方法文章

新生大鼠脑组织制备用于神经末梢突触小泡分布的超微结构形态计量分析

DOI：

10.3791/59694

⸱

2019年6月7日

 , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia Health System, 2Department of Anesthesiology, Universita' degli Studi di Padova

本文内容

摘要

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我们描述了处理新生大鼠脑组织以获得高分辨率电子显微照片的步骤，用于分析神经末梢突触小泡分布的形态计量学研究。采用这些方法获得的显微照片还可用于研究多种其他细胞组分的形态及其维度结构关系。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们的实验室以及许多其他实验室已利用透射电子显微镜的高分辨能力来研究突触小泡的形态及其空间组织。为了获得高质量的电子显微照片，从而获取足以进行突触前小泡分布定量分析所需的形态学细节，优化的样品制备至关重要。化学固定是样品制备过程的第一步，对于精细超微结构的保存尤为关键。通过血管灌注戊二醛-甲醛溶液进行固定，随后用四氧化锇处理振动切片机制备的样品，可最大程度地稳定分子（尤其是蛋白质和脂质），并实现超微结构的优异保存。随后组织经过对比染色、逐级脱水及树脂包埋处理。在树脂包埋前对振动切片组织进行醋酸铀酰块染（即“整体染色”），可增强内源性对比度，并在样品处理过程中防止细胞组分被抽提。通过在超薄切片上使用醋酸铀酰进行染后染色，可进一步提高对比度。在醋酸铀酰染色后，再用柠檬酸铅对超薄切片进行双重染色，还可通过铅离子对醋酸铀酰的选择性结合，增强含核酸结构的电子不透明性，从而提高图像分辨率。透射电子显微镜是表征突触小泡形态细节及其在终末膨大内大小与空间分布的强大工具。然而，由于该技术使用固定组织，因此只能间接提供有关活体或动态过程的信息。因此，当研究的主要目标是探讨突触小泡运输和胞吐作用的动态或功能特性时，应考虑采用其他技术方法。

引言

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我们描述了制备新生大鼠脑组织的方法，以获得高质量的电子显微图像，用于深入分析神经末梢突触小泡的空间分布1,2。采用这些方法处理样品后所获得的高对比度显微图像，也可用于研究多种细胞组分的精细形态及其维度结构关系3,4。

透射电子显微镜（TEM）是一种强大的工具，可用于对细胞器及其他细胞结构的形态进行定量研究。截至目前，除通过高压冷冻实现的冷冻固定技术外，尚无其他研究方法能够在无需免疫标记的情况下，提供对脂质膜和细胞器同等分辨率的观察。然而，冷冻置换技术尚未得到广泛应用，通常还需要昂贵的设备和较长的制样时间。

为了充分利用透射电子显微镜（TEM）的高分辨能力，最优的样品制备至关重要。样品制备的主要目标是尽可能保持组织在活体状态下的结构，最小化结构改变，增强样品对比度，并使组织在处理过程以及暴露于电子束时能够抵抗细胞组分的流失。多年来，多个实验室已提出并不断完善多种用于TEM组织制备的实验方案。其中许多研究集中于突触小泡最佳可视化的方法5,6,

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方案

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所有研究均经弗吉尼亚大学（弗吉尼亚州夏洛茨维尔市）机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院的指南进行。

1. 通过血管灌注进行固定

注意：大鼠脑血管灌注方法的总体描述此前已在本期刊中详细说明13，不在本实验方案的范围之内。然而，以下步骤专用于新生大鼠脑组织的制备，以获得高质量的电镜图像，用于对突触前末梢单位内突触小泡分布进行定量分析。

  1. 配制4%多聚甲醛
    1. 在通风橱内的搅拌器上，将800 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）置于2 L玻璃烧杯中，加热至约60 °C，避免缓冲液沸腾。
    2. 加入40 g多聚甲醛粉末，持续搅拌。
    3. 测量pH时，逐滴加入10 N NaOH，直至溶液变澄清。最终pH应为7.2–7.4。
    4. 加入剩余的0.1 M PB，定容至1 L。冷却后，用0.45 μm滤膜过滤，4 °C过夜保存。
      注意： 灌注前一天制备新鲜的多聚甲醛。
      注意： 吸入醛类蒸气可导致鼻部症状和呼吸道刺激。皮肤接触可引起皮炎。操作醛类时应在通风橱中进行，并佩戴手套、防护服和护目镜。
    ....

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结果

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目前已有普遍接受的通用标准，用于判断透射电镜（TEM）样本保存效果是否满意或存在缺陷。本文通过采用本实验方案所述方法处理幼鼠脑组织所获得的四张代表性电子显微照片（两张为最佳制备示例，两张为缺陷制备示例），展示了这些判断标准。

一般来说，高质量的电子显微照片呈现为有序、清晰且整体呈灰度的图像。在制备良好的样品中，膜之间的间隙应充满颗粒状物质，而不应为空。同样，细胞质基质或细胞器内部也不应出现空隙（比较图1A和图2A与图3和图4）。然而需要注意的是，与成年动物脑组织相比，幼龄动物中枢神经系统细胞外间隙在一定程度上会扩大，细胞间连接较松散，整体呈现更亮、电子密度较低的外观。膜结构应保持连续，无扭曲或断裂现象（见图1A和图2A）。线粒体.......

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讨论

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在透射电镜（TEM）样品制备过程中，组织切片的操作需要相当高的技巧、专注力和耐心。使用微量移液器添加或移除溶液时，由于表面张力的作用，样品可能被吸入移液器尖端，因此必须格外小心，避免移液器对组织造成损伤。此外，脱水程序中的某些步骤可能短至1分钟，操作者必须迅速操作，以确保及时进入下一脱水步骤，并防止样品干燥或皱缩。其中需特别注意的一个步骤是四氧化锇后固定。组织经四氧化锇处理后会变得僵硬，容易受损。在加入四氧化锇之前，必须确保切片平展地贴附于离心管底部，否则任何折叠都会导致组织断裂。当将经四氧化锇处理的组织转移至Aclar膜进行平面包埋时，操作尤为困难。从离心管底部提起样品时需格外小心，以防碎片化，同时在排除膜夹层中的气泡时也需谨慎。虽然必须排除滞留的空气（因其会影响样品的观察，并削弱树脂结合的稳定性），但直接对四氧化锇处理过的组织施加压力极易造成损伤。另一个需要格外注意的步骤是包埋介质混合液的配制，用于样品的渗透和包埋。EPON 是最常用的包埋树脂，可通过加入固化剂和加速剂使其硬化。必须精确使用规定量的固化剂和加速剂，才能获得具有理想特性的固化块。已有文献描述了采用重量法和体积法测量黏稠树脂的方法。尽管传统上认为重量法更为精确

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究由美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所资助项目K08 123321（资助对象：N.L.）以及弗吉尼亚大学麻醉学系的资金支持。作者谨此感谢Alev Erisir（弗吉尼亚大学生物学系，夏洛茨维尔，弗吉尼亚州）在透射电子显微镜技术方面的出色培训与技术协助，以及对本文稿提出的宝贵批评意见。作者同时感谢弗吉尼亚大学先进电子显微镜中心在样品切片和染色后处理过程中提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 四氧化锇Electron Microscopy Sciences19170水溶液
50% 戊二醛Electron Microscopy Sciences16310电镜级，水溶液
Aclar 33 C 包埋膜Electron Microscopy Sciences50425-25厚度 7.8 mil，尺寸 8"x10"
BEEM 包埋胶囊架Electron Microscopy Sciences69916适用于 "00" 号胶囊
BEEM 包埋胶囊Electron Microscopy Sciences70021"00 号，平底（切底型）"
Butler 包埋块修整器Electron Microscopy Sciences69945-01
骆驼毛画笔Electron Microscopy Sciences65576-01
打孔器Electron Microscopy Sciences77850-09
Embed 812 试剂盒Electron Microscopy Sciences14120
乙酸铅Electron Microscopy Sciences17600
柠檬酸铅Electron Microscopy Sciences17800
硝酸铅Electron microscopy Sciences17900
Leica UC7 超薄切片机Leica
微型标尺Electron Microscopy Sciences62091-23
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences19208电镜级，颗粒状
Precision Thelco 实验室烘箱Thelco51221159
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002
StatMark 标记笔Electron Microscopy Sciences72109-01
Tyrode 溶液Electron Microscopy Sciences11760-05
醋酸铀酰Electron Microscopy Sciences22400粉末

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
  2. Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.

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