用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

摘要

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。

摘要

本方案中，我们概述了在384孔悬滴板中生成肿瘤类球体的实验流程，旨在构建一种生理环境高度模拟的微环境，用于抗癌药物的高通量筛选。我们详细描述了患者来源的肿瘤干细胞类球体的形成过程，以及药物处理后对这些类球体进行深入分析的操作方法。具体包括类球体形态学、增殖能力、存活率、药物毒性、细胞表型及细胞定位数据的采集与分析。本方案重点介绍适用于384孔悬滴平台的多种分析技术，使其成为高通量药物筛选的理想工具。尽管我们特别强调该模型在卵巢癌研究及肿瘤干细胞研究中的重要性，但384孔平台同样适用于其他类型癌症及疾病模型的研究，因而具有广泛的科研应用价值。通过采用易于实施且生理相关性良好的三维培养体系，提升个体化药物筛选的速度与结果质量，该平台有望推动新型治疗药物及个体化治疗策略的开发，从而产生深远的临床影响。

引言

2018年，全球与癌症相关的死亡人数达到980万¹，凸显了开发更有效治疗手段的迫切需求。然而，抗癌药物的研发成本不断上升，单个药物的研发费用约为6.5亿美元²，表明亟需改进新抗癌药物的开发策略。癌症干细胞（CSCs）具有更强的耐药性³、自我更新能力以及形成新肿瘤的能力⁴，被认为与肿瘤复发⁴、转移⁵和化疗耐药^4,6密切相关，这些因素共同导致了肿瘤的恶性程度升高，从而造成高死亡率。在卵巢癌中，这些细胞在腹腔内的恶性腹水中富集，而该状况通常与不良的临床预后相关¹。由于CSCs具有上述恶性特性，目前正积极推动开发靶向CSCs的新药，并将其与传统化疗联合使用。然而，靶向CSCs药物的研发面临若干挑战，包括：1）体外扩增和维持CSCs困难；2）患者样本稀缺；3）培养平台的生理相关性不足；4）不同患者之间药物敏感性存在异质性。本实验方案介绍了一种高通量三维培养平台的应用，可有效克服上述各项挑战。该系统尤其适用于利用少量来源于患者的卵巢癌干细胞进行快速药物筛选，并且高度兼容后续分析技术。尽管该平台非常....

方案

所有患者样本均在获得批准的机构审查委员会（IRB）方案下，从知情同意的患者处收集，其样本在肿瘤减灭术和腹水采集后进行去标识化处理。

1. 在384孔悬滴板中利用少量细胞生成球状体

1. 将悬滴板放入装有无菌去离子（DI）水的超声波清洗器中，超声处理 20 分钟。
2. 戴手套将悬滴板从超声波清洗器中取出，并用流动的去离子水冲洗。
3. 将悬滴板置于 0.1% Pluronic 酸溶液中浸泡 24 小时，以防止蛋白质吸附及类球体黏附于孔壁。
4. 戴手套取出悬滴板，并用流动的去离子水彻底冲洗板的两面。
5. 在生物安全柜内用力轻敲或振荡悬滴板，以无菌环境去除孔中的水分。
6. 将悬滴板每面置于紫外光下照射 30–60 分钟，以灭菌并减少污染。
   注意：也可将悬滴板置于环氧乙烷气体灭菌室中进行灭菌。
7. 在 6 孔板的每个孔中加入 4–5 mL 无菌高压灭菌的去离子水，将悬滴板夹在 6 孔板的盖子与底部之间。在悬滴板边缘周围加入 800–1,000 μL 无菌去离子水，以提供湿润、稳定且无菌的环境，减少蒸发导致的体积损失（图 1 A-C）。
8. 对于 2D 培养的细胞，吸除处于对数生长期细胞表面的培养基，并用 1× 磷酸盐缓....

结果

使用细胞系或患者来源的CSCs形成的球状体，可在悬滴中以少量细胞形成（图 2A）。每个孔中仅需10个细胞即可稳定形成类球体，有助于节约珍贵的患者样本。这些类球体中的细胞在三维空间中被其他细胞包围，类似于体内环境，可实现生理性的细胞间接触和扩散速率。类球体内的肿瘤细胞不断增殖，导致类球体随时间推移逐渐增大。图2B）。由于更具侵袭性的患者细胞或细胞系比其对应细胞生长更快，因此量化每个样本的增殖能力，并考察药物处理对各样本增殖的影响至关重要。为此，可利用384孔生理学平台便捷地开展基于代谢活性的检测，例如基于刃天青的荧光检测法，无需收集类球体，检测结果如图所示 图2C可同时收获多个类球体，经固定、切片后，使用苏木精和伊红或免疫荧光抗体染色，以鉴定类球体内的细胞形态与排列结构，以及细胞类型和细胞外基质蛋白的分布情况（图2D，E).

讨论

用于3D球状体形成的384孔悬滴培养板平台是一种易于实施的工具，适用于任何细胞生物学或癌症生物学实验室。该生理学平台能够在具有生理相关性的三维培养环境中研究细胞系以及原代患者样本，同时支持高通量药物筛选。该平台还可高度调节培养条件，精确控制接种密度、细胞 共培养比例、细胞外成分及培养基组成。此外，该生理学平台使实验能够高度兼容下游分析技术，适用于需要大量或少量细胞的检测方法，如qRT-PCR、FACS以及多种成像技术。尽管操作熟练程度需通过经验积累，但新学员一旦掌握移液的速度与技巧，即可迅速成功操作。因此，该生理学平台非常适用于个体化3D药物筛选、肿瘤干细胞（CSC）生物学及化疗耐药性研究。

在首次实施该平台时，需要注意的几个问题包括培养板转移和药物处理。在进行常规换液、成像和分析等操作而需要将培养板从一个位置转移到另一个位置时，应采取谨慎措施，避免不必要的晃动。应从培养板的外缘抓握，并尽可能保持其水平，在放置培养板时注意避免突然的撞击动作。这有助于防止液滴丢失或相邻液滴合并。同样，在对悬滴球状体 进行药物处理时也应保持高度警惕，以避免某个悬滴球状体的给药剂量错.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si 油	Millipore Sigma	63148-62-9	用于包被类球体阵列模具，以促进组织处理凝胶（如 Histogel）从模具中脱模。
100 mm 组织培养皿	Thermo Scientific	130182
15 mL 圆锥形离心管	Celltreat	FL4021
1× DMEM 无血清培养基	Gibco	11965-092
1× F12 无血清培养基	Gibco	11765-054
1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm 滤膜	Fisher Scientific	22363547
6 孔板	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	一种温和的细胞解离酶，由蛋白水解酶和胶原酶组成。
ACK 裂解缓冲液	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	刃天青染料，通过检测细胞将刃天青还原为高荧光性的试卤灵的能力，来评估细胞的活力和增殖能力。
ALDEFLUOR 检测试剂盒	Stem Cell Tech	1700	用于鉴定高表达醛脱氢酶的干细胞和祖细胞的试剂盒，该酶是肿瘤干细胞的标志物。试剂盒包含 ALDEFLUOR 试剂、DEAB、盐酸、二甲基亚砜和 ALDEFLUOR 检测缓冲液。
ALDEFLUOR 二乙氨基苯甲醛 (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	二乙氨基苯甲醛 (DEAB) 是 ALDH 同工酶的抑制剂，用于确定非特异性 ALDH 染色。
Andor iXon x3 CCD 相机	Oxford Instruments	-
抗生素和抗真菌剂	Gibco	15240-062
APC-同型 IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	同型对照，用于量化 IgG2b 抗体的非特异性染色。
B27 添加剂	Gibco	17504044
碱性成纤维细胞生长因子	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT 微孔板读数仪	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	靶向 CD133 的荧光抗体，CD133 是肿瘤干细胞的标志物。
cellSens Dimension 软件	Olympus
顺铂	Sigma-Aldrich	P4394	一种基于铂的化疗药物，作为烷化剂发挥作用，可破坏 DNA。
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)	Invitrogen	D1306
表皮生长因子	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core 细胞成像系统	Life Technologies	AME3300
胎牛血清 - 优质 (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
血细胞计数板	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	组织处理凝胶，可渗透并固定样本于凝胶中，同时防止染色时样本周围出现变色。
人脂肪来源的间充质干细胞	Lonza	PT-5006
人微血管内皮细胞	Lonza	CC2543
胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂	Gibco	51500-056
活/死细胞活力检测试剂盒	Invitrogen	L3224	基于荧光检测活细胞（钙黄绿素-AM）和死细胞（溴化乙锭同源二聚体-1）的试剂盒。
MEM 非必需氨基酸	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 软件	Molecular Devices	-
Olympus IX81 倒置共聚焦显微镜	Olympus	-
Olympus IX83 研究型倒置显微镜	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	热塑性聚合物薄膜，用于悬挂滴板中限制液滴蒸发，同时允许气体交换。
Perfecta 3D 384 孔悬挂滴板	3D Biomatrix	HDP1384-8	可通过 Sigma-Aldrich 购买
鬼笔环肽 AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	鬼笔环肽是一种可对固定细胞中的 F-肌动蛋白进行荧光标记的多肽。
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D 打印机
无菌去离子水	Fisher Scientific	353046
台盼蓝	Gibco	15250061	偶氮染料，根据其能否穿透死细胞受损的细胞膜（而不能穿透活细胞完整的细胞膜）来区分活细胞与死细胞。
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	一种用于 3D 打印的生物相容性聚合物材料。
Yokogawa CSU-X1 共聚焦扫描装置	Yokogawa	-