这种使用双链DNA嵌 intercalating 染料的实时逆转录PCR适用于狂犬病病毒属感染的诊断。该方法从疑似狂犬病的生前或死后样本中提取RNA开始，详细说明了扩增反应主混合液的配制、RNA的加入、实时PCR仪的设置以及结果的正确解读。
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摘要
摘要
分子检测具有快速、灵敏和特异性强的特点，已成为狂犬病诊断的核心手段。基于PCR的检测方法已被用于确诊狂犬病数十年，但直到最近才被世界动物卫生组织（OIE）接受为检测狂犬病感染的主要方法。实时荧光定量RT-PCR检测可提供实时数据，且为闭管系统，能够在操作过程中最大限度地降低污染风险。使用DNA嵌入型荧光染料的实时荧光定量RT-PCR检测无需昂贵的探针，从而降低了每份样本的检测成本；当引物设计在保守区域时，还可实现对整个病毒属而非仅单一病毒种的特异性检测。本文介绍一种泛型狂犬病毒属SYBR实时荧光定量RT-PCR检测方法，可检测Lyssavirus属内的各类狂犬病毒，包括基因差异最大的IKOV、WCBV和LLEBV病毒。结合解离曲线分析，该检测方法具有高灵敏度和高特异性，能够检测所有狂犬病毒种，具有显著优势。目前该方法已被多个具备质量保证环境的诊断实验室采用，可对动物和人类狂犬病病例实现可靠、快速且灵敏的诊断。
引言
2018年，世界动物卫生组织（OIE）正式认可采用分子生物学方法诊断狂犬病1，肯定了这些技术在确诊狂犬病病例方面的优势，尤其是在样本质量欠佳或需要进行生前诊断的情况下，因其无需活病毒或新鲜样本。由于丽沙病毒的基因组为RNA，因此针对该病毒的PCR检测需在PCR扩增前进行逆转录（RT）。检测基因组3’端近端区域的RT-PCR检测方法被认为具有最高的灵敏度，因为在丽沙病毒复制过程中存在转录梯度现象。常用的RT-PCR检测方法大致可分为两类：终点法（或称凝胶电泳法）和实时荧光定量法。两种方法均具有较高的灵敏度和特异性；然而，实时荧光定量法具有一些额外优势，例如可实时获取结果，并可在完全封闭的管内系统中完成操作，从而降低操作人员造成污染的风险。目前主要有两种方法用于检测实时荧光定量检测所获得的丽沙病毒特异性扩增产物。第一种方法利用水解探针（如TaqMan探针），其包含荧光报告基团和荧光淬灭基团。当探针在扩增过程中与靶序列结合时，DNA聚合酶的外切核酸酶活性会导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生可被检测的荧光信号。第二种方法则使用DNA嵌入型染料（如SYBR Green等荧光染料），该染料在扩增过程中与双链DNA结合。结合后的荧光染料在每个扩增循环中发出荧光信号，从而实现对扩增产物的实时检测与定量。由于该染料可非特异性地结合任何双链DNA，因此需通过熔解曲线分析来确认反应的特异性。实时荧光定量RT-PCR因扩增片段较短（通常小于200 bp）而具有较快的检测速度；然而，在保守区域中选择合适位点设计引物和探针仍具挑战性，因此无需使用探针的方法具有明显优势。
已设计出多种实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，用于特异性检测狂犬病病毒（RABV）2 的不同毒株或谱系，以及检测整个丽沙病毒属（lyssaviruses）的病毒3,4,5,6,7,8,9。所有检测方法的检出限均取决于引物（以及必要时探针）序列在该属病毒中的保守程度。事实上，新出现或新型的病毒毒株可能导致高度特异性的探针法检测失效。实时检测方式（染料法 vs. 探针法）的选择取决于预期应用。对于开展本地脑组织样本监测且预计阴性样本数量较多的实验室，使用成本较低的嵌入性染料是合理的选择。当进行广谱监测时，若存在新型或差异较大的丽沙病毒，受限于探针法检测范围，这些病毒可能无法被检出，此时采用SYBR Green染料法更为理想。
狂犬病病毒属（Lyssavirus）的所有成员均可引起狂犬病，该病一旦出现症状即为致命。绝大多数人和动物的狂犬病病例均由狂犬病病毒（RABV）引起，其主要储存宿主为家犬10。蝙蝠是丽沙病毒的重要宿主储存库，目前已鉴定的几乎所有丽沙病毒种类均直接来源于蝙蝠，仅有两种例外——伊科马丽沙病毒（Ikoma lyssavirus, IKOV）和莫科拉病毒（Mokola virus, MOKV）；其中，IKOV 被推测也可能以蝙蝠为储存宿主11。除已确认的16种丽沙病毒物种外12，最近还新描述了两种丽沙病毒：台湾蝙蝠丽沙病毒（Taiwan bat lyssavirus, TWBLV）13和科塔莱赫蒂蝙蝠丽沙病毒（Kotalahti bat lyssavirus, KBLV）14。丽沙病毒在遗传上可分为三个谱系群，其中大多数丽沙病毒（包括 RABV）属于基因谱系群 I。然而，进化上最远缘的丽沙病毒属于基因谱系群 III，使用针对 RABV 或基因谱系群 I 病毒序列设计的 RT-PCR 方法难以检测到这些病毒。
本文所述检测方法采用2005年首次报道的实时引物对JW12-N1653。该引物对设计用于泛型狂犬病毒属（pan-lyssavirus）检测，尽管其最初应用为使用探针区分狂犬病毒属不同物种的TaqMan检测。后续通过在所有可获得的狂犬病毒属物种（包括WCBV）上采用两步法SYBR实时检测，证实了该引物对具有泛型狂犬病毒属的特异性15。本文描述了该引物对在一步法RT-PCR实时检测中的应用，使用嵌入型荧光染料，并利用全部16种已确认狂犬病毒属物种的代表株进行了验证。该一步法实时检测是一种快速、灵敏、特异性的狂犬病毒属检测方法，证明了该引物组在识别高度分歧的狂犬病毒属物种方面具有良好的稳健性。
方案
样本来自自然感染后送至英国动物健康署（APHA）的诊断材料，或通过小鼠接种获得，接种方案经APHA伦理与统计委员会根据英国内政部许可证70/7394的规定进行评估。
1. 使用微量分光光度计定量RNA
- 将分光光度计的设置调整为RNA模式。
- 使用1–2 µL的分子生物学级水初始化仪器并设定基线。
- 使用1–2 µL的每种待测RNA样品测定RNA浓度。
- 保存读数并进行记录。
- 如有需要，将RNA浓度调整至1 µg/µL。
注意：RNA在操作过程中必须始终置于冰上（或冷却块中）。若RNA通过柱式或磁珠法提取，其浓度通常低于1 µg/µL，此时应直接使用未经稀释的RNA样品。
2. 制备RNA稀释系列以确定终点灵敏度
- 对RNA进行10倍系列稀释。
- 用稀释梯度（例如，10-1、10-2等）和RNA详细信息标记各离心管。
- 向每管中加入45 µL分子生物学级水。
- 加入5 µL RNA（先前稀释至1 µg/µL），充分混匀。
- 将移液器吸头丢弃至适当的消毒液中，并更换新的吸头。
- 从10-1管中取5 µL加入10-2管中，充分混匀。
- 对剩余的稀释管重复步骤2.1.3–2.1.5。
注意：RNA必须始终置于冰上（或冷块中）。
3. 实时荧光定量RT-PCR反应的制备
- 使用电子表格根据检测样本和对照样本的数量，为狂犬病病毒（lyssavirus）和β-肌动蛋白（ß-actin）检测设计板式布局。
注意：若需对4个样本进行双复孔检测，并设置阳性和阴性对照，则每项检测共需10个反应。 - 在与RNA模板操作区域分离的“洁净室”或独立区域，使用适当的消毒剂擦拭工作台面后再开始操作，或准备PCR工作站（如使用）。准备工作站时，先用适当的消毒剂擦拭柜内表面，将所需物品放入工作站后关闭门，开启紫外灯照射10分钟。
- 从冰箱中取出试剂和引物并解冻（试剂见表1，引物见表2）。
注意：酶混合液含有甘油，无需解冻，必须始终置于冰上（或冷却块中）。其他所有试剂可在室温下解冻。 - 解冻后，轻轻混匀各试剂，并短暂离心以收集管壁液体。
注意：酶混合液不可涡旋震荡，仅需短暂离心。 - 分别为狂犬病病毒（lyssavirus）和β-肌动蛋白（ß-actin）检测配制独立的预混液。每反应加入7.55 µL分子级水、10 µL 2x通用SYBR Green反应预混液、0.6 µL正向引物、0.6 µL反向引物、0.25 µL iTaq RT酶混合液。
- 使用电子表格计算正确体积，避免手动计算错误。确保配制的预混液总量足以补偿移液误差。例如，若需要10个反应（见3.1中的注释），应配制12个反应的量。
- 在冰上（或冷却块中）配制预混液，并始终保持在冰上，直至放入实时PCR仪中。
- 将配制好的预混液轻轻混匀，短暂离心后，向与实时PCR仪兼容的条形管或96孔板的相应孔中加入19 µL预混液。
注意：移液过程中应尽量减少孔中气泡的产生。 - 在另一个独立房间，或在如3.2所述准备好的紫外灯柜内，小心地将1 µL已调整至1 µg/µL的RNA（见步骤1.5）加入对应预混液孔的液面以下，并轻柔混匀。使用后的枪头应直接丢入消毒液中（浸入液面下）。
- 在加完待测样本后，依次加入对照样本，先加阳性对照，最后加无模板对照（NTC，即分子级水）。所用RNA的量可根据样本类型和RNA提取方法进行调整，但必须经过验证以确保反应条件最优化。
- 使用条形管盖或封板膜密封板孔，确保所有盖子紧密闭合，并清晰标记以便识别样本位置。在板或条形管边缘进行标记。
- 将样本板短暂离心，使所有液体沉至孔底。
- 将板转移至实时PCR仪中，打开仪器门，将板放入指定位置，确保样本的排列位置和方向与板式设计一致。
注意：若使用条形管，需确认支架已正确安装。 - 打开实时PCR仪程序，选择带有解离曲线分析的SYBR实时检测模式。根据表3中指定的热循环条件设置程序，包括数据采集点。
- 选择SYBR作为荧光染料，选择未知样本作为样本类型，并在相应的样本名称框中输入名称。
注意：需区分不同复孔，以及狂犬病病毒（lyssavirus）和β-肌动蛋白（ß-actin）检测孔。 - 选择保存实验数据的文件路径，确认运行结束后光源将自动关闭，然后启动运行。
注意：由于第一步为反转录（RT）阶段，此期间不采集数据，因此若光源需要预热，可在RT阶段完成预热。实时PCR仪及其软件将实时显示扩增曲线，熔解曲线将在循环结束后生成。
4. 数据分析
- 运行完成后，按以下步骤进行数据分析。
- 首先，将检测样本与对照样本的扩增曲线结果进行分析。阳性样本显示指数增长阶段，通常随后进入平台期，并具有 Ct 值；阴性样本则呈现平坦的扩增曲线，无 Ct 值（图1A）。Ct 值由软件自动计算，但应进行检查，并在必要时手动调整。
- 其次，分析检测样本与对照样本的解离曲线结果。阳性样本的熔解温度（Tm）为 77–80 °C，并与阳性对照的曲线重叠（图1B）。
- 通过确认对照结果有效，获得总体诊断结论。使用表4结合内参 ß-actin 控制结果进行结果判读。若阳性对照样本呈阴性，和/或阴性对照样本呈阳性，则该次运行结果应作废。
- 将对照RNA获得的 Ct 值和 Tm 值记录在“对照卡”中，以便进行趋势分析，并有助于识别检测灵敏度的偏移情况。
结果
按照上述方案，通过针对对照标准病毒（CVS）的系列稀释实验，验证了泛型狂犬病毒RT-PCR的检测灵敏度（图1）以及其他多种丽沙病毒（图2 和 图3）。SYBR Green I 染料被用于通用的一步法 RT-PCR，其中 cDNA 合成与 PCR 扩增在同一管中进行。随着特异性靶标扩增的进行，染料结合量增加，导致荧光信号实时增强。所有基于染料嵌合的实时检测必须从两个阶段进行解读：扩增阶段与解离阶段。扩增阶段与任何实时扩增过程相同（图1A）。在早期循环中存在一个线性的“初期阶段”，由于信号相对于背景过低，无法计算DNA扩增量。该阶段的长短与样本中靶标物的含量直接相关。随后进入指数扩增阶段，此时可检测并记录DNA分子的倍增。最后达到平台期（极少数高度稀释的样本可能在程序结束前尚未进入此阶段）。在此阶段，由于试剂耗尽，荧光强度趋于平稳。使用CVS进行10倍系列稀释所获得的扩增曲线符合预期的扩增曲线（图1A，C) 在该条件下，狂犬病病毒属检测法比β-肌动蛋白检测法具有更高的灵敏度。扩增结束后进行解链曲线分析，通过逐步升高温度使双链DNA（dsDNA）解离为单链DNA（ssDNA），并监测荧光信号随温度变化的情况（图1B，D-F）。特异性扩增子解离为单链DNA的阈值温度导致荧光释放，该信号由热循环仪软件测量（Tm）。该解离相阶段提供了扩增子大小的数据，使用户能够通过与阳性对照比较来解读结果，从而几乎排除了假阳性结果的可能性。Tm 使用泛丽沙病毒检测法对 CVS 进行观察（图1B) 和 β-actin 检测（图1D）是不同的，通过注明T有助于用户确认正确的检测分析m 获得（图1E）。此外，Ct 和 Tm 不同实验批次及操作人员之间的数值经评估显示具有可重复性（表5). 用于计算 C 的阈值t 值由软件自动计算得出，取决于多种因素，包括反应体系或所用仪器。在12次独立运行中，平均Ct 狂犬病毒属检测的均值为20.66（标准差0.63），β-actin检测的均值为27.5（标准差1.13）。相比之下，T中观察到的变异m 值明显较低，因为该测量未受到外部因素的影响。例如，平均 Tm CVS狂犬病病毒检测的值为78.92（SD 0.16）（表5），与所有丽沙病毒的平均值相比 78.81 °C （标准差 0.531）（表6 和 图1F）。这种在T中的缺乏变异m 跨越 丽沙病毒 属水平具有优势，因为无论样本中的丽沙病毒种类如何，均可使用相同的对照RNA，但利用T区分不同丽沙病毒物种时m 是不可能的，尤其是因为不同的RABV亚谱系遍布了T的整个范围m 观察到的值（表6）。本实验中极少观察到非特异性扩增曲线；然而，仍需设定特定参数以区分阳性结果与非特异性的阴性结果。采用所有丽沙病毒（lyssaviruses）中观察到的标准差（SD，0.531），应用于最低（77.34 - LBVa）和最高（79.67 - IKOV）的观测T值m 设定范围的值 76.8 °C - 80.2 °C 用于检测特异性阳性条带。因此，Tm 在此范围之外的值被视为非特异性，因此结果为阴性。偶尔会在样本中观察到多个峰。如果主峰位于正确的Tm （每个重复样本）则视为阳性。出现非特异性峰最常见的原因是引物二聚体，本检测已优化以最大限度减少引物二聚体的形成。引物二聚体通常产生的扩增子比目标序列更小，因此其Tm 低于该特定产品。
使用TRIzol提取的三种狂犬病病毒阳性脑组织样本RNA，进行10倍梯度稀释后，平行检测并绘制结果（图2）。三种丽沙病毒的检测下限各不相同，但均未超过 Ct 36. R2 病毒的系数值绘制在 图2 范围在0.9637至0.996之间。针对所有分析的病毒（表6）该范围未超过此值，此外，29种丽沙病毒中有7种的R2 >0.99（数据未显示）。考虑到稀释系列的制备来源于总RNA提取物，所观察到的线性表明该检测方法具有良好的稳健性。最后，通过一组涵盖狂犬病病毒属全部三个遗传群的RNA样本，对所有狂犬病毒属物种（特别是遗传多样性最高的第三遗传群病毒）的检测能力进行了评估。 丽沙病毒 属。采用上述方案，利用从原始或实验感染的小鼠脑组织中提取的 RNA 进行检测。结果证实，这些引物可扩增所有狂犬病病毒属物种，包括进化分支 III 中差异较大的狂犬病病毒属病毒 IKOV、WBCV 和 LLEBV（表6 和 图3). 一组多样化的非丽沙病毒属弹状病毒，最初经收集并进行抗原分析16，以及最近的基因学方法17 进行了筛选，未检测到交叉反应，表明引物对属于该类群的成员具有特异性 丽沙病毒 仅属水平（数据未显示）。自2013年以来，泛型狂犬病病毒实时检测法已被纳入欧盟参考实验室（EURL）的实验室间能力验证计划，与其他分子检测方法（如泛型狂犬病病毒TaqMan检测法和常规RT-PCR检测法）以及荧光抗体试验（FAT）相比，显示出100%的一致性。
图1：狂犬病毒属广谱RT-PCR检测法中CVS阳性对照RNA的10倍系列稀释，显示为扩增曲线（A）和解离曲线（B）；β-肌动蛋白RT-PCR检测法中显示为扩增曲线（C）和解离曲线（D）。 NTC = 无模板对照。CVS对照RNA在狂犬病毒属广谱RT-PCR检测（蓝色）与β-肌动蛋白RT-PCR检测（红色）中的解离曲线比较（E），平均值见表5；最后为LBVa（蓝色）与IKOV（红色）的解离曲线，展示在整个Lyssavirus属中观察到的Tm值范围（F）。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：三种丽沙病毒属物种的10倍系列稀释：RABV (RV108)、DUVV (RV131) 和 ARAV (RV3379)。其R2值分别为0.996、0.9962和0.9637。在10-7（0.0001 ng/µL）的数据点达到检测限（在此处仍获得数值）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：来自Lyssavirus属的代表性10倍系列稀释数据（参见各图注以了解丽沙病毒种类信息，以及表6中与其他丽沙病毒的比较结果）。 图中A、C、E、G为扩增曲线，B、D、F、H分别为对应A、C、E、G的解离曲线。请点击此处查看该图的高清版本。
| 试剂 | 每反应体积 (μL) |
| 分子级水 | 7.55 |
| 2x Universal RT PCR 反应混合液 | 10 |
| 正向引物 [20 μM] | 0.6 |
| 反向引物 [20 μM] | 0.6 |
| RT 酶混合液 | 0.25 |
| 每反应总体积 | 19 |
表1：泛狂犬病毒实时荧光定量RT-PCR反应体系试剂。
| 检测 | 引物名称 | 引物作用 | 序列 5’-3’ | 位置1 |
| 丽沙病毒 | JW12 | RT-PCR | ATG TAA CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | PCR | GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA | 165-146 | |
| ß-actin | ß-actin intronic | PCR | CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| ß-actin reverse | RT-PCR | AAG CAT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| 引物位置参照巴斯德病毒序列（M13215）和小鼠 ß-actin 基因序列（NM_007393）给出 | ||||
表2：泛丽沙病毒实时逆转录PCR引物详情。
| 阶段 | 循环数 | 温度 | 时间 | 数据采集 |
| 逆转录 | 1 | 50 °C | 10 min | |
| RT失活/初始变性 | 1 | 95 °C | 5 min | |
| 扩增 | 40 | 95 °C | 10 s | |
| 60 °C | 30 s | 终点 | ||
| 解离曲线分析 | 1 | 9 °C | 1 min | |
| 55 °C | 1 min | |||
| 55 - 95 °C | 10 s | 所有点 |
表3：泛丽沙病毒实时反转录PCR循环条件。
| 检测结果 | 内部ß-actin对照 | 总体结果 |
| 阴性 | 阴性1 | 无效。需重复提取并重新检测2 |
| 阴性 | 阳性 | 报告为阴性结果 |
| 阳性 | 阳性 | 报告为阳性结果 |
| 阳性 | 阴性1 | 需重复提取并重新检测3 |
| 1重复提取过程中使用异源外部对照将更有利。 | ||
| 2 若内部对照再次获得阴性结果，则该样本将被报告为本检测方法无法检测。 | ||
| 3 若内部对照再次获得阴性结果，同时检测结果为阳性，则应进行第二项狂犬病 | ||
| 诊断检测以确认该结果。 | ||
表4：泛型狂犬病毒实时RT-PCR检测结果汇总及总体结果。 阴性定义为无Ct值（无扩增）且无熔解温度（解离曲线），或熔解温度超出阳性狂犬病毒的Tm范围（76.8 °C – 80.2 °C）的样本；阳性定义为具有Ct值（扩增）且熔解温度（解离曲线）落在阳性狂犬病毒Tm范围内的样本。
| 狂犬病毒属检测 | β-肌动蛋白检测 | |||
| Ct | Tm | Ct | Tm | |
| 均值 | 20.66 | 78.92 | 27.5 | 85.26 |
| 标准差 | 0.63 | 0.16 | 1.13 | 0.35 |
| 95% 置信下限 | 19.39 | 78.59 | 25.23 | 84.56 |
| 95% 置信上限 | 21.93 | 79.25 | 29.76 | 85.96 |
表5：12次独立实验中多位操作者对CVS阳性对照的批间分析。
| 系统发育群 | 物种 | 病毒编号 | 谱系 | 检测下限 | Tm |
| I | RABV | RV50 | 美国蝙蝠 | 10-5 | 79.5 |
| I | RABV | RV51 | 美国狐狸 | 10-7 | 77.6 |
| I | RABV | RV108 | 智利蝙蝠 | 10-7 | 78.63 |
| I | RABV | RV313 | 欧洲狐狸 | 10-9 | 78.53 |
| I | RABV | RV437 | 欧洲浣熊犬 | 10-7 | 78.09 |
| I | RABV | RV1237 | 欧洲鹿 | 10-8 | 78.76 |
| I | RABV | RV334 | 中国疫苗株 | 10-8 | 79.03 |
| I | RABV | RV102 | 非洲2 | 10-7 | 78.58 |
| I | RABV | RV995 | 非洲3a | 10-8 | 79.66 |
| I | RABV | RV410 | 非洲3b | 10-7 | 79.03 |
| I | RABV | RV2324 | 非洲4 | 10-7 | 79.17 |
| I | RABV | RV2417 | 斯里兰卡犬 | 10-9 | 78.71 |
| I | RABV | CVS-11 | 10-7 | 79.17 | |
| I | EBLV-1 | RV20 | 德国 | 10-6 | 79.05 |
| I | EBLV-2 | RV1787 | 英国 | 10-7 | 78.76 |
| I | BBLV | RV2507 | 德国 | 10-9 | 78.71 |
| I | ABLV | RV634 | 10-8 | 78.25 | |
| I | DUVV | RV131 | 10-5 | 79.03 | |
| I | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79.15 | |
| I | ARAV | RV3379 | 10-7 | 79.46 | |
| I | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78.97 | |
| I | SHIBV | RV3381 | 10-7 | 78.59 | |
| I | IRKV | RV3382 | 10-3 | 78.59 | |
| II | LBVa | RV767 | 10-5 | 77.34 | |
| II | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78.59 | |
| II | MOKV | RV4 | 10-3 | 78.81 | |
| III | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79.67 | |
| III | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79.15 | |
| III | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79 |
表6：针对所有三个系统发育群中代表性丽沙病毒的泛丽沙病毒实时RT-PCR特异性、敏感性和Tm汇总。 丽沙病毒间的平均Tm为78.81（标准差0.531）。
讨论
本文所述的泛丽沙病毒实时逆转录PCR检测是一种封闭管式、一步法检测方法，可检测所有三个系统发育群中的丽沙病毒。该检测已验证可用于动物和人类狂犬病的诊断，包括死后脑组织（最佳为脑干）以及生前样本，如皮肤活检、连续采集的唾液或脑脊液（CSF）。本检测所用引物最初设计并用于一种基于探针的检测方法，以区分RABV、EBLV-1和EBLV-23，该方法已被多个世界动物卫生组织（OIE）狂犬病实验室采用，并在欧洲参考实验室（EURL）能力验证计划中表现稳定。随后，通过两步法实时检测证实了这些引物具有“泛丽沙病毒”特性15。本文所述检测利用这些引物进一步优化了一步法SYBR Green检测，实现封闭管式、快速检测系统。此外，在狂犬病流行国家开展的培训已证实，该检测适用于任何具备基本个人防护装备（PPE）和质量管理体系以减少交叉污染和追踪样本、试剂储存设施以及配备SYBR Green检测功能的实时PCR仪的实验室。该检测极为稳健，与荧光抗体检测（FAT）具有100%的一致性，并对降解样本具有更高的灵敏度3。与基于探针的检测相比，基于DNA嵌入染料的检测主要优势之一是成本较低。另一优势是该检测仅使用两条引物，因此因序列差异导致检测失败的风险更小，而这是以往发表的基于探针的检测方法的薄弱环节。事实上，除TWBLV和KBLV外，所有丽沙病毒物种的代表株均可通过本检测方法检出，对TWBLV和KBLV在引物结合区域的序列分析显示无显著差异，强烈提示它们也能被该方法检测到。在所分析病毒中观察到的检测下限范围可归因于两个主要因素。其一是RNA来源于临床脑组织样本，因此各未稀释样本中的基因组拷贝数无法直接比较。虽然通过将总RNA调整至1 µg/µL进行了“标准化”，但各样本中病毒基因组RNA所占比例仍存在差异。其二是丽沙病毒序列的多样性，尽管引物结合位点位于保守区域，但仍存在变异位点。因此，大多数对该检测灵敏度较低的丽沙病毒属于系统发育群II和III，这并不令人意外。解链曲线分析是一个关键参数，可最大限度减少因引物二聚体形成或宿主基因组中非特异性区域扩增而导致的假阳性结果。实际上，此类情况极为罕见，解链曲线分析的作用相当于运行琼脂糖凝胶电泳以观察常规RT-PCR扩增子的正确大小。根据本实验室收集的数据，已提供可接受的Tm值范围（77–80 °C）。强烈建议各实验室汇总内部数据，以确认该范围的适用性并作相应调整。结合扩增曲线和解链曲线结果、阳性与阴性对照以及β-actin检测结果进行综合判读，可实现可靠且可重复的诊断结果。
本方案不涉及用于获取高质量RNA的RNA提取方法。本方案中分析的所有RNA均使用TRIzol制备；然而，目前已有多种基于胍盐的RNA提取方法可供选择，包括柱式和磁珠法提取试剂盒。狂犬病病毒属（lyssavirus）阳性（或疑似阳性）样本的操作必须在所在国家批准的具有资质的生物安全 containment 设施内进行。但是，提取的总RNA无感染性，因此可在低级别生物安全实验室中操作。根据所采用的提取方法，需评估是否需要对RNA进行定量和稀释。对于基于苯酚的提取方法（包括TRIzol），此步骤是必需的，可防止残留的基因组DNA（gDNA）对检测造成抑制；然而，柱式或磁珠法提取（特别是包含DNA去除步骤的提取方法）在检测前无需稀释。
在整个实验过程中，必须谨慎操作并保持专注，以防止交叉污染，并确保将样品准确加入相应的孔中。试剂计算和板布局的电子表格可作为补充文件下载。良好的实验室规范，包括保持工作台面清洁、定期更换手套、使用带滤芯的吸头以及在不同房间或紫外灯柜中进行各步骤操作，将最大限度地降低污染风险。为了确保检测在预期参数范围内正常进行，必须设置阳性和阴性对照，并且所有检测样本均需进行双份（或三份）重复检测。
对照组的设置是任何PCR实验的关键要素，尤其是在诊断应用中。阳性对照RNA由感染CVS（攻击病毒标准株）的小鼠脑组织制备，分批生产，并经过验证和校准，以确保不同批次之间的一致性。该对照RNA经定量后稀释至1 µg/µL。在连续稀释至至少10-4（相当于100 pg/µL）时仍能获得阳性结果的RNA被视为符合使用要求。阳性对照RNA以10-1稀释度分装后于-80 °C保存。使用时，取一份分装样本稀释1:100，得到浓度为1 ng/µL的工作液，并以5 µL单次使用分装量继续在-80 °C保存。稀释后的阳性对照RNA用于模拟低水平阳性的样本，以确保能够检测到检测方法灵敏度的任何下降。每份对照均需保留一张“对照记录卡”，用于监测Ct值并识别趋势变化（表5）。表5显示，在多日检测及不同操作人员之间，CVS阳性对照样本的Ct值和Tm值具有良好的批间可比性，表明该检测方法稳定且可重复。若检测结果偏离上述标准值，应进行调查，并在必要时重新检测样本。每次运行均需包含分子级水作为无模板对照（NTC），以确认试剂未被狂犬病毒属RNA污染，并验证阴性样本的可靠性。此外，为确保RNA提取的有效性，需在另一管中与待测样本平行检测ß-actin。狂犬病毒属阳性对照RNA也用作ß-actin检测的阳性对照。也可选用其他内源性基因或异源内参系统。这些对照的使用确保了所有步骤均在与待测样本相同的条件下进行分析。偶尔，若样本严重降解或宿主RNA含量不足（如唾液或脑脊液），内源性基因PCR可能出现失败。在此情况下，若狂犬病毒实时荧光RT-PCR结果为阳性，则应通过独立的RNA提取进行复核——以排除原始检测过程中RNA提取阶段的污染，或通过第二项检测（如常规RT-PCR等分子检测方法）或FAT进行确认。在诊断样本分析过程中参考表4，可确保结果的正确解读。
无论使用何种分子检测方法来确诊狂犬病感染，都应进一步开展后续调查，包括采用Sanger测序确定丽沙病毒种类，以及应用病毒学中的经典技术（如荧光抗体检测或病毒分离），以便对病毒进行更深入的表征，并支持向世界动物卫生组织（OIE）和世界卫生组织（WHO）报告阳性病例。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Emma Wise 女士和 Megan Golding 女士在完成实验过程中提供的协助。本方案的开发工作获得了英国环境、食品与农村事务部（Defra）、苏格兰政府和威尔士政府的资助（项目编号：SV3500 和 SE0431），以及欧洲病毒库全球项目（European Virus Archive global，EVAg）的资助；EVAg 项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在第653316号资助协议下的资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Art Barrier 吸头（多种规格） | Thermofisher | various | |
| 离心机 | Beckman | Allegra 21R | 需配备可承载 96 孔板的转子。见步骤 3.8。 |
| 小型离心机（mico） | Sigma | ||
| Finnpipette 移液器（用于分配 0.5–1,000 µL） | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR 试剂盒 | Bio-Rad | 172-5150 | 若经过验证，可使用等效试剂盒 |
| MX3000P 或 MX3005P 实时荧光定量 PCR 系统 | Stratagene | N/A | 若经过验证，可使用等效仪器 |
| MicroAmp 反应板底座 | Any suitable | 用于稳固固定八联管和反应板。 | |
| 光学透明平顶透明封板条（8 孔） | ABgene | AB-0866 | |
| 完美匹配框架（若使用管条） | Stratagene | N/A | 与仪器型号匹配 |
| 引物：引物详细信息见表 2。 | 订购规格为 0.05 µmol，经 HPLC 纯化。 | ||
| Thermo-Fast 96 孔板，无裙边 | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast 封板条（8 孔），Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| 涡旋振荡器 / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| 除非特别说明，其他等效设备亦可使用 |
参考文献
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