F-127 (DMSO中的20%溶液)
聚乙氧基化蓖麻油Sigma-AldrichCremophor EL C5135聚乙氧基化蓖麻油

参考文献

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