需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

天然产物发现中的LC-MS/MS诊断性碎片过滤技术：应用于微囊藻毒素分析

8.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59712

⸱

2019年5月31日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Carleton University Ottawa, 2London Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada

本文内容

摘要

将诊断性碎裂过滤技术应用于MZmine，是一种优雅的采集后方法，可用于筛查液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据集中的已知和未知天然产物的整个类别。该工具会搜索二级质谱（MS/MS）谱图中由分析人员预先定义为表征该类化合物特征的产物离子和/或中性丢失片段。

摘要

天然产物通常以结构相似化合物的混合物形式生物合成，而非单一化合物。由于具有共同的结构特征，同一类别的许多化合物会经历类似的串联质谱（MS/MS）碎裂过程，并产生多个相同的产物离子和/或中性丢失。诊断性碎裂筛选（DFF）的目的是通过在非靶向的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据集中筛选出包含特定类别产物离子和/或中性丢失的MS/MS谱图，从而高效地检测复杂提取物中属于某一类别的所有化合物。该方法基于开源MZmine平台中的DFF模块，要求样品提取物通过高分辨质谱仪（如四极杆Orbitrap或四极杆飞行时间质谱分析器）进行数据依赖性采集分析。该方法的主要局限在于，分析人员必须首先确定哪些产物离子和/或中性丢失对该目标天然产物类别具有特异性。DFF能够进一步发现复杂样品中所有相关的天然产物，包括新化合物。在本研究中，我们通过筛选铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的提取物，验证了DFF的有效性；铜绿微囊藻是一种引发有害藻华的重要蓝藻，可产生微囊藻毒素。

引言

串联质谱法（MS/MS）是一种广泛应用的质谱技术，其过程包括选择一个前体离子，并通过施加激活能（例如碰撞诱导解离，CID）诱导其发生碎裂via应用激活能，如碰撞诱导解离（CID）1。离子的碎裂方式与其分子结构密切相关。天然产物通常以结构相似化合物的混合物形式生物合成，而非单一独特的化学物质2。因此，属于同一生物合成类别的结构相关化合物通常共享关键的MS/MS碎裂特征，包括共同的产物离子和/或中性丢失。能够筛选复杂样品中具有类别特异性产物离子和/或中性丢失的化合物，是一种强大的策略，可用于检测整类化合物，有望发现新的天然产物3,4,5,6。几十年来，研究人员已在低分辨仪器上采用中性丢失扫描和前体离子扫描等质谱方法，检测具有相同中性丢失或产物离子的离子。然而，这些方法需要在实验前预先定义特定离子或跃迁。随着高分辨质谱仪在科研实验室中日益普及，复杂样品现在通常采用非靶向、数据依赖性采集（DDA）方法进行筛查。与传统的中性丢失扫描和前体离子扫描不同，结构相关化合物可通过采集后的数据分析进行识别7。在本研究中，我们展示了一种我们开发的策略，称为诊断性碎裂过滤（DFF）5,6，这是一种简单且用户友好的方法，用于在复杂基质中检测整类化合物。该DFF模块已集成至开源平台MZmine 2中，可通过下载MZmine 2.38或更新版本获取。DFF允许用户高效地筛查DDA数据集，寻找包含对整类化合物具有诊断意义的产物离子和/或中性丢失的MS/MS谱图。DFF的一个局限性在于，某类化合物的特征性产物离子和/或中性丢失必须由分析人员预先定义。

例如，已鉴定的60多种不同的伏马菌素霉菌毒素8,9均具有三羧丙酸侧链，在[M-H]-离子碎裂时会产生m/z 157.0142（C6H5O5-）的产物离子4。因此，可通过DFF方法筛选DDA数据集中所有包含显著的m/z 157.0142产物离子的MS/MS谱图，从而检测样品中所有可能存在的伏马菌素。类似地，可通过在DDA数据集中筛选包含特征性中性丢失79.9574 Da（SO3）的MS/MS谱图来检测硫酸化化合物3。该方法也已成功应用于检测新型环肽5以及含有色氨酸或苯丙氨酸残基的天然产物6。

为了展示DFF方法在MZmine平台中的有效性及其使用的便捷性10，我们将该方法应用于微囊藻毒素（MCs）的分析；微囊藻毒素是一类由淡水蓝藻产生的、包含240多种结构相关毒素的化合物11,12,13。

最常报道的蓝藻毒素是微囊藻毒素（MCs），其中微囊藻毒素-LR（MC-LR，亮氨酸[L]/精氨酸[R]）同系物被研究得最为广泛（图1）。MCs 是由多种蓝藻属生物合成的单环非核糖体七肽， 微囊藻、鱼腥藻、念珠藻 和 Planktothrix12,13肥大细胞由五种常见残基和两个被L-氨基酸占据的可变位置组成. 几乎所有微囊藻毒素（MCs）在第5位均具有一个特征性的β-氨基酸残基，即3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯癸酸（Adda）11.  MCs 的二级质谱碎裂途径已有充分描述14,15；Adda残基是产生显著的MS/MS碎片离子的原因， m/z 135.0803+ (C9H11O+）以及其他产物离子，包括 m/z 163.1114+ (C11H15O+) (图2）。非靶向 DDA 数据集 Microcystis aeruginosa 只要微囊藻毒素含有Adda残基，即可利用这些诊断离子对细胞提取物中存在的一切微囊藻毒素进行筛查。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 非靶向液相色谱（LC）-MS/MS 数据集的制备

注意：DFF 可使用任何高分辨率质谱仪以及针对目标分析物类别优化的分析方法进行。在 Orbitrap 质谱仪上经 MC 优化的 LC-MS/MS 条件见材料表。

  1. 下载 MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
    注：示例数据 CPCC300.raw 可在以下网址获取：https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0。
    1. 在 原始数据方法 下拉菜单中，选择 原始数据导入 选项。
    2. 选择要分析的数据文件。可导入单个或多个文件。
  2. （可选）如果 MZmine 不支持厂商数据格式，请使用 Proteowizard16 生成去卷积的 .mzml 数据文件。
    1. 选择 峰提取 滤镜，以应用厂商提供的去卷积算法。

2. 导入的 DDA 文件的诊断性碎裂过滤

  1. 使用光标选择并高亮所需的數據文件 原始数据文件 主 MZmine 界面的列。
  2. 在……之下 可视化 下拉菜单，选择 诊断性碎裂过滤 选项
  3. 在出现的 DFF 对话框中（图3），输入以下选项：
    1. 保留时间——使用 自动量程 或定义目标分析物类别洗脱时的保留时间范围（以分钟为单位）。
    2. 前体 m/z - 使用 自动量程 或定义 m/z 目标分析物类别的范围，包括在适当情况下对多电荷化合物的检测可能性。
    3. m/z 耐受性 – 输入质谱仪可达到的二级质谱质量精度；对于Orbitrap平台，0.01 m/z 或 3.0 ppm 是合适的。如果仅研究诊断性碎片离子，请输入 0.0 进入 诊断性中性丢失值（Da） 选项。相反，如果仅研究诊断性中性丢失，则输入 0.0 进入 诊断性产物离子（m/z) 选项
    4. 诊断性产物离子（m/z) – 输入类别特异性产物离子(s) m/z用逗号分隔多个产物离子。
      注意：输入多个产物离子将显示包含所有列出产物离子的质谱图。
    5. 诊断性中性丢失值（Da） 输入该类别特有的中性丢失值。多个中性丢失值之间用逗号分隔。
      注意：输入多个中性丢失项将显示包含所有所列中性丢失的质谱图。同时输入诊断性产物离子和中性丢失项，将显示满足所有条件的质谱图。
    6. 最低诊断离子强度（% 基峰） – 以MS/MS谱图基峰强度的百分比表示，设定用于判断诊断性产物离子和/或中性丢失的最小强度阈值。
    7. 峰列表输出文件 – 选择输出结果的路径和文件名。
    8. 点击 好的 单击按钮以开始DFF分析。成功完成上述步骤后，将显示DFF图。
      注意：将生成两个 .csv 数据文件。 {峰列表输出文件}.csv 含有前体 m/z，扫描编号以及扫描的保留时间。这可用于现有的 MZmine 模块，包括 原始数据方法 > 峰检测 > 靶向峰检测 生成符合定义的DFF标准的前体离子的提取离子色谱图。 {峰列表输出文件}_data.csv 含有前体 m/z，产物离子 m/z 以及保留时间，以便在 MZmine 外生成 DFF 图。

3. DFF 在微囊藻毒素分析中的应用示例

  1. 样品制备
    1. 将装有30 mL无菌MA培养基17或其他蓝藻生长培养基（BG-11）并配有泡沫塞的250 mL锥形瓶进行灭菌。
    2. 在无菌条件下，将蓝藻培养物接种至灭菌后的培养基中，细胞浓度约为5 × 105 cells mL-1。使用血细胞计数板监测细胞密度。本示例中，将铜绿微囊藻（M. aeruginosa）菌株CPCC300在27 °C下以光能自养方式培养，采用冷白荧光灯照明（30 µE m-2 s-1），光照周期为12小时光照：12小时黑暗。每天轻轻摇动培养物一次。
    3. 培养26天后，通过真空过滤法使用直径为47 mm的GF/C玻璃微纤维滤膜将细胞与培养基分离。
    4. 向收集的细胞中加入3 mL 80%甲醇(aq)至14 mL试管中。
    5. 对含有蓝藻细胞的试管进行涡旋振荡，随后超声处理，每次30秒。将试管置于-20 °C下保存1小时。然后将试管恢复至室温，并让样品解冻15分钟。
    6. 重复步骤3.1.5两次，以有效裂解细胞。
    7. 将所得的蓝藻细胞提取物通过0.22 μm PTFE针筒滤器过滤。
    8. 在30 °C下使用氮气缓流通过蒸发仪干燥提取物。干燥后将提取物储存在-20 °C，直至进行LC-MS/MS分析。
    9. 分析前，在棕色HPLC小瓶中用500 µL 90%甲醇(aq)重新溶解干燥残留物，并涡旋振荡30秒。
  2. 采用DDA采集模式在高分辨质谱仪上分析蓝藻提取物。
    注：本实验所用MC分析的优化LC-MS条件见材料表。
  3. 准备DDA数据文件，并按照步骤1.1和1.2导入MZmine软件。
  4. 选择数据文件，并按照步骤2.1–2.2启动DFF模块。
  5. 进行MC分析时，在DFF模块中使用以下设置（图3）。
    1. 保留时间 — 输入范围为2.00至6.00分钟。
    2. 前体离子m/z — 输入m/z范围为430.00至1200.00。
    3. m/z容差 — 设置m/z容差为0.01 m/z或3.0 ppm。
    4. 特征性产物离子（m/z） — 输入135.0803, 163.1114作为特征性产物离子的m/z值。
    5. 特征性中性丢失值（Da） — 输入0.0，表示不使用任何特征性中性丢失。
    6. 最小特征离子强度（%基峰） — 使用15.00作为最小强度阈值。
    7. 峰列表输出文件 — 将输出文件定义为putative_MCs.csv。
  6. 点击确定按钮以启动DFF分析。成功完成上述步骤后，将显示DFF图谱（图4）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

对铜绿微囊藻（M. aeruginosa）CPCC300进行分析后生成的DFF图谱如图4所示。该图谱的x轴表示满足设定DFF标准的前体离子的m/z值，而y轴则显示微囊藻毒素（MCs）MS/MS谱图中所有产物离子的m/z值。本次分析中，MC检测的标准包括：前体离子的m/z范围在440–1200之间，保留时间在2.00–6.00分钟之间。最重要的是，这些MS/MS谱图中均包含m/z 135.0803和163.1114（± 3 ppm），且其强度高于设定的基峰强度阈值（15%）。在该条件下，LC-MS/MS DDA分析共采集到4116张MS/MS谱图。其中，有26张谱图满足DFF标准，并在铜绿微囊藻（M. aeruginosa）CPCC300提取物中被检测到。然而，同一种化合物可能被采集到多张MS/MS谱图，尤其是高丰度离子。在该提取物中，仅发现18个独特的前体离子m/...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

DFF 是一种直接且快速的策略，可用于检测整类化合物，尤其适用于天然产物化合物的发现。DFF 最关键的环节是确定目标化合物类别的特异性 MS/MS 碎裂标准。在此代表性示例中，DFF 被用于检测铜绿微囊藻（M. aeruginosa）细胞提取物中所有含 Adda 残基的微囊藻毒素（MCs）。尽管绝大多数 MCs 均含有 Adda 残基，但已知该位置也可能存在其他残基，特别是去甲基-和乙酰去甲基-Adda 变体19。使用所定义的标准将无法检测到含有这些残基的 MCs。然而，由于 DFF 是一种数据采集后的分析方法，分析人员可利用本文所述的简单逐步操作流程，在同一数据集上轻松地进一步考察其他诊断性碎片离子。这种方法还允许分析人员检测具有假设性修饰的化合物，这些修饰可能改变诊断性产物离子和/或中性丢失特征。

加合物和源内碎片也可能满足DFF标准，从而被错误地解读为独特的分析物。当提取物中其他化合物表现出相同的产物离子和/或中性丢失时，可能会产生假阳性结果。在这两种情况下，均可通过使用额外的产物离子和中性丢失来提高方法的选择...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者感谢加拿大藻类培养中心（滑铁卢大学）的Heather Roshon提供本研究所用的蓝细菌培养物，以及卡尔顿大学的Sawsan Abusharkh提供的技术协助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蓝细菌
Microcystis aeruginosaCPCC300加拿大藻类培养中心CPCC300https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
软件
Proteowizard（软件）软件http://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2软件http://mzmine.github.io/
液相色谱-质谱（LC-MS）
Q-Exactive OrbitrapThermo-配备HESI电离源
1290 UHPLCAgilent配备二元泵、自动进样器、柱温箱
C18色谱柱Agilent959757-902Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm）
溶剂
Optima LC-MS级甲醇FisherA456-4
Optima LC-MS级乙腈FisherA955-4
Optima LC-MS级水FisherW6-4
LC-MS级甲酸FisherA11710X1-AMP
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21Thermo Scientific75-772-436
其他
琥珀色HPLC小瓶，2 mL/瓶Agilent5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE针式过滤器Pall Corp.4521
Whatman 47 mm GF/A玻璃微纤维滤膜Sigma-AldrichWHA1820047
培养基
MA培养基（pH 8.6）（每升用量）Watanabe, M. F. & Oishi, S. 培养条件下环境因子对蓝细菌（Microcystis aeruginosa）毒性的效应。应用与环境微生物学。49 (5), 1342-1344 (1985)。
Ca(NO3)·4H2O，50 mgSigma-AldrichC2786
KNO3，100 mgSigma-AldrichP8291
NaNO3，50 mgSigma-AldrichS5022
Na2SO4，40 mgSigma-AldrichS5640
MgCl2·6H20，50 mgSigma-AldrichM2393
甘油磷酸钠，100 mgSigma-AldrichG9422
H3BO3，20 mgSigma-AldrichB6768
Bicine，500 mgSigma-AldrichRES1151B-B7
P(IV)金属溶液，5 mL
用ddH2O定容至1 L
NaEDTA·2HOSigma-AldrichE6635
FeCl3 ·6H2OSigma-Aldrich236489
MnCl2·4H2OBaker2540
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
CoCl2·6H2OSigma-AldrichC8661
Na2MoO4·2H2OBaker3764
蓝细菌BG-11 50倍淡水溶液Sigma-AldrichC3061-500mL

参考文献

  1. Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
  2. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
  3. Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
  4. Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
  5. Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
  6. Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
  7. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).
  8. Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
  9. Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
  10. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395(2010).
  11. Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
  12. Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
  13. Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
  14. Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710(2006).
  15. Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
  16. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  17. Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
  18. Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
  19. Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
  20. Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097(2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

MZmine Microcystis aeruginosa
天然产物发现中的LC-MS/MS诊断性碎片过滤技术：应用于微囊藻毒素分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。