将诊断性碎裂过滤技术应用于MZmine，是一种优雅的采集后方法，可用于筛查液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据集中的已知和未知天然产物的整个类别。该工具会搜索二级质谱（MS/MS）谱图中由分析人员预先定义为表征该类化合物特征的产物离子和/或中性丢失片段。
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摘要
摘要
天然产物通常以结构相似化合物的混合物形式生物合成，而非单一化合物。由于具有共同的结构特征，同一类别的许多化合物会经历类似的串联质谱（MS/MS）碎裂过程，并产生多个相同的产物离子和/或中性丢失。诊断性碎裂筛选（DFF）的目的是通过在非靶向的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据集中筛选出包含特定类别产物离子和/或中性丢失的MS/MS谱图，从而高效地检测复杂提取物中属于某一类别的所有化合物。该方法基于开源MZmine平台中的DFF模块，要求样品提取物通过高分辨质谱仪（如四极杆Orbitrap或四极杆飞行时间质谱分析器）进行数据依赖性采集分析。该方法的主要局限在于，分析人员必须首先确定哪些产物离子和/或中性丢失对该目标天然产物类别具有特异性。DFF能够进一步发现复杂样品中所有相关的天然产物，包括新化合物。在本研究中，我们通过筛选铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的提取物，验证了DFF的有效性；铜绿微囊藻是一种引发有害藻华的重要蓝藻，可产生微囊藻毒素。
引言
串联质谱法（MS/MS）是一种广泛应用的质谱技术，其过程包括选择一个前体离子，并通过施加激活能（例如碰撞诱导解离，CID）诱导其发生碎裂via应用激活能，如碰撞诱导解离（CID）1。离子的碎裂方式与其分子结构密切相关。天然产物通常以结构相似化合物的混合物形式生物合成，而非单一独特的化学物质2。因此，属于同一生物合成类别的结构相关化合物通常共享关键的MS/MS碎裂特征，包括共同的产物离子和/或中性丢失。能够筛选复杂样品中具有类别特异性产物离子和/或中性丢失的化合物，是一种强大的策略，可用于检测整类化合物，有望发现新的天然产物3,4,5,6。几十年来，研究人员已在低分辨仪器上采用中性丢失扫描和前体离子扫描等质谱方法，检测具有相同中性丢失或产物离子的离子。然而，这些方法需要在实验前预先定义特定离子或跃迁。随着高分辨质谱仪在科研实验室中日益普及，复杂样品现在通常采用非靶向、数据依赖性采集（DDA）方法进行筛查。与传统的中性丢失扫描和前体离子扫描不同，结构相关化合物可通过采集后的数据分析进行识别7。在本研究中，我们展示了一种我们....
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方案
1. 非靶向液相色谱（LC）-MS/MS 数据集的制备
注意：DFF 可使用任何高分辨率质谱仪以及针对目标分析物类别优化的分析方法进行。在 Orbitrap 质谱仪上经 MC 优化的 LC-MS/MS 条件见材料表。
- 下载 MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
注：示例数据 CPCC300.raw 可在以下网址获取：https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0。- 在 原始数据方法 下拉菜单中，选择 原始数据导入 选项。
- 选择要分析的数据文件。可导入单个或多个文件。
- （可选）如果 MZmine 不支持厂商数据格式，请使用 Proteowizard16 生成去卷积的 .mzml 数据文件。
- 选择 峰提取 滤镜，以应用厂商提供的去卷积算法。
2. 导入的 DDA 文件的诊断性碎裂过滤
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结果
对铜绿微囊藻（M. aeruginosa）CPCC300进行分析后生成的DFF图谱如图4所示。该图谱的x轴表示满足设定DFF标准的前体离子的m/z值，而y轴则显示微囊藻毒素（MCs）MS/MS谱图中所有产物离子的m/z值。本次分析中，MC检测的标准包括：前体离子的m/z范围在440–1200之间，保留时间在2.00–6.00分钟之间。最重要的是，这些MS/MS谱图中均包含m/z 135.0803和163.1114（± 3 ppm），且其强度高于设定的基峰强度阈值（15%）。在该条件下，LC-MS/MS DDA分析共采集到4116张MS/MS谱图。其中，有26张谱图满足DFF标准，并在铜绿微囊藻（M. aeruginosa）CPCC300提取物中被检测到。然而，同一种化合物可能被采集到多张MS/MS谱图，尤其是高丰度离子。在该提取物中，仅发现18个独特的前体离子m/.......
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讨论
DFF 是一种直接且快速的策略，可用于检测整类化合物，尤其适用于天然产物化合物的发现。DFF 最关键的环节是确定目标化合物类别的特异性 MS/MS 碎裂标准。在此代表性示例中，DFF 被用于检测铜绿微囊藻（M. aeruginosa）细胞提取物中所有含 Adda 残基的微囊藻毒素（MCs）。尽管绝大多数 MCs 均含有 Adda 残基，但已知该位置也可能存在其他残基，特别是去甲基-和乙酰去甲基-Adda 变体19。使用所定义的标准将无法检测到含有这些残基的 MCs。然而，由于 DFF 是一种数据采集后的分析方法，分析人员可利用本文所述的简单逐步操作流程，在同一数据集上轻松地进一步考察其他诊断性碎片离子。这种方法还允许分析人员检测具有假设性修饰的化合物，这些修饰可能改变诊断性产物离子和/或中性丢失特征。
加合物和源内碎片也可能满足DFF标准，从而被错误地解读为独特的分析物。当提取物中其他化合物表现出相同的产物离子和/或中性丢失时，可能会产生假阳性结果。在这两种情况下，均可通过使用额外的产物离子和中性丢失来提高方法的选择.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者感谢加拿大藻类培养中心（滑铁卢大学）的Heather Roshon提供本研究所用的蓝细菌培养物，以及卡尔顿大学的Sawsan Abusharkh提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蓝细菌 | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | 加拿大藻类培养中心 | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| 软件 | |||
| Proteowizard（软件） | 软件 | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | 软件 | http://mzmine.github.io/ | |
| 液相色谱-质谱（LC-MS） | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | 配备HESI电离源 |
| 1290 UHPLC | Agilent | 配备二元泵、自动进样器、柱温箱 | |
| C18色谱柱 | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm） |
| 溶剂 | |||
| Optima LC-MS级甲醇 | Fisher | A456-4 | |
| Optima LC-MS级乙腈 | Fisher | A955-4 | |
| Optima LC-MS级水 | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS级甲酸 | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| 其他 | |||
| 琥珀色HPLC小瓶，2 mL/瓶 | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE针式过滤器 | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47 mm GF/A玻璃微纤维滤膜 | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| 培养基 | |||
| MA培养基（pH 8.6）（每升用量） | Watanabe, M. F. & Oishi, S. 培养条件下环境因子对蓝细菌（Microcystis aeruginosa）毒性的效应。应用与环境微生物学。49 (5), 1342-1344 (1985)。 | ||
| Ca(NO3)·4H2O，50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3，100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3，50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4，40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20，50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| 甘油磷酸钠，100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3，20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine，500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV)金属溶液，5 mL | |||
| 用ddH2O定容至1 L | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| 蓝细菌BG-11 50倍淡水溶液 | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
参考文献
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances....
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重印与许可
