方法文章

使用电压敏感性染料在脑片中进行全场单光子光学记录

DOI：

10.3791/59692

⸱

2019年6月20日

 ,  ,  , 
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

本文内容

摘要

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我们介绍了一种使用电压敏感染料对脑片进行可重复且稳定的光学记录方法。本文描述了利用常规海马脑片制备技术进行电压敏感染料染色及光学信号记录的过程。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全视野单光子电压敏感染料（VSD）成像技术是评估神经回路功能连接性的有效工具。由于光信号的变化幅度较小，该方法以往难以作为定量分析手段使用。本文介绍了一套特殊的光学系统和脑片处理装置，使该技术变得稳定且可靠。文章详细演示了染色后海马脑片的制备、染色及记录过程。该系统能够长时间维持脑片的生理状态，实现良好的染色效果，并防止记录过程中脑片发生机械性位移。此外，该系统可在使用极少量染料的情况下完成脑片染色。光学系统在低放大倍数下实现了高数值孔径，可在100像素 × 100像素的空间分辨率下以最高10 kHz的帧率记录VSD信号。得益于高帧率和高空间分辨率，该技术可应用记录后的滤波处理，从而获得足够的信噪比，用于评估神经回路中的动态变化。

引言

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宽场单光子电压敏感染料（VSD）成像技术已成为定量评估整体染色脑片制备中神经回路动态的有用工具1,2,3,4。在分析了膜兴奋引起的光学特性变化之后5,6,7，VSD成像技术于20世纪70年代初由Cohen等人首次描述6,8,9。该方法适用于实时监测脑功能，因为染料可直接探测膜电位变化（即神经元的主要信号）。

最早的电压敏感染料（VSD）具备理解脑系统的理想特性，例如具有快速的时间常数，能够追踪神经元膜电位变化的快速动力学过程，并且膜电位变化与信号之间具有良好的线性关系9,10,

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方案

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所有动物实验均按照德岛文理大学动物护理与使用委员会批准的方案进行。以下脑片制备方案几乎为标准操作流程27，但对VSD染色与记录的方案进行了修改。

1. 实验前的准备工作

  1. 配制储备液 A（表 1）、储备液 B（表 2）和储备液 C（表 3），并储存于冰箱中。
  2. 配制 1 L 人工脑脊液（ACSF）（表 4，见步骤 3），并保存在冰箱中。
  3. 配制 1 L 改良 ACSF（表 5），并保存在冰箱中。
  4. 将胎牛血清（FBS）以 500 µL 分装至 2 mL 瓶中，储存于冷冻柜中。
  5. 在微波炉中将 4% 琼脂粉溶解于 ACSF（约 120 mL）中，并倒入一次性 90 mm 培养皿中。琼脂平板在进一步使用前应冷藏。
  6. 在实验前一天将以下物品放入冷冻柜：手术托盘、切片容器和铝制冷却块（120 × 120 × 20 mm3）。
  7. 确保有足够的带膜滤器的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）环，用于切片处理系统17,2....

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结果

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图5 显示了在小鼠海马脑片CA1区施加电刺激后典型的光学信号。连续图像图5A展示了未施加任何空间和时间滤波前的光学信号，而图5B展示了对同一数据应用5 × 5 × 5立方滤波器（高斯核卷积，空间维度5 × 5，时间维度5）两次后的结果。由于帧率较高（0.1 ms/帧）且空间分辨率高（100像素 × 100像素），滤波处理未改变信号本身，但有效去除了噪声，这一点也可在单次试验中像素记录的时间进程曲线中观察到（图5C，无滤波；图5D，有滤波；图5E，叠加显示）。

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讨论

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脑片生理状态对于获取正确的信号至关重要。本方案中采用的环形膜过滤系统可确保脑片在整个实验过程中保持健康且无变形2,16,17。虽然也可使用其他系统在记录期间维持脑片生理状态，但在任何阶段均应避免脑片发生形变，因为成像要求脑片的每一部分都处于健康状态。环形膜过滤系统在染色过程中也更具优势，有助于我们最大限度地减少染色液的使用体积。此外，控制激发光强度同样重要，应根据时间占空比将其保持在较低水平。持续照明可能对样本造成损伤，因此必须合理使用快门。

VSD的毒性经常被讨论29，但其毒性是由染料浓度、激发光强度以及光照暴露时间三者之间的非线性叠加效应所导致的。本实验方案中所示的染色程序并未引起脑片生理参数的任何可测变化，例如场电位记录的输入-输出关系、长时程增强（LTP）以及成对脉冲易化（PPF）等指标均保持稳定。脑片生理状态的恶化在持续光照条件下尤为显著<.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT 收到了日本文部科学省（MEXT）的日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI Grant）（JP16H06532、JP16K21743、JP16H06524、JP16K0038 和 JP15K00413）以及厚生劳动省（MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 和 H30 [18062156]）的资助。我们感谢 Editage（www.editage.jp）在英文语言编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高速图像采集系统Brainvision co. Ltd.MiCAM - Ultima成像系统
高速图像采集系统Brainvision co. Ltd.MiCAM 02成像系统
用于宽场成像的宏显微镜Brainvision co. Ltd.THT macroscope宏显微镜
带光电二极管稳定器的高功率LED照明系统Brainvision co. Ltd.LEX-2GLED照明
图像采集软件Brainvision co. Ltd.BV-ana图像采集软件
多功能电刺激器Brainvision co. Ltd.ESTM-8刺激隔离器+AD/DA转换器
切片机LeicaVT-1200S切片机
切片机LeicaVT-1000切片机
切片机刀片Feather Safety Razor Co., Ltd.#99027碳钢剃须刀片
用于支持脑片的膜滤器Merk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,膜滤器/0.45 13
数值分析软件Wavemetrics Inc., OR, USAIgorPro分析软件
刺激隔离器WPI Inc.A395刺激隔离器
AD/DA转换器InstrutechITC-18AD/DA转换器
电压敏感染料 Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA目录编号: D-1199电压敏感染料: Di-4-ANEPPS
泊洛沙姆Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MP泊洛沙姆/Pluronic F-127 (DMSO中的20%溶液)
聚乙氧基化蓖麻油Sigma-AldrichCremophor EL C5135聚乙氧基化蓖麻油

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).
  2. Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y.

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