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方法文章

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

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DOI：

10.3791/59696

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2019年7月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Michigan, 3Rogel Cancer Center, School of Medicine, University of Michigan, 4Macromolecular Science and Engineering, University of Michigan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。

摘要

本方案中，我们概述了在384孔悬滴板中生成肿瘤类球体的实验流程，旨在构建一种生理环境高度模拟的微环境，用于抗癌药物的高通量筛选。我们详细描述了患者来源的肿瘤干细胞类球体的形成过程，以及药物处理后对这些类球体进行深入分析的操作方法。具体包括类球体形态学、增殖能力、存活率、药物毒性、细胞表型及细胞定位数据的采集与分析。本方案重点介绍适用于384孔悬滴平台的多种分析技术，使其成为高通量药物筛选的理想工具。尽管我们特别强调该模型在卵巢癌研究及肿瘤干细胞研究中的重要性，但384孔平台同样适用于其他类型癌症及疾病模型的研究，因而具有广泛的科研应用价值。通过采用易于实施且生理相关性良好的三维培养体系，提升个体化药物筛选的速度与结果质量，该平台有望推动新型治疗药物及个体化治疗策略的开发，从而产生深远的临床影响。

引言

2018年，全球与癌症相关的死亡人数达到980万1，凸显了开发更有效治疗手段的迫切需求。然而，抗癌药物的研发成本不断上升，单个药物的研发费用约为6.5亿美元2，表明亟需改进新抗癌药物的开发策略。癌症干细胞（CSCs）具有更强的耐药性3、自我更新能力以及形成新肿瘤的能力4，被认为与肿瘤复发4、转移5和化疗耐药4,6密切相关，这些因素共同导致了肿瘤的恶性程度升高，从而造成高死亡率。在卵巢癌中，这些细胞在腹腔内的恶性腹水中富集，而该状况通常与不良的临床预后相关1。由于CSCs具有上述恶性特性，目前正积极推动开发靶向CSCs的新药，并将其与传统化疗联合使用。然而，靶向CSCs药物的研发面临若干挑战，包括：1）体外扩增和维持CSCs困难；2）患者样本稀缺；3）培养平台的生理相关性不足；4）不同患者之间药物敏感性存在异质性。本实验方案介绍了一种高通量三维培养平台的应用，可有效克服上述各项挑战。该系统尤其适用于利用少量来源于患者的卵巢癌干细胞进行快速药物筛选，并且高度兼容后续分析技术。尽管该平台非常适合研究卵巢癌和CSCs，也可广泛用于在复杂的三维环境中研究其他类型的癌症及分化细胞。

复杂的三维（3D）模型在研究肿瘤微环境（TME）中至关重要，TME 是由癌细胞、非癌支持细胞和细胞外基质（ECM）蛋白构成的三维生态位4。与传统的二维体外细胞培养相比，这种三维环境导致了独特的细胞形态、细胞间及细胞与基质间的相互作用、细胞分化、细胞迁移、细胞密度以及扩散梯度4。所有这些因素共同导致三维培养中出现不同的药物反应，表现出更强的耐药性和更高的生理相关性7,8。由于三维 TME 在肿瘤干细胞（CSC）分化和化学耐药性中起关键作用，因此在生理相关的微环境中筛选靶向 CSC 的药物至关重要。提高 CSC 药物筛选平台的生理相关性，有望改善针对患者的个体化药物筛选、药物开发、治疗策略制定，最终提升临床疗效。同样重要的是，用于药物筛选的平台应具备高通量特性，并能与下游分析方法兼容，以最大限度地降低有前景药物的成本、缩短研发时间和临床转化周期9。

目前，在药物筛选应用中，体内模型（如小鼠同源肿瘤模型、细胞系来源异种移植模型和患者来源异种移植（PDX）模型）12 仍能最好地维持复杂的肿瘤微环境（TME），因为它们可提供生理条件。然而，这些模型通量较低，且成本高、耗时长、技术要求高，限制了其在快速、高通量药物筛选中的应用13。作为这些体内模型的替代方案，已开发出多种体外三维模型，包括利用水凝胶的培养系统8、微流控装置或“器官芯片”装置中的培养10,14，以及非黏附性培养系统3,8，这些模型因成本低、耗时短、技术门槛低而具有较高的可及性。

水凝胶培养平台在基质成分、力学性能和基质结构的精细调控方面具有优势15；然而，它们可能限制高密度细胞培养14。此外，由于收获方法可能对细胞造成损伤，从水凝胶中回收细胞可能会使后续分析变得复杂15。相比之下，微流控装置是一种微尺度设备，可在同一装置内实现输出检测，并在生理相关尺度上进行细胞培养，同时试剂消耗极少、反应时间缩短、废物产生减少且扩散迅速14。这些特性使其成为研究药物毒性、药效及药代动力学的有前景平台。然而，高效、可量化、可重复且操作简便的三维细胞培养所面临的挑战，以及庞大且昂贵的泵送系统，限制了微流控技术在高通量研究中的应用10。此外，检测系统的高效构建以及在不同领域推广应用的潜在困难，也阻碍了微流控系统的广泛采用10。

相反，在非黏附条件下通过旋转混合器（nutator）、超低黏附培养板或悬滴法生成的类球体不包含用户定义的基质成分。这些方法在研究卵巢癌时尤为重要，因为非黏附条件模拟了类球体在腹腔内生长的环境5。在这些非黏附培养方法中，与超低黏附培养板生成的类球体相比，nutator法和悬滴法生成的类球体表现出更高的致密性、基质重塑能力以及化疗耐药性，提示其具有更高的生理相关性16,17,18,19。由于悬滴培养板具有更小的孔径尺寸和更低的细胞用量，更适合高通量筛选，因此悬滴法生成类球体是药物筛选的理想平台。本文介绍一种可在384孔悬滴培养板中调节的三维生理学平台，该平台易于实施，并且非常适合后续分析，是进行卵巢癌及卵巢肿瘤干细胞（CSCs）高通量药物筛选的理想选择。

我们的三维生理平台具备三维培养的所有优势，包括生理性的细胞间接触、扩散梯度、细胞密度以及自然分泌的细胞外基质（ECM）蛋白，这些因素可能有助于产生更真实的药物反应16,17,18,19。此外，通过使用患者来源的肿瘤干细胞（CSCs）构建这些球状体，我们能够同时进行多次技术重复，测定患者对药物的特异性反应1，从而克服患者肿瘤样本中可能存在的异质性20。进一步研究表明，三维培养有助于维持CSC群体的稳定性3,16，因此更能代表腹水中富集的CSC群体7。结合简便的下游分析方法，如通过流式细胞术检测细胞活力和CSC比例，可实现对靶向CSC药物疗效的最佳评估。最后，该生理平台支持在实验过程中多个时间点进行成像分析，可用于评估细胞死亡与增殖、通过免疫组织化学分析细胞排列与形态、通过培养上清的ELISA检测可溶性信号分子、通过流式细胞术分析细胞表型，以及通过PCR检测基因表达水平。

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方案

所有患者样本均在获得批准的机构审查委员会（IRB）方案下，从知情同意的患者处收集，其样本在肿瘤减灭术和腹水采集后进行去标识化处理。

1. 在384孔悬滴板中利用少量细胞生成球状体

  1. 将悬滴板放入装有无菌去离子（DI）水的超声波清洗器中，超声处理 20 分钟。
  2. 戴手套将悬滴板从超声波清洗器中取出，并用流动的去离子水冲洗。
  3. 将悬滴板置于 0.1% Pluronic 酸溶液中浸泡 24 小时，以防止蛋白质吸附及类球体黏附于孔壁。
  4. 戴手套取出悬滴板，并用流动的去离子水彻底冲洗板的两面。
  5. 在生物安全柜内用力轻敲或振荡悬滴板，以无菌环境去除孔中的水分。
  6. 将悬滴板每面置于紫外光下照射 30–60 分钟，以灭菌并减少污染。
    注意：也可将悬滴板置于环氧乙烷气体灭菌室中进行灭菌。
  7. 在 6 孔板的每个孔中加入 4–5 mL 无菌高压灭菌的去离子水，将悬滴板夹在 6 孔板的盖子与底部之间。在悬滴板边缘周围加入 800–1,000 μL 无菌去离子水，以提供湿润、稳定且无菌的环境，减少蒸发导致的体积损失（图 1 A-C）。
  8. 对于 2D 培养的细胞，吸除处于对数生长期细胞表面的培养基，并用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以去除生长培养基中残留的胎牛血清（FBS），因为 FBS 会抑制胰蛋白酶的作用。
  9. 吸除 PBS，向 100 mm 组织培养皿中加入 1.5–2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
    注意：不同细胞脱落速度可能不同，因此应在 5 分钟后使用台式显微镜检查细胞是否已脱落。使用特定细胞系时，应根据供应商提供的说明调整消化程序。
  10. 向培养皿中加入 6–8 mL 含 FBS 或其他血清的细胞培养基以中和胰蛋白酶，用 10 mL 移液管收集细胞，并转移至 15 mL 锥形管中。
  11. 取 10 μL 细胞悬液分别加入血细胞计数板两侧，按照相应的计数方法进行细胞计数。
  12. 对于从未进行 2D 培养的原发性或转移性实体瘤或腹水中获取的患者来源细胞，使用先前所述的无血清培养基（SFM）制备单细胞悬液3。
  13. 按照先前描述的方法处理肿瘤组织，并将单细胞悬液用适当的冻存液冻存，以备后续使用21,22。
    1. 对于实体瘤组织，使用手术刀进行机械剪碎，将所得悬液通过 40 μm 滤膜过滤，再通过密度梯度法分离目标细胞21,22。
    2. 对于腹水样本，通过离心浓缩细胞，使用氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液裂解红细胞，用 1× PBS 洗涤，然后通过 40 μm 滤膜并用 28 G 针头反复吹打 4 次22。
  14. 为分离卵巢癌干细胞（CSCs），按照下文详述的方法通过流式细胞术进行细胞分选。
  15. 新鲜分离的单细胞冻存备用，实验需要时再解冻使用。
  16. 为准备铺板用的细胞悬液，计算所需细胞悬液体积：每滴 20 μL × 总滴数 = 所需总悬液体积。
  17. 将细胞浓度稀释至每 20 μL 所需的细胞浓度（例如，每 20 μL 滴液中含 100 个细胞）。
  18. 铺板前用移液器轻轻混匀细胞悬液，以确保细胞分布均匀，提高各悬滴之间的一致性。
    注意：过度混匀细胞悬液可能导致细胞死亡及悬滴类球体中出现碎片。
  19. 将移液器枪头以约 45° 角插入孔中，向每个悬滴孔中加入 20 μL 细胞悬液。
    注意：可根据所需类球体数量调整铺板模式。当实验不需要大量类球体时，建议每隔一个孔铺板，以避免液滴意外融合（图 1D, E）。若实验需要大量类球体，则可每孔均铺板，但四周需留出一排边缘孔不铺（图 1F）。
  20. 将 6 孔板的盖子重新盖在悬滴板上，并使用对水分损失不敏感的弹性热塑性密封条密封边缘，防止液滴进一步蒸发。置于标准 CO2 恒湿培养箱（5% CO2，37 °C）中培养。
  21. 每隔 2–3 天为悬滴补充培养基，以提供必要的营养物质，每次向含类球体的孔中添加 2–3 μL。
    注意：成像后建议始终为悬滴补充培养基，因为成像过程中的空气暴露会导致蒸发。

2. 向悬滴球体培养板中添加细胞培养基

  1. 在生物安全柜内移除热塑性封边条和盖子，并向每个含有悬滴的孔中加入 2–3 μL 适当的培养基。
    注意：加入的体积取决于液滴大小以及两次换液之间的时间间隔。
  2. 换液后，用顶盖盖住培养板，并在将培养板放回培养箱前，于外缘重新贴上新的热塑性封边条。

3. 类球体形态的相差成像

  1. 在生物安全柜中将热塑性封板条从培养板边缘移除。
  2. 小心地将带有盖子的384孔悬滴类球体培养板从生物安全柜中取出，并放入倒置荧光显微镜的载物台中。
  3. 使用成像软件中的实时成像功能，在4倍、10倍或20倍物镜下观察悬滴类球体，并采集所需图像。
  4. 保存图像后，将培养板重新放回生物安全柜中，并按照前述方法对细胞进行换液培养。
  5. 用新的热塑性封板条重新密封培养板，并将密封后的培养板放回培养箱中继续培养。

4. 类球体中增殖与活力的定量分析

  1. 将类球体接种至足够数量的孔中以获得 >每个时间点（即第1天和第7天）需设置10个技术重复。
    注意： 由于刃天青染料可能带来的污染，用于此检测的孔板通常不再重复使用。
  2. 向指定用于增殖分析的孔中加入 2 μL 过滤后的刃天青基溶液，如同喂养这些孔，然后在预先确定的孵育时间内孵育。
    注意： 孵育时间可能因细胞类型及类球体中的细胞数量而异。建议在开始增殖实验前，先确定所需的孵育时间：在孵育1小时后开始测量，之后每隔30分钟重新测量一次，直至对照孔中的信号读数达到平台期。可根据需要多次获取检测读数。通常情况下，由100个癌细胞起始形成的类球体，孵育时间为4小时。
  3. 首先打开酶标仪，然后启动配套的酶标仪软件，至少在首次读数前15分钟开启，以使仪器预热并稳定内部温度至22 °C，因为温度可能影响读数结果。
  4. 打开一个384孔板实验方案，设置激发波长为530/25 nm，发射波长为590/35 nm，并 光学 设定为 底部, 增益 设定为 35, 读取速度 设定为 正常，读取类型设置为 荧光.
  5. 孵育结束后，在生物安全柜中打开悬滴夹心装置，并将仍带有盖子的384孔板转移至酶标仪。
  6. 将带盖的384孔板放入酶标仪托盘中，待仪器预热完成后托盘会自动伸出并点击 好的 读取酶标板。
  7. 将培养板放回6孔板底座，并置于培养箱中。若当天所有时间点的检测均已完成，在将培养板放回培养箱前应重新密封。
  8. 在弹出窗口中保存实验，然后单击 是 当系统提示时 您要为 1 号板执行 PowerExports 吗 将酶标仪软件中的数据输出至电子表格中进行整理。
  9. 计算每种条件下的平均荧光值，并通过对照条件的平均值进行归一化，以报告不同实验条件下增殖的倍数变化。
  10. 将第7天的数据与第1天的数据进行比较时，通过除以第1天的平均荧光强度来归一化，以获得随时间变化的增殖倍数变化。
  11. 使用平均值的标准误计算误差线，并采用适当的统计学方法（如双尾学生t检验）确定实验组之间的统计学显著性。

5. 类球体中药物毒性的评估

  1. 药物给药
    1. 在类球体形成后的任意时间，将药物稀释至目标浓度，使2 μL剂量中含有目标终浓度的10倍。
      注意：此操作假设液滴蒸发2 μL，因此给药后最终体积为20 μL。例如，50 μM的顺铂剂量应配制为500 μM的溶液。如果液滴体积超过20 μL，则应相应调整药物浓度和/或添加体积。
    2. 用2 μL细胞培养基处理对照样品。
      注意：顺铂溶于水，因此对照组使用2 μL细胞培养基；但如果药物溶剂为其他溶剂（如DMSO），则对照组应使用与药物处理组相同浓度的DMSO加入细胞培养基中。
    3. 在药物孵育期间，持续通过相差显微镜观察药物处理组和对照组类球体，并结合上述所述的刃天青染料检测，以直观记录药物毒性效应及细胞活力变化。
      注意：通常在悬滴培养5–7天后加入药物，并在48–72小时后测定毒性，但可根据实验需求调整。一旦形成稳定的类球体（通常在1–4天内），即可开始加药。
  2. 通过细胞计数定量药物毒性
    1. 在药物处理结束时间点，使用1,000 μL移液器分别从对照组和药物处理组孔中各收集10个类球体，并将每组类球体分别放入独立的微量离心管中。
    2. 通过反复吹打将类球体解离为单细胞悬液。
      注意：为减少因反复吹打可能造成的细胞损伤，可使用胰蛋白酶等酶进行酶解消化，以促进单细胞悬液的制备23。细胞死亡的最小化程度取决于细胞类型，应根据具体情况进行优化。若担心解离过程导致细胞死亡，可参考使用刃天青染料及细胞毒性检测等无需类球体解离的替代分析方法。
    3. 将离心管在400 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉淀至微量离心管底部，随后吸除上清液。
    4. 向每管中加入20 μL新鲜培养基或1× PBS，并充分混匀。
    5. 按每20 μL细胞悬液加入2 μL台盼蓝染液的比例加入台盼蓝。
    6. 取10 μL细胞与台盼蓝混合悬液加入血细胞计数板的每个计数室，在光学显微镜下进行细胞计数，其中蓝色染色细胞代表死细胞，未染色细胞代表活细胞。
      1. 活细胞百分比 = （活细胞数 ÷ 总细胞数） × 100。

6. 采用组织学技术对球状体进行表征

注意： 有两种采用生物相容性聚合物3D打印的模具可供选择，用于复制Ivanov等人24所制备的类球体阵列模具：1）20孔模具，每孔可容纳28 μL；2）63孔模具，每孔可容纳9 μL（图2D）。

  1. 用70%乙醇擦拭组织学模具及其边框进行灭菌，并将边框牢固地固定在模具周围，然后将模具直立放置。两种模具均可容纳约3 mL液体（20个类球体阵列的容量为3.203 mL，63个类球体阵列的容量为3.196 mL）。
  2. 使用尖头棉签将10,000 cSt硅油轻轻涂覆在类球体阵列表面，以利于在后续步骤中取出标本处理凝胶铸型。
  3. 将标本处理凝胶在微波炉中加热10–20秒至完全液化，加热时需松开盖子。
  4. 将2.6至2.8 mL熔融的处理凝胶加入模具中，直至液面接近边框顶部。
  5. 数分钟后，待凝胶完全凝固，通过分离边框与模具，然后倒置阵列模具，取出处理凝胶铸型。
  6. 将镊子尖端插入模具与边框之间，小心分离两者；若铸型未立即脱落，可使用细胞刮铲辅助将其从模具中取出。
  7. 用1,000 μL移液器将悬滴板中单个孔内的内容物转移至100或150 mm细胞培养皿中，收集类球体，并在显微镜下目视分离类球体。
  8. 将含有已识别类球体的孔内液体5 μL移入阵列中的一个孔，重复操作直至填满整个阵列。
  9. 静置3分钟，确保类球体已沉降至阵列孔底部，然后小心地向各孔中加入熔融的处理凝胶，注意避免扰动类球体。
  10. 添加额外的处理凝胶使阵列表面平整，待其冷却凝固后，将固化的类球体阵列放入已标记的包埋盒中，准备后续处理。
  11. 将标记好的包埋盒浸入4%福尔马林中，在4 °C下固定类球体过夜，随后转移至70%乙醇中，于4 °C保存，直至进行下一步处理。
  12. 采用标准的1小时石蜡包埋程序进行处理，然后将类球体阵列包埋，使处理后的阵列直立放置，孔底最接近蜡块表面。
  13. 确保阵列尽可能平整包埋，底面与蜡块底部齐平，并将蜡块置于冰上。
  14. 将蜡块安装到切片机上，调整蜡块位置，使刀片与蜡块切面平行。
  15. 以15 μm的切片深度进行切片，直至达到阵列孔的底部，确保切下的样本中可见圆形孔结构。
  16. 切换至5 μm切片深度，继续切片并收集带状切片。每隔数片在显微镜下检查，判断是否已切到类球体层面。一旦切到类球体，开始连续收集每张切片，直至类球体不再可见。
  17. 按照标准H&E染色程序对每张切片进行染色。

7. 活死细胞毒性检测

  1. 向每个悬滴中加入活细胞染料钙黄绿素-AM（calcein-AM），使其终浓度为 2 μM，同时加入死细胞染料乙啶同二聚体-1（ethidium homodimer-1），使其终浓度为 4 μM，注意悬滴体积为 20 μL。
    注意：应尽量减少添加体积，通常共加入 2 μL 染料混合液。
  2. 将培养板放回培养箱中，夹在带盖的6孔板内，在37 °C条件下孵育类球体45分钟。
    注意：根据类球体的大小，孵育时间会有显著差异。例如，直径小于400 μm的类球体通常仅需孵育30–45分钟，而接近800 μm的较大类球体可能需要长达90分钟的孵育时间。具体孵育时间需根据实验条件进行优化。
  3. 后续成像时，在生物安全柜中使用1,000 μL移液器收集类球体，并将每个类球体转移至预先清洁的玻璃载玻片上。
  4. 通过玻璃载玻片，在倒置共聚焦显微镜下对类球体进行成像。
    注意：根据共聚焦显微镜与类球体收获实验室之间的距离，可选择直接在置于载玻片上的原始培养液滴中成像，或在需要更高稳定性以运输类球体时将其包埋于2%琼脂糖中再进行成像。
  5. 在显微镜软件中使用多维采集模式，先以10倍差分干涉差（DIC）照明定位类球体，然后扫描Z平面，确定涵盖整个类球体高度的范围。
  6. 点击Z序列，将Z扫描的上限设为略高于类球体顶部，下限设为略低于类球体底部。
  7. 使用软件推荐的步长、最大增益和每种荧光信号的最小曝光时间，分别在488 nm激发钙黄绿素-AM（活细胞；绿色）和561 nm激发乙啶同二聚体-1（死细胞；红色）。
  8. 点击采集，获得类球体内活细胞与死细胞的复合Z层叠图像 。
  9. 使用图像处理软件，通过分析复合Z投影图像中对应于活细胞通道的像素强度百分比与对应于死细胞通道的像素强度百分比，量化活/死细胞比例。
    注意：由于使用二维投影量化三维结构存在局限性，另一种量化悬滴板中活/死荧光信号的方法是采用酶标仪，按照钙黄绿素-AM和乙啶同二聚体-1试剂盒附带的方案进行操作。

8. 免疫荧光

  1. 加热低熔点的2%琼脂糖溶液，使其保持黏稠状态且温度略高于熔点，然后将其置于显微镜载玻片上，形成柔软的琼脂糖基质。
  2. 用20 μL PBS推动液滴中的类球体进入2%琼脂糖软基质中，以收获类球体。
    注意：此操作应迅速完成，以免琼脂糖在类球体嵌入前凝固。
  3. 待琼脂糖冷却并凝胶化，将收获的类球体固定在其中（通常在5分钟内完成），加入4%中性缓冲甲醛溶液以固定类球体。或者，可改用预冷甲醇，在-20 °C条件下固定琼脂糖包埋的类球体30分钟。
  4. 用1× PBS洗涤3次，每次5分钟，每次洗涤后弃去PBS。
  5. 在室温下用含10%血清（如马血清）和0.15%去污剂溶液（Triton X-100）的1× PBS封闭1小时。
  6. 用1× PBS洗涤3次，每次5分钟，每次洗涤后弃去PBS。
  7. 按照推荐或预先确定的抗体稀释比例（例如，荧光标记的鬼笔环肽按1:100稀释），加入目标荧光抗体对类球体进行染色，并在室温避光条件下孵育至少90分钟。
    注意：不同抗体及其靶标所需的实验方案可能有所不同，抗体稀释比例需根据具体实验进行优化。
  8. 使用倒置共聚焦显微镜，并参照前文所述的类球体成像方法，观察荧光染色的类球体。
  9. 复合z轴层扫图像将展示类球体的三维形态结构。

9. 使用流式细胞术收集和分析肿瘤干细胞群体

  1. 制备用于流式细胞术分析的球状体
    1. 使用1,000 µL移液器从悬滴板的每个孔中收集类球体，并将其转移至15 mL离心管中，通过反复移液进行解离。
    2. 使用台盼蓝染色法，按照上述方法在血细胞计数板上计数活细胞，以确定细胞数量和浓度。
    3. 将细胞悬液分装至五个微量离心管中，每管至少含有50,000个细胞。
    4. 将所有试管在400 x g下离心 g 在微量离心机中离心5分钟。
    5. 吸弃每支试管中的上清液，并将沉淀重悬于100 μL缓冲液中。
    6. 分别标记试管为“未染色”、“DAPI”、“APC-iso”、“DEAB”和“ALDH/CD133”。
    7. 向 APC-iso 管中加入 0.5 μL APC 同型对照抗体，向 ALDH/CD133 管中加入 1 μL CD133 抗体，抗体用量根据系列稀释结果及生产商推荐确定。
    8. 向DEAB管中加入5 μL DEAB试剂和0.5 μL ALDH，向ALDH/CD133管中加入1 μL ALDH。
    9. 将所有试管涡旋约2秒，于37 °C孵育45分钟。
    10. 再次涡旋混匀所有离心管，并在400 x g 在微型离心机中离心5分钟。
    11. 标记FACS管为“未染色”、“DAPI”、“APC-iso”、“DEAB”和“ALDH/CD133”，并放入隔热泡沫容器中备用。
    12. 吸弃上清液，将“未染色”对照管重悬于400 μL FACS缓冲液（含2% FBS的1×PBS）中，其余各管重悬于400 μL FACS DAPI缓冲液（含300 μM 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚的FACS缓冲液）中。
    13. 将试管置于装有冰的容器中，直至在流式细胞仪上进行分析。
      注意： 为分选卵巢癌干细胞，收集流式细胞仪检测显示为ALDH+和CD133+的所有细胞，设门时应包含0.5%非特异性APC信号和0.15%非特异性ALDH+信号。为获得可靠结果，至少需分析10,000个细胞。更多细节可参见近期发表的文献。3,17.
  2. 在FlowJo中分析ALDH+/CD133+细胞群
    1. 双击 FlowJo 单击图标打开程序，将流式细胞术软件生成的.fcs文件拖入工作区。
    2. 双击 未染色 文件中将 y 轴设置为侧向散射高度（SSC-H），x 轴设置为前向散射高度（FSC-H）。
    3. 点击 T 单击每个坐标轴旁边的按钮，调整比例和转换方式，以最大化不同细胞群体之间的分离效果。
    4. 点击 多边形 门控按钮，并在细胞群周围绘制多边形门控，将该细胞群标记为“Cells”。
    5. 双击 细胞 在工作区中选择“Cells”群体以仅显示该群体内的细胞，然后点击FSC轴，将轴通道更改为FSC-宽度，再点击SSC轴，并将轴通道更改为FSC-H。
    6. 选择 矩形 使用门控工具，在y轴全范围内围绕最左侧的致密细胞群绘制一个矩形门，以排除窗口右侧可能的双细胞复合物，并将此门标记为“单细胞”。
    7. 右键单击并复制 细胞 以及嵌套的 单细胞 门控并将其粘贴到工作区中每个样本下方。
    8. 双击 单细胞 在工作区中，点击嵌套在DAPI样本下的门控，以查看该样本管中的单细胞群体，然后点击FSC轴，并将轴通道更改为DAPI-Area通道。
    9. 点击 SSC 轴并将轴通道更改为 直方图.
      注意：活细胞将位于左侧 活细胞会排除DAPI，而死细胞则会摄入DAPI并在图中偏向右侧显示。
    10. 点击 T 按钮旁边的下一个 DAPI 轴并单击 自定义坐标轴 调整比例，以最大化DAPI阳性和DAPI阴性峰之间的分离度。
      注意： 将弹出一个包含缩放选项的窗口。通常情况下，设置 比例尺 将场调整至Biex，并调节额外负十倍程和宽度基准，可实现最大程度的分离。
    11. 点击 应用 在弹出窗口中选择以应用缩放更改， 范围 门控按钮，并将其覆盖在DAPI阴性峰上，对应于活细胞群体。
    12. 将此门标记为“Live Cells”，右键单击以复制“Live Cells”门，并将其粘贴至“APC-iso”、“DEAB”和“ALDH/CD133”管中“Single Cells”门下方，以在每个样本管中选择相同部分的活细胞。
    13. 然后双击 活细胞 在APC-iso样本文件下嵌套的群体中，将x轴切换为ALDH—Area通道，y轴切换为APC—Area通道。
    14. 再次通过点击调整坐标轴刻度 T 按钮和 自定义坐标轴 每个轴的范围，使事件位于图的左下区域，并选择 四联 门控选项，然后单击图表窗口以建立象限门。
    15. 调整门控交叉点，使约0.5%的细胞群体位于图窗的左上角或“APC阳性”象限。
      注意： 该0.5%代表APC同型对照的非特异性染色。
    16. 在工作区中，分别右键单击每个象限标签，并将其重命名为适当的名称。在工作区中，按住 Control 键或 Command 键并单击每个象限门控标签，然后复制它们。
      注意： ‘Q1’代表CD133+细胞；‘Q2’代表CD133+和ALDH+细胞；‘Q3’代表ALDH+细胞；‘Q4’代表CD133-和ALDH-细胞。
    17. 将象限门粘贴到 活细胞 位于“DEAB”文件下的细胞群。调整垂直线，使约0.15%的细胞群位于“ALDH+”象限内，注意不要移动水平线。
      注意： 该0.15%代表非特异性的ALDH信号。
      1. 为确保水平线位置不变，复制嵌套在下方的新象限门 DEAB 文件并粘贴到 活细胞 在APC iso文件下。选择 是 当被要求替换现有的象限门时。
      2. 在工作区中确认“APC-iso”文件下的“CD133+”百分比仍约为0.5。
    18. 将象限门复制并粘贴到“ALDH/CD133”文件的“活细胞”群体中。
      注意： 位于右上象限的活细胞群体百分比即为样本中ALDH+和CD133+双阳性肿瘤干细胞（CSCs）的百分比。

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结果

使用细胞系或患者来源的CSCs形成的球状体，可在悬滴中以少量细胞形成（图 2A）。每个孔中仅需10个细胞即可稳定形成类球体，有助于节约珍贵的患者样本。这些类球体中的细胞在三维空间中被其他细胞包围，类似于体内环境，可实现生理性的细胞间接触和扩散速率。类球体内的肿瘤细胞不断增殖，导致类球体随时间推移逐渐增大。图2B）。由于更具侵袭性的患者细胞或细胞系比其对应细胞生长更快，因此量化每个样本的增殖能力，并考察药物处理对各样本增殖的影响至关重要。为此，可利用384孔生理学平台便捷地开展基于代谢活性的检测，例如基于刃天青的荧光检测法，无需收集类球体，检测结果如图所示 图2C可同时收获多个类球体，经固定、切片后，使用苏木精和伊红或免疫荧光抗体染色，以鉴定类球体内的细胞形态与排列结构，以及细胞类型和细胞外基质蛋白的分布情况（图2D，E).

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讨论

用于3D球状体形成的384孔悬滴培养板平台是一种易于实施的工具，适用于任何细胞生物学或癌症生物学实验室。该生理学平台能够在具有生理相关性的三维培养环境中研究细胞系以及原代患者样本，同时支持高通量药物筛选。该平台还可高度调节培养条件，精确控制接种密度、细胞 共培养比例、细胞外成分及培养基组成。此外，该生理学平台使实验能够高度兼容下游分析技术，适用于需要大量或少量细胞的检测方法，如qRT-PCR、FACS以及多种成像技术。尽管操作熟练程度需通过经验积累，但新学员一旦掌握移液的速度与技巧，即可迅速成功操作。因此，该生理学平台非常适用于个体化3D药物筛选、肿瘤干细胞（CSC）生物学及化疗耐药性研究。

在首次实施该平台时，需要注意的几个问题包括培养板转移和药物处理。在进行常规换液、成像和分析等操作而需要将培养板从一个位置转移到另一个位置时，应采取谨慎措施，避免不必要的晃动。应从培养板的外缘抓握，并尽可能保持其水平，在放置培养板时注意避免突然的撞击动作。这有助于防止液滴丢失或相邻液滴合并。同样，在对悬滴球状体 进行药物处理时也应保持高度警惕，以避免某个悬滴球状体的给药剂量错...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究主要由美国国防部卵巢癌研究计划早期职业研究者奖 W81XWH-13-1-0134（GM）、美国国防部试点项目奖 W81XWH-16-1-0426（GM）、美国国防部研究者发起项目奖 W81XWH-17-OCRP-IIRA（GM）、Rivkin 卵巢癌研究中心以及密歇根卵巢癌联盟资助。本出版物中报告的研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助，项目编号为 P30CA046592。CMN 获美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号 1256260）支持。MEB 获美国教育部国家急需领域研究生资助（GAANN）奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibcoILT25200056
10 mL 血清移液管Fisher Scientific13-678-11E
10,000 cSt Si 油Millipore Sigma63148-62-9用于包被类球体阵列模具，以促进组织处理凝胶（如 Histogel）从模具中脱模。
100 mm 组织培养皿Thermo Scientific130182
15 mL 圆锥形离心管CelltreatFL4021
1× DMEM 无血清培养基Gibco11965-092
1× F12 无血清培养基Gibco11765-054
1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)GibcoILT10010023
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)Thermo FisherD1306
40 µm 滤膜Fisher Scientific22363547
6 孔板Fisher Scientific353046
AccutaseInnovative Cell Technologies Inc.1449一种温和的细胞解离酶，由蛋白水解酶和胶原酶组成。
ACK 裂解缓冲液Thermo ScientificA1049201
alamarBlueInvitrogenDAL1025刃天青染料，通过检测细胞将刃天青还原为高荧光性的试卤灵的能力，来评估细胞的活力和增殖能力。
ALDEFLUOR 检测试剂盒Stem Cell Tech1700用于鉴定高表达醛脱氢酶的干细胞和祖细胞的试剂盒，该酶是肿瘤干细胞的标志物。试剂盒包含 ALDEFLUOR 试剂、DEAB、盐酸、二甲基亚砜和 ALDEFLUOR 检测缓冲液。
ALDEFLUOR 二乙氨基苯甲醛 (DEAB)Stem Cell Tech1705二乙氨基苯甲醛 (DEAB) 是 ALDH 同工酶的抑制剂，用于确定非特异性 ALDH 染色。
Andor iXon x3 CCD 相机Oxford Instruments-
抗生素和抗真菌剂Gibco15240-062
APC-同型 IgG2bMiltenyi biotec130-092-217同型对照，用于量化 IgG2b 抗体的非特异性染色。
B27 添加剂Gibco17504044
碱性成纤维细胞生长因子Stem Cell Technologies78003.1
BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器Fisher Scientific14-826-79
BioTek Synergy HT 微孔板读数仪BioTek7091000
CD133-APCMiltenyi biotec130-113-184靶向 CD133 的荧光抗体，CD133 是肿瘤干细胞的标志物。
cellSens Dimension 软件Olympus
顺铂Sigma-AldrichP4394一种基于铂的化疗药物，作为烷化剂发挥作用，可破坏 DNA。
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)InvitrogenD1306
表皮生长因子GibcoPHG0311
EVOS XL Core 细胞成像系统Life TechnologiesAME3300
胎牛血清 - 优质 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
Ficoll 400Sigma-AldrichF4375
血细胞计数板Hausser Scientific1490
HistogelThermo ScientificHG-4000-012组织处理凝胶，可渗透并固定样本于凝胶中，同时防止染色时样本周围出现变色。
人脂肪来源的间充质干细胞LonzaPT-5006
人微血管内皮细胞LonzaCC2543
胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂Gibco51500-056
活/死细胞活力检测试剂盒InvitrogenL3224基于荧光检测活细胞（钙黄绿素-AM）和死细胞（溴化乙锭同源二聚体-1）的试剂盒。
MEM 非必需氨基酸Gibco11140-050
MetaMorph 7.8 软件Molecular Devices-
Olympus IX81 倒置共聚焦显微镜Olympus-
Olympus IX83 研究型倒置显微镜Olympus
Parafilm MThomas Scientific7315D35热塑性聚合物薄膜，用于悬挂滴板中限制液滴蒸发，同时允许气体交换。
Perfecta 3D 384 孔悬挂滴板3D BiomatrixHDP1384-8可通过 Sigma-Aldrich 购买
鬼笔环肽 AlexaFluor488InvitrogenA12379鬼笔环肽是一种可对固定细胞中的 F-肌动蛋白进行荧光标记的多肽。
ProJet 3500 HD Max3D Systems-3D 打印机
无菌去离子水Fisher Scientific353046
台盼蓝Gibco15250061偶氮染料，根据其能否穿透死细胞受损的细胞膜（而不能穿透活细胞完整的细胞膜）来区分活细胞与死细胞。
VisiJet M3 Crystal3D Systems-一种用于 3D 打印的生物相容性聚合物材料。
Yokogawa CSU-X1 共聚焦扫描装置Yokogawa-

参考文献

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