我们描述了一种在溶液中利用锥板黏度计对血小板表面受体施加均匀剪切力的方法。该方法也可更广泛地用于对其他细胞类型和细胞碎片施加剪切力，且无需针对特定的配体-受体对。
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本文内容
摘要
摘要
许多生物细胞/组织通过机械感受器感知其局部环境的力学特性，机械感受器是一类能够响应压力或机械扰动等外力的蛋白质。机械感受器通过多种不同的机制检测刺激并传递信号。机械感受器最常见的功能之一是介导神经元对触觉和痛觉的反应，或毛细胞在平衡和听觉中的作用。机械感知对于经常暴露于剪切应力的细胞类型也至关重要，例如构成血管内壁的内皮细胞，或在正常循环过程中经受剪切力的血细胞。黏度计是用于检测流体黏度的装置。旋转黏度计还可用于对流体施加已知的剪切力。这些仪器能够向流体施加均匀剪切力的特性已被广泛应用于研究多种生物流体，包括血液和血浆。黏度测定也可用于对溶液中的细胞施加剪切力，并检测剪切力对特定配体-受体相互作用的影响。在此，我们利用锥板黏度计来检测内源性水平的剪切应力对经抗血小板机械感受器复合物GPIb-IX抗体处理的血小板所产生的影响。
引言
机械感受器是一类能够响应机械刺激（如压力或机械扰动/形变）的蛋白质。对于某些机械感受器而言，感知这些机械扰动是其所在细胞类型功能的明确组成部分。例如，压力感受性神经元中的牵张感受器；这些机械敏感性离子通道通过感知血管的"牵张"1,2来调节血压。在内耳中，毛细胞上的离子通道可检测由声波引起的机械形变3，而皮肤低阈值机械感受器（LTMRs）则促进触觉信息的传递4。在其他情况下，机械感受器为细胞提供有关黏附或生长建立的重要信息。细胞能够感知其局部环境的刚度，并可能依赖肌动蛋白细胞骨架和整合素介导的收缩力来决定其生长或铺展行为5,6。
在基于细胞或组织的模型中研究受体-配体相互作用时，已有多种常规检测方法可快速、准确地报告温度、pH、配体浓度、渗透压、膜电位以及体内可能变化的其他多种参数改变所产生的效应。然而，当涉及检测机械力在受体激活中的作用时，这些检测方法可能有所不足。无论细胞是在感知其微环境、检测声波，还是响应拉伸刺激，上述机械感受器的共同点在于，其配体、受体或两者均锚定于某一表面。为检测机械力对受体相互作用影响而开发的检测方法通常反映了这一范式。微流控技术和流动腔室被用于研究剪切流对细胞和受体的影响7,8。这类实验的优势在于可通过设定已知的流速精确调控剪切速率。其他技术则采用荧光分子探针来检测细胞在富含配体的表面上施加的力，从而准确读取参与相互作用的力的大小和方向9,10。
除了发生在一种或两种伙伴均锚定在表面时的机械感受外，剪切应力也可能影响溶液中的蛋白质和细胞。这种情况常在持续循环的血细胞/蛋白质中观察到，可能通过激活通常锚定在表面的机械感受器11，或通过暴露在静态条件下会被遮蔽的靶序列而表现出来12。然而，目前较少有技术能够检测剪切力对溶液中颗粒的影响。一些溶液中的方法通过以不同速度和时间涡旋悬浮液中的细胞来引入剪切力，但这些方法可能无法精确确定所产生的剪切应力。旋转粘度计通过向流体施加特定的剪切力来测量黏度。本文中，我们描述了一种用于确定特定层流剪切速率对溶液中细胞或细胞碎片影响的应用方法。
血小板表面表达最丰富的蛋白之一是糖蛋白（GP）Ib-IX复合物。GPIb-IX是血浆蛋白血管性血友病因子（VWF）的主要受体。长期以来，这一受体-配体对被认为是血小板响应剪切应力的基础13。当发生血管损伤时，VWF会结合至内皮下基质中暴露的胶原蛋白14，从而通过VWF-GPIb-IX相互作用将血小板募集至损伤部位。在生理剪切应力条件下，VWF与其在GPIb-IX复合物GPIbα亚基上的结合位点结合，可诱导靠近细胞膜的机械传感结构域（MSD）发生去折叠，进而激活GPIb-IX15。在最近的一项研究中，我们发现针对GPIbα的抗体（如许多免疫性血小板减少症（ITP）患者体内产生的抗体）同样能够在剪切应力条件下通过诱导MSD去折叠来触发血小板信号传导11。然而，与VWF不同的是，VWF通过在正常血流中将该复合物固定于表面来促进剪切诱导的GPIb-IX激活，而二价抗体则能够在循环中通过GPIb-IX交联血小板并诱导MSD去折叠。因此，这种通常依赖于剪切条件下表面固定才能激活的机械受体，可在溶液中被激活。在本报告中，我们将展示如何利用基于黏度计的均匀剪切实验来检测特定水平剪切应力对溶液中受体激活的影响。
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方案
本文所述使用供体来源人血小板的所有方法均经埃默里大学/亚特兰大儿童保健机构审查委员会批准。
1. 血液采集与血小板分离
- 在实验当天，通过静脉穿刺从知情同意的健康成年献血者体内采集血液，并使用3.8%枸橼酸钠抗凝。对于血小板计数接近250 × 103/μL的献血者，一支4.5 mL的采血管所采集的血液足以获得可用于20–25个实验条件的富血小板血浆（PRP）。
注意：避免使用细口径针头（小于21 G）采血。 - 将样本在22 °C下以140 × g离心12分钟，使用较长的刹车时间，以制备PRP。离心后将形成两个明显分层：下层为红细胞，上层为浅色的富血小板血浆（PRP）。
- 使用剪成45°斜角的移液吸头小心吸取上层浑浊的黄色PRP层，并通过全血细胞计数（CBC）测定血小板数量。
- 如有需要，在含有前列腺素E1（PGE1）的PIPES缓冲盐水（150 mM NaCl，20 mM PIPES）中洗涤血小板，随后重悬于含5 mM葡萄糖的Tyrode's缓冲液（134 mM NaCl，0.34 mM Na2HPO4，2.9 mM KCl，1 mM MgCl2，5 mM葡萄糖，12 mM NaHCO3，20 mM HEPES，pH 7.35）中；否则直接进入步骤1.5。以下步骤简要描述洗涤过程：
- 用PIPES缓冲盐水将PRP体积调整至10 mL，并加入0.6 μM PGE1。
- 在1,900 × g下离心8分钟，弃去上清液，将血小板沉淀物在400 μL Tyrode's缓冲液与葡萄糖溶液中静置5分钟。
- 轻柔重悬血小板沉淀物，并静置30分钟，避免扰动。
- 使用混合的人类血小板贫乏血浆（PPP）将血小板浓度调整至约250 × 103个血小板/μL，并将悬液在22 °C下静置或缓慢旋转保存，避免扰动。
2. 配体与均匀剪切力处理
注意：第 2 节中所有需要移液的操作均应缓慢进行，以避免引入任何剪切力。
- 将所需的抗体或配体加入PRP或洗涤后的血小板中，通过上下吹打或用移液枪头轻轻搅拌混匀。室温下静置5-10分钟。向阴性对照中加入等体积的PPP或Tyrode缓冲液。
- 打开锥板黏度计，将板温设置为22 °C，并留出足够时间使板温达到设定值。
- 将处理后的PRP或洗涤血小板直接加到温控的锥板黏度计的板中央。确保所有样品均沉积在锥与板接触点之间的区域，而非锥边缘外侧。
- 以适当的速率和持续时间施加剪切力。
- 根据黏度计说明书或先前所述方法计算剪切力15,16。
- 通过牛顿黏性定律，由黏度和目标剪切应力确定剪切速率；
；血浆黏度为1.5-1.6厘泊（cP）17。例如，人体循环中的正常剪切应力范围为5-30 dyn/cm2，剪切作用时间应在个位数分钟量级。
- 将锥轻轻抬起约2 mm，使样品仍与板和锥保持接触，使用加样枪头或其他长型移液枪头从样品中心吸取5-10 μL。
- 将经剪切处理的样品与所需标记物在室温下孵育20分钟。针对磷脂酰丝氨酸、β-半乳糖和P-选择素暴露的标记物，分别使用0.08 μM的乳酸脱氢酶C2结构域（LactC2）18、6.25 μg/mL的刺槐凝集素（ECL）以及20 µg/mL的抗P-选择素抗体。
- 在稀释或冷藏前，用2%多聚甲醛在室温下固定样品20分钟，随后进行步骤3.1，或将样品在4 °C保存不超过12小时。
3. 通过流式细胞术检测表面标志物及交联
- 通过流式细胞术分析样品，每种条件下至少收集 20,000 个事件。
- 使用每种荧光染料强度的高度值或几何平均荧光强度（MFI）来定量荧光标记信号强度。
- 若旨在检测剪切处理后血小板的交联情况，则在具备成像功能的流式细胞仪上分析样品，并通过面积和长宽比参数定量交联程度。
- 绘制面积和/或长宽比的直方图。
- 使用牛血清白蛋白（BSA）或溶剂作为阴性对照，设定门控以排除大多数完全圆形的事件（该门控通常设在长宽比约为 0.819,20 处），并定量门控内事件所占百分比。长宽比较低的事件更可能为交联事件。
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结果
图1概述了GPIb-IX活化的触发模型，该模型最初用于解释当受体锚定在血管壁上时依赖剪切力的受体激活机制，也可能支持由多价配体交联的血小板的活化。图2展示了在剪切和静态条件下，使用两种靶向GPIb-IX N端结构域的抗体（6B4和11A8）以及一种对照抗体（正常IgG）处理人血小板后，血小板活化的检测结果。在图3中，血小板经6B4和一种解离力过低而无法触发GPIb-IX活化的抗体AK2处理。图4显示了时间进程实验的结果，在使用11A8或AK2进行剪切处理的过程中，于不同时间点检测血小板活化标志物。在图5a中，通过常规流式细胞术检测了抗体交联的、表面修饰有GPIb-IX N端结构域的血小板大小微球。图5b展示了通过成像...
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讨论
本论文所述方案可快速、多用途地评估层流剪切力对血小板及细胞表面受体的影响。本文展示的代表性结果特别强调了多聚体或双价配体的作用如何受到剪切流的影响。除了这一应用之外，均匀剪切实验在观察依赖剪切力的效应方面具有广泛的应用价值。在未知配体-受体对的情况下，均匀剪切实验还可用于检测剪切力对细胞形态和信号传导等因素的影响，尤其是与流式细胞术分析相结合时。如图5b部分所述，均匀剪切实验不仅可补充本方案中所述的标准流式细胞术分析，还可兼容多种其他检测方法，包括成像、生物化学以及基于细胞的检测分析。
图2 展示了该检测方法的基本应用，用于区分剪切力依赖性的配体-受体相互作用与阴性对照。6B4 是一种可通过结合 GPIb-IX 受体交联血小板并产生足够作用力以激活该受体的抗体11，在受到剪切力作用时可激活血小板（如 图1 模型所示），而对照...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究相关工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家心肺血液研究所资助项目HL082808、HL123984（R.L.）和F31HL134241（M.E.Q.）的支持。此外，还获得了NIH国家普通医学科学研究所T32GM008367培训项目资助（M.E.Q.），以及亚特兰大儿童保健中心和埃默里大学儿科流式细胞术核心实验室提供的试点项目资金。作者谨此感谢Hans Deckmyn博士分享6B4抗体，同时感谢埃默里儿童研究中心流式细胞术核心实验室提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| APC 标记抗人 CD62P（P-选择素） | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ 黏度计 | Brookfield | - | |
| FITC 标记刺槐凝集素（ECL） | Vector Labs | FL-1141 | |
| 混合正常人血浆 | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer 浅蓝色采血管（含柠檬酸钠） | BD | 369714 | |
| Vacutainer 采血套装，21G × ¾" 针头 | BD | 367287 |
参考文献
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