量化啮齿类动物大脑中亚细胞水平的泛素-蛋白酶体活性

摘要

本方案旨在高效定量啮齿类动物脑组织不同细胞区室中泛素-蛋白酶体系统（UPS）的活性。使用者可在同一只动物中检测核、胞质和突触组分内的UPS功能，从而减少进行此类复杂分析所需的时间和动物数量。

摘要

泛素-蛋白酶体系统是真核生物中蛋白质降解及多种其他细胞过程的关键调控机制。在脑组织中，泛素-蛋白酶体活性的增强对于突触可塑性和记忆形成至关重要，而该系统的异常改变则与多种神经系统、神经退行性及精神类疾病相关。研究脑内泛素-蛋白酶体功能的一个难题在于，该系统存在于所有细胞区室中，而其蛋白质靶标、功能角色及调控机制在不同区室间可能存在显著差异。因此，能够在同一只动物体内直接比较不同亚细胞区室中泛素蛋白靶向修饰和蛋白酶体催化活性的能力，对于全面理解泛素-蛋白酶体系统（UPS）在突触可塑性、记忆及疾病中的作用至关重要。本文所述方法可从同一只啮齿类动物（大鼠）脑组织中分离出细胞核、细胞质及粗突触组分，并进而同时定量检测蛋白酶体的催化活性（间接测定，仅反映蛋白酶体核心的活性）以及连接类型特异性的泛素蛋白标记。因此，该方法可用于在同一只动物中直接比较不同脑区在突触可塑性、记忆形成及不同疾病状态下泛素-蛋白酶体活性的亚细胞变化。该方法还可用于评估其他蛋白质在同一只动物体内的亚细胞分布与功能。

引言

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是一个由相互关联的蛋白质结构和连接酶组成的复杂网络，负责调控细胞内大多数短寿命蛋白质的降解¹。在该系统中，蛋白质通过小分子修饰物泛素被标记，以决定其降解或其他细胞过程和命运。一个靶蛋白可获得1至7个泛素修饰，这些修饰可在前一个泛素分子的七个赖氨酸（K）位点（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）或N端甲硫氨酸（M1；也称为线性）处连接成链²。其中某些多聚泛素标签特异性地介导蛋白质降解（如K48）³，而另一些则主要不依赖于蛋白质降解过程（如M1）^4,5,6。因此，蛋白质泛素化过程极为复杂，能够定量检测特定多聚泛素标签的变化对于最终理解该修饰在细胞功能中的作用至关重要。此外，由于蛋白酶体作为UPS的催化结构⁷，不仅参与蛋白质降解，还可参与其他非蛋白水解过程^8,9，这进一步增加了研究该系统的复杂性。因此，自该系统被发现以来，正常的和异常的泛素-蛋白酶体活性已被证实与长期记忆形成以及多种疾病状态相关，包括许....

方案

所有涉及动物实验的操作均已获得弗吉尼亚理工学院暨州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 啮齿类动物脑组织的采集与解剖

注意：本方案可适用于多种脑区，并可与不同的组织采集方法联合使用。以下是我们实验室用于分离大鼠脑组织亚细胞组分的操作流程，所用大鼠为8-9周龄雄性Sprague Dawley大鼠。为了在同一动物中处理所有细胞区室，无论采用何种组织采集方法，都必须遵循第1.3节的步骤。

1. 取出大鼠脑组织，放入预先在干冰上预冷的冷冻杯中。在干冰上快速冷冻脑组织，如有条件可使用液氮，并转移至 -80 °C 超低温冰箱中。脑组织可在同一天或之后的时间进行解剖。
2. 将冷冻的大鼠脑组织从冷冻杯中取出，放入用干冰预冷的大鼠脑切片模具中。模具上的每个槽口对应 0.5 mm 间距，可用于确定目标区域（ROI）的大致位置。
   1. 根据大鼠脑图谱，将剃须刀片插入预测的 ROI 起始位置前方（前侧）的模具槽口中，随后将另一刀片插入预测的 ROI 终止位置（后侧）的槽口中。
   2. 使用解剖刀切除两刀片之间的脑组织切片，并将其置于经干冰预冷的载玻片上。通常切片厚度为 2–3 mm，但具体厚度取决于目标区域。
3. 使用解剖刀逐侧分离目标区域（ROI....

结果

采用本文所述方法，从大鼠脑的侧杏仁核中分离出细胞核、细胞质和突触组分（图1）。通过蛋白质印迹法检测各组分的纯度，使用针对应富集或耗竭于裂解液中蛋白质的抗体进行探查。在第一个半脑中收集了粗制突触组分，结果显示突触后密度蛋白95（PSD95）存在于突触组分中，而不存在于细胞核组分中，细胞质中的含量较低（图2A）。这与先前研究结果一致，表明突触组分的制备方法可同时分离出突触前和突触后成分²⁵。相反，细胞核蛋白组蛋白H3存在于细胞核组分中，但不存在于突触组分中，细胞质中的含量也较低（图2B）。PSD95和H3在细胞质中的存在与其在细胞质中的翻译过程一致。细胞质蛋白β-微管蛋白存在于我们的细胞质组分中，但在细胞核裂解液中基本检测不到（图2C），在突触区域的含量也较低。这表明我们成功获得了基本不含细胞.......

讨论

在此，我们展示了一种在同一动物不同亚细胞区室中定量泛素-蛋白酶体活性变化的高效方法。目前，大多数测量泛素-蛋白酶体系统在亚细胞水平活性变化的尝试均局限于每份样本仅检测一个区室，因而需要重复实验，导致显著的成本增加和动物资源的浪费。我们的实验方案通过分割脑半球，使同一动物的两个半球可分别用于获取不同的细胞组分，从而解决了这一问题。利用该方案，我们首次证明了在同一动物中，学习过程可诱导泛素-蛋白酶体活性在细胞核、细胞质和突触组分中发生差异性变化²¹。

本方案的主要局限性在于其依赖于所获取的脑组织（样本）量。例如，如上所述，本方案要求将特定脑区的两个半球分开处理。然而，这并不总是可行的，例如某些仅存在于一侧半球的脑区。在此类情况下，可首先将整个脑区使用突触组分分离步骤（第3.1节）中的TEVP缓冲液进行匀浆处理，因为该缓冲液不含任何变性剂。随后，可按体积将样品均分为两部分。第一部分可按照所述方案用于突触组分的提取；对于第二部分样品，可加入非离子型去污剂NP-40至终浓度为0.05%，然后按照第2.6节所述进行离心。这将使胞质蛋白分布于上清液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Fisher	15575020	其他多个供应商
20S 蛋白酶体活性检测试剂盒	Millipore Sigma	APT280	其他供应商提供不同版本
ATP	Fisher	FERR1441	其他多个供应商
β-肌动蛋白抗体	Cell signaling	4967S	其他多个供应商
β-微管蛋白抗体	Cell signaling	2128T	其他多个供应商
BioTek Synergy H1 酶标仪	BioTek	VATECHH1MT3	其他供应商提供不同版本
β-巯基乙醇	Fisher	ICN19024280	其他多个供应商
Clasto 乳胞素 β-内酯	Millipore Sigma	L7035	其他多个供应商
冷冻杯	Fisher	033377B	其他多个供应商
DMSO	DMSO	D8418	其他多个供应商
DTT	Millipore Sigma	D0632	其他多个供应商
甘油	Millipore Sigma	G5516	其他多个供应商
H3 抗体	Abcam	ab1791	其他多个供应商
HEPES	Millipore Sigma	H3375	其他多个供应商
盐酸	Fisher	SA48	其他多个供应商
IGEPAL (NP-40)	Millipore Sigma	I3021	其他多个供应商
K48 泛素抗体	Abcam	ab140601	其他多个供应商
K63 泛素抗体	Abcam	ab179434	其他多个供应商
KCl	Millipore Sigma	P9541	其他多个供应商
KONTES 组织研磨器	VWR	KT885300-0002	其他多个制造商/型号
Laemmli 样品缓冲液	Bio-rad	161-0737	其他多个供应商
线性泛素抗体	Life Sensors	AB-0130-0100	仅 M1 抗体
MgCl	Millipore Sigma	442611	其他多个供应商
微量离心机	Eppendorf	2231000213	其他多个制造商/型号
myr-AIP	Enzo Life Sciences	BML-P212-0500	Millipore-Sigma 有售
NaCl	Millipore Sigma	S3014	其他多个供应商
Odyssey Fc 成像系统	LiCor	2800-02	其他供应商提供不同版本
磷酸酶抑制剂	Millipore Sigma	524625	其他多个供应商
Precision Plus Protein 标准品	Bio-rad	161-0373	其他多个供应商
蛋白酶抑制剂	Millipore Sigma	P8340	其他多个供应商
PSD95 抗体	Cell signaling	3450T	其他多个供应商
SDS	Millipore Sigma	L3771	其他多个供应商
氢氧化钠	Fisher	SS255	其他多个供应商
蔗糖	Millipore Sigma	S0389	其他多个供应商
TBS	Alfa Aesar	J62938	其他多个供应商
Tris	Millipore Sigma	T1503	其他多个供应商
Tween-20	Fisher	BP337-100	其他多个供应商
泛素抗体	Enzo Life Sciences	BML-PW8810	其他多个供应商