Method Article

内生菌与人类肠道微生物群使用体外浴发酵系统的相互作用分析

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

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本文描述了一种使用体外批次发酵系统研究内生菌与人类肠道微生物群之间的相互作用的协议。

Abstract

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人类肠道微生物已成为促进人类健康、预防疾病的重要研究对象。因此，研究内生菌（如药物和益生菌）与肠道微生物群之间的相互作用已成为一个重要的研究课题。然而，由于生物伦理学和经济限制，在体内与人类志愿者进行的实验对于此类研究来说并不理想。因此，动物模型被用来评估体内的这些相互作用。然而，动物模型研究仍然受到生物伦理学考虑的限制，此外，动物和人类的微生物群的组成和多样性也各不相同。另一种研究策略是使用批量发酵实验，允许评估体外生物和肠道微生物群之间的相互作用。为了评估这一策略，双歧杆菌（比夫）外聚糖（EPS）被用作具有代表性的异种生物。然后，利用薄层色谱（TLC）、16S rRNA基因高通量测序的细菌群落成分分析、气相色谱等多种方法，对Bif EPS与人类肠道微生物群的相互作用进行了研究。短链脂肪酸（SCFA）。这里介绍的是一个协议，研究内生菌和人类肠道微生物群之间的相互作用，使用体外批次发酵系统。重要的是，该协议也可以修改，以研究其他内生菌和肠道微生物群之间的一般相互作用。

Introduction

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胃微生物群在人类肠道的功能和宿主健康中起着重要的作用。因此，肠道微生物群最近成为疾病预防和治疗的重要目标。此外，肠道细菌与宿主肠道细胞相互作用，调节基本宿主过程，包括代谢活动、营养利用、免疫系统调节，甚至大脑功能和决策2，3.内生菌具有影响肠道微生物群的细菌组成和多样性的巨大潜力。因此，内生菌和人类肠道微生物群之间的相互作用吸引了越来越多的研究关注4，5，6，7，8，9。

由于生物伦理学和经济限制，很难评估内生菌与体内人类肠道微生物群之间的相互作用。例如，未经美国食品和药物管理局许可，无法进行调查内生菌与人类肠道微生物群之间相互作用的实验，招募志愿者的成本很高。因此，动物模型经常用于此类调查。然而，由于动物与人类相关的社区成分不同，且多样性，动物模型的使用受到限制。探索内生菌与人类肠道微生物群相互作用的体外替代方法是利用批....

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Protocol

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本议定书遵循湖南科学与工程大学（中国湖南）和浙江公学（浙江，中国）伦理委员会的指导方针。

1. 细菌的制备

  1. 制备双歧杆菌中溴
    1. 在950 mL蒸馏水中结合以下成分:肉提取物，5 g/L;酵母提取物，5克/升;病例蛋白，10克/升;大豆，5克/升;葡萄糖，10克/升;K2HPO4， 2.04 g/L;MgSO4±7H2O，0.22 g/L;MnSO4.H20， 0.05 g/L;纳Cl，5克/升;补间 80，1 mL;盐溶液，40 mL（CaCl2.2H2O，0.25 g/L;KH2PO4， 1 g/L;NaHCO3， 10 g/L;纳Cl，2克/升）;和雷沙祖林，0.4 mL（2.5毫克/升）。使用 2 M NaOH 将 pH 调整到 6.8。
    2. 高压灭菌在121°C下15分钟，让肉汤在厌氧条件下冷却至室温（RT）（10% H2，10% CO 2，80% N2）。在介质中加入过滤灭菌的半胱氨酸-HCl（0.5克/升）和莫皮罗金（5毫克/升）。
  2. 在厌氧条件下，在厌氧条件下将一种无二分量....

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Results

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在厌氧孵育72小时后，在PYG板上的B.长膜培养中观察到粘膜EPS的产生（图1A）。培养物的离心，随后是乙醇沉淀和干燥，导致纤维素样EPS的收集（图1B）。干燥EPS和可溶性淀粉然后用作发酵培养的碳源。TLC因其成本低、结果周转快而用于寡糖分离和纯度分析。虽然人类粪便微生物群淀粉的降解速度比Bif EPS快（图2），但一些EPS接种样品的Bif EPS降解率却清晰可见。

然后通过16S rRNA基因高通量测序和主坐标分析（PCoA）进行群落组成分析，以研究Bif EPS对人体肠道微生物群的影响。在PCoA分析（图3A）中，来自VI_Bif和VI_Starch群的样本彼此分开聚集，表明EPS和淀粉的可用性不同地塑造了人类粪便细菌群落。线性鉴别性分析效应大小（LEfSe）进一步用于区分.......

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Discussion

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在过去十年中，在了解人类肠道微生物群的组成和活动方面取得了重大进展。由于这些研究，全息生物概念已经出现，它代表宿主和相关微生物群落之间的相互作用，如在人类和他们的肠道微生物群之间19，20。此外，人类甚至现在被视为超级生物21，其中肠道微生物群已被确认为人类功能器官之一22，23。人体拥有一个复杂的微生物生态系统，由大约10个13个微生物细胞组成24个。此外，肠道微生物群的基因组被认为是人类的辅助基因组，这些基因组编码了许多与代谢相关的基因，扩大了宿主的代谢能力。然而，异种生物，包括治疗药物和饮食衍生的生物活性化合物，可能改变肠道微生物群落结构和相关功能5。越来越多的研究表明，肠道微生物群和异种.......

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Disclosures

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提交人声明他们没有利益冲突。这些数据在《殷等人》中引用。11.

Acknowledgements

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这项研究由中国自然科学基金（第31741109号）、湖南省自然科学基金（第2018JJ3200号）和湖南科技大学应用特色学科建设项目资助。我们感谢LetPub（www.letpub.com）在编写本手稿期间提供的语言帮助。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 和微量;m 膜过滤器MilliporeSLGP033RB用于过滤样品
0.4 mm 筛Thermo Fischer308080-99-1用于制备人粪便样品
5-溴-4-氯-3-吲哚基 &β;-D-吡喃半乳糖苷 （X-Gal）SolarbioX1010用于制备色板
乙酸Sigma-Aldrich71251SCFA
琼脂SolarbioYZ-1012214中型
厌氧室Electrotek 的组件 AW 400SG细菌培养发酵
高压灭菌器SANYOMLS-3750用于高压灭菌
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178培养基成分
烤炉上海亿恒科学仪器有限公司DHG-9240A用于加热和烘烤
牛肉提取物SolarbioG8270培养基成分
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™细菌
胆盐SolarbioYZ-1071304中等
丁酸Sigma-Aldrich19215SCFA CaCl
2SolarbioC7250中等
毛细管柱SHIMADZU-GL惰性盖 FFAP（0.25 mm & 次; 30 m × 0.25 &μ;m）用于 SCFA 检测
酪蛋白蛋白胨Sigma-Aldrich39396培养基的成分
离心机Thermo ScientificSorvall ST 8用于离心
CoSO4.7H2OSolarbioC7490培养基
CuSO4.5H2O的成分Solarbio203165培养基
半胱氨酸-HClSolarbioL1550培养基
乙醇Sigma-AldrichE7023用于制备维生素 K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614
甲酸Sigma-Aldrich399388用于TLC
气相色谱法岛津公司GC-2010 Plus用于SCFA检测
玻璃烧杯Fisher ScientificFB10050用于浆料制备
葡萄糖SolarbioG8760培养基成分
血红素SolarbioH8130培养基HCl成分
Sigma-Aldrich30721用于调节缓冲液pH值的碱性溶液
丁酸Sigma-Aldrich46935-U用于SCFA
异戊酸Sigma-Aldrich129542用于SCFA
的标准样品 K2HPO4SolarbioD9880KCl 培养基盐溶液
SolarbioP9921培养基
KH2PO4SolarbioP7392培养基
LiCl.3H2OSolarbioC8380用于制备色板
肉类提取物Sigma-Aldrich-Aldrich70164培养基
偏磷酸Sigma-Aldrich的成分B7350SCFA 标准样品
MgCl2.6H2OSolarbioM8160培养基
MgSO4.7H2OSolarbioM8300培养基
MISEQIlluminaMiSeq 300PE 系统DNA 测序
MnSO4 的盐溶液。H20Sigma-AldrichM8179培养基莫
匹罗星SolarbioYZ-1448901抗生素
NaClSolarbioYZ-100376培养基
NaHCO3Sigma-Aldrich792519
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000测定 DNA 浓度
NaOHSigma-Aldrich30620用于调节缓冲液 pH 值的碱性溶液
正丁醇ChemSpider71-36-3用于 TLC
NiCl2Solarbio746460培养基
OrcinolSigma-Aldrich447420用于制备 Orcinol 试剂
丙离子Sigma-Aldrich94425SCFA 标准品
QIAamp DNA 大便小量试剂盒QIAGEN51504提取细菌基因组 DNA
即用型 PBS 粉末尚贡生物科技（上海）有限公司A610100-0001用于制备脂质悬浮
刃天青SolarbioR8150厌氧设备
高速真空浓缩器LABCONCOCentriVap用于制备EPS
淀粉SolarbioYZ-140602用于碳源
硫酸Sigma-Aldrich150692用于制备orcinol试剂
T100 PCRBIO-RADPCR 扩增
TLC 铝片MerckMillipore116835用于 TLC
胰蛋白胨Sigma-AldrichZ699209培养基的成分
胰蛋白胨Sigma-AldrichT7293培养基的成分
Tween 80SolarbioT8360培养基的盐溶液
ValericSigma-Aldrich75054SCFA 标准样品
维生素 K1Sigma-AldrichV3501中等涡
旋振荡器Scientific IndustriesVortex.Genie2用于涡旋
酵母提取物Sigma-AldrichY1625中等
ZnSO4.7H 的成分2OSigma-AldrichZ0251介质成分
标准样品器 的标准样品成分 盐溶液 的成分 的成分 培养基 的成分异的标准样品 盐溶液 盐溶液 培养基 盐溶液 的组分 液 1861096 的成分

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....

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