本文描述了一种利用体外批次发酵系统研究内源性物质与人类肠道微生物群相互作用的实验方案。
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摘要
摘要
近年来，人类肠道微生物已成为促进人类健康和预防疾病研究的重要靶点。因此，内源性物质（如药物和益生元）与肠道菌群之间相互作用的研究已成为一个重要课题。然而，由于生物伦理和经济成本的限制，使用人类志愿者开展体内实验并不理想。因此，研究人员常采用动物模型在体内评估这些相互作用。但动物模型研究仍受限于生物伦理问题，且动物与人类的菌群组成和多样性存在差异。一种替代性研究策略是采用批次发酵实验，可在体外评估内源性物质与肠道菌群之间的相互作用。为验证该策略，本研究选用双歧杆菌（Bif）胞外多糖（EPS）作为典型外源性物质代表，通过薄层色谱法（TLC）、基于16S rRNA基因高通量测序的细菌群落组成分析以及短链脂肪酸（SCFAs）的气相色谱分析等多种方法，研究Bif EPS与人类肠道菌群的相互作用。本文提供了一种利用体外批次发酵系统研究内源性物质与人类肠道菌群相互作用的实验方案。重要的是，该方案还可经适当修改，用于研究其他内源性物质与肠道菌群之间的普遍相互作用。
引言
肠道微生物群在人类肠道功能和宿主健康中发挥着重要作用。因此，肠道微生物群近年来已成为疾病预防和治疗的重要靶点1。此外，肠道细菌与宿主肠细胞相互作用，并调控多种基本的宿主生理过程，包括代谢活动、营养物质的可利用性、免疫系统的调节，甚至大脑功能和决策行为2,3。内源性代谢物具有显著潜力影响肠道微生物群的菌群组成和多样性。因此，内源性代谢物与人类肠道微生物群之间的相互作用正受到越来越多的研究关注4,5,6,7,8,9。
由于生物伦理和经济方面的限制，在体内评估内源性物质与人类肠道微生物群之间的相互作用十分困难。例如，在未获得美国食品药品监督管理局批准的情况下，无法开展研究内源性物质与人类肠道微生物群相互作用的实验，而且招募志愿者的费用高昂。因此，此类研究常采用动物模型。然而，由于动物相关菌群与人类相关菌群在微生物组成和多样性方面存在差异，动物模型的应用受到限制。一种探索内源性物质与人类肠道微生物群相互作用的替代体外方法是采用批次培养实验。
胞外多糖（EPS）是一类益生元，对维持人类健康具有重要作用10。不同单糖组成和结构的EPS可能表现出不同的功能。先前的研究已确定了双歧杆菌EPS（Bif EPS）的组成，后者是本研究中关注的代表性外源性物质11。然而，宿主相关的代谢效应尚未结合EPS的组成与多样性进行考虑。
本方案采用12名志愿者的粪便微生物群对双歧杆菌胞外多糖（Bif EPSs）进行发酵。随后结合薄层色谱法（TLC）、16S rRNA基因高通量测序以及气相色谱法（GC）来研究EPSs与人类肠道微生物群之间的相互作用。与体内实验相比，该方案具有成本低、避免宿主代谢干扰效应的显著优势。此外，本方案还可用于其他研究内源性代谢物与人类肠道微生物群相互作用的研究中。
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方案
本方案遵循中国湖南科技学院（中国湖南）和中国浙江工商大学（中国浙江）伦理委员会的指导原则。
1. 细菌的制备
- 双歧杆菌培养液的制备
- 在950 mL蒸馏水中加入以下成分：肉浸膏 5 g/L；酵母提取物 5 g/L；酪蛋白胨 10 g/L；大豆蛋白胨 5 g/L；葡萄糖 10 g/L；K2HPO4 2.04 g/L；MgSO4·7H2O 0.22 g/L；MnSO4·H2O 0.05 g/L；NaCl 5 g/L；Tween 80 1 mL；盐溶液 40 mL（CaCl2·2H2O 0.25 g/L；KH2PO4 1 g/L；NaHCO3 10 g/L；NaCl 2 g/L）；以及刃天青（resazurin）0.4 mL（2.5 mg/L）。用2 M NaOH将pH值调节至6.8。
- 在121 °C下高压灭菌15分钟，并在厌氧条件（10% H2、10% CO2、80% N2）下使培养液冷却至室温（RT）。向培养基中加入经滤膜除菌的盐酸半胱氨酸（cysteine-HCl，0.5 g/L）和麦迪霉素（mupirocin，5 mg/L）。
- 在厌氧条件下，将一份冷冻保存的 Bifidobacterium longum 菌种（50 μL）接种至含有5 mL双歧杆菌培养液的培养管中，随后于37 °C厌氧培养箱中培养24小时。
2. 双歧杆菌胞外多糖的制备
- PYG 琼脂培养基的制备
- 将以下成分混合：蛋白胨，20 g/L；酵母提取物，10 g/L；葡萄糖，5 g/L；NaCl，0.08 g/L；CaCl2，0.008 g/L；MgSO4·7H2O，0.008 g/L；K2HPO4，0.04 g/L；KH2PO4，0.04 g/L；NaHCO3，0.4 g/L；琼脂，12 g/L。使用 10 M NaOH 将 pH 调至 7.2。
- 在 121 °C 下高压灭菌培养基 15 分钟，冷却至约 50 °C。然后每 1 L 培养基中加入 0.5 mL 经滤膜除菌的维生素 K1 溶液（1 g 维生素 K1 溶于 99 mL 99% 乙醇中）、5 mL 血红素溶液（0.5 g 血红素溶于 1 mL 1 mol/L NaOH 中，再用蒸馏水定容至 100 mL）和 0.5 g 巯基乙酸半胱氨酸（cysteine-HCl）。
- 在倾注 PYG 平板前，向培养基中加入经滤膜除菌的 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal，0.06 g/L）、LiCl·3H2O（5.7 g/L）和麦迪霉素（mupirocin，5 mg/L）。
注：X-Gal 和 LiCl·3H2O 可通过颜色变化实现对平板上 B. longum 菌落的鉴定。
- 将 20 μL 的 B. longum 菌株（步骤 1.2）接种至 PYG 平板，置于 37 °C 厌氧培养箱中培养 72 小时。
- 使用称量勺从 PYG 平板上收集黏液状细菌菌落，然后用涡旋振荡器将其完全重悬于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
注：需通过反复涡旋或吹打，使细菌与胞外多糖（EPS）混合物完全重悬，直至纤维在 PBS 中完全溶解。 - 在 6,000 × g 条件下离心悬浮液 5 分钟。
- 小心将上清液转移至新的离心管中，并加入三倍体积的冷 99% 乙醇，通过反复倒置和混匀使其充分混合。
- 在 6,000 × g 条件下离心混合液 5 分钟，并彻底弃去上清液。
- 用刮取法从离心管中收集沉淀物，并使用真空浓缩仪干燥过夜以获得 EPS 提取物。
3. 发酵培养基的制备
- 基础培养基 VI 的制备
- 将以下成分混合：蛋白胨，3 g/L；胰蛋白胨，3 g/L；酵母提取物，4.5 g/L；黏蛋白，0.5 g/L；胆盐 No. 3，0.4 g/L；NaCl，4.5 g/L；KCl，2.5 g/L；MgCl₂2·6H2O，4.5 g/L；1 mL 吐温-80；CaCl2.6H2O，0.2 g/L；KH2PO4，0.4 g/L；MgSO₄4·7H2O，3.0 g/L；MnCl2·4H2O，0.32 g/L；FeSO4·7H₂O，0.1 g/L；CoSO₄4·7H2O，0.18 g/L；CaCl2·2H2O，0.1 g/L；ZnSO₄4·7H2O，0.18 g/L；CuSO₄4·5H2O，0.01 g/L；以及 NiCl2·6H2O，0.092 g/L。用1 M HCl将pH值调节至6.5。
- 按照第2.1节的方法制备血红素和半胱氨酸，在高压灭菌并冷却后加入。
- 配制含有不同碳源的培养基，以VI基础培养基为基础。在高压灭菌前，向VI培养基中加入8 g/L的Bif EPS纤维，构成VI_Bif组；另向VI培养基中加入8 g/L淀粉，构成VI_Starch组。最后，未添加任何碳源的VI培养基作为对照组（VI组）。
注意：先使用磁力搅拌器将Bif EPS和淀粉溶解于热水中，然后与已配制的VI培养基混合。 - 所有培养基在121 °C下高压灭菌15分钟，然后冷却至室温。
- 在厌氧培养箱中，将每种培养基的5 mL子样品转移至培养管中，其余培养基在4 °C保存。
4. 人粪便样本制备
- 使用粪便容器收集健康成年志愿者排便后立即排出的新鲜粪便样本，并随后用于悬液制备。
注意：在采集样本前，所有志愿者均应经过筛查，确保在捐赠样本前至少3个月内未接受过抗生素、益生菌或益生元治疗。此外，所有捐赠者必须提供知情的书面同意书。 - 将一份新鲜粪便样本（1 g）转移至含有10 mL 0.1 M厌氧磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）的玻璃烧杯中，然后使用玻璃棒制备10%（w/v）的悬液。
- 使用0.4 mM筛网过滤粪便悬液。随后，取部分过滤后的悬液用于接种批次培养发酵实验，其余部分储存于-80 °C，以备后续分析。
注意：步骤4.2–4.3在厌氧室中进行。
5. 体外批次发酵
- 在厌氧环境中，将过滤后的粪便悬液（500 μL）加入步骤 3.2 中制备的发酵培养基中，随后在 37 °C 下孵育。
- 在厌氧环境中于 24 h 和 48 h 分别收集 2 mL 发酵样品，然后在厌氧环境外以 6,000 × g 离心 3 min。
- 小心地将上清液转移至新的离心管中，用于多糖降解分析和短链脂肪酸（SCFAs）测定。
- 将离心沉淀物保存于 -80 °C，后续用于细菌基因组 DNA 提取。
6. 人粪便微生物群对EPS的降解
- 取0.2 μL发酵上清液点样于预涂硅胶-60薄层色谱铝板上，然后用吹风机吹干。
- 将薄层板置于20 mL甲酸/正丁醇/水（6:4:1, v:v:v）溶液中展开，再用吹风机吹干。
- 将薄层板浸入间苯二酚试剂中染色，随后用吹风机吹干。
- 配制间苯二酚试剂：将900 mg地衣酚溶于25 mL蒸馏水中，加入375 mL乙醇。随后缓慢加入浓硫酸，并充分混匀。
- 将薄层板于烘箱中120 °C加热3分钟，通过测定薄层色谱条带变化评估胞外多糖（EPS）的降解情况。
7. 胞外多糖对人类肠道微生物群的影响
- 对步骤4.3制备的原始粪便样本和步骤5.4制备的发酵样本进行冻融处理。
- 使用粪便细菌基因组DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从所有样本中提取细菌基因组DNA（gDNA）。
- 使用微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、完整性和片段大小分布。
- 使用以下先前报道的正向和反向引物，对提取的gDNA中的细菌16S rRNA基因进行PCR扩增12：
- 正向引物（带条形码的引物338F）：ACTCCTACGGGAGGCAGCA
- 反向引物（806R）：GGACTACHVGGGTWTCTAAT
采用以下PCR扩增仪程序：- 94 °C 预变性5 min。
- 94 °C 变性30 s。
- 55 °C 退火30 s。
- 72 °C 延伸1 min。
- 重复步骤2–4，共35个循环。
- 72 °C 终延伸5 min。
- 4 °C 保存，直至从PCR仪中取出。
- 将PCR产物送至DNA测序公司，利用超高通量微生物群落分析技术进行高通量测序。
- 使用Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME）序列分析流程获取高质量的纯净序列13。
- 利用Mothur软件套件等生物信息学工具，将核苷酸序列相似性大于97%的16S rRNA基因序列归类为操作分类单元（OTUs）14。
- 从每个OTU中选择一条代表性序列，结合RDP分类器和SILVA分类数据库对代表性序列进行分类注释15。
- 使用生物信息学工具计算Good’s coverage、α多样性指数（包括Simpson指数和Shannon指数）以及丰富度（观测到的OTU数量）16。
8. 胞外多糖对人类肠道微生物群短链脂肪酸产生的影响
- 将步骤 5.3 中制备的发酵上清液（1 mL）加入 2 mL 离心管中。
- 向每个样品中加入 0.2 mL 的 25%（w/v）偏磷酸溶液，并通过涡旋充分混匀。
- 在 13,000 x g 条件下离心 20 分钟，将上清液转移至新的离心管中。
- 同时，配制 120 mM 的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸溶液；然后将每种配制好的酸溶液各取 1 mL 加入 1.2 mL 的 25%（w/v）偏磷酸溶液中，作为标准混合液使用。
- 使用 0.22 μM 滤膜对样品进行过滤。
- 根据先前描述的方法11,17，采用高效气相色谱法检测短链脂肪酸（SCFA）浓度。
注：气相色谱（GC）分析使用 InertCap FFAP 色谱柱（0.25 mM x 30 m x 0.25 μM）。SCFA 浓度通过 GC Solution 软件包中的单点内标法，依据峰面积进行定量。
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结果
B. longum 在 PYG 平板上经厌氧培养 72 小时后，可观察到黏液状胞外多糖（EPS）的产生（图 1A）。对培养物刮取物进行离心，随后经乙醇沉淀和干燥，可获得类纤维素的 EPS（图 1B）。将干燥的 EPS 和可溶性淀粉作为碳源用于发酵培养。由于薄层色谱法（TLC）成本低且结果快速，因此被用于寡糖的分离与纯度分析18。尽管人粪便微生物群对淀粉的降解速率快于双歧杆菌 EPS（图 2），但在部分接种 EPS 的样品中仍明显观察到双歧杆菌 EPS 的降解。
随后通过16S rRNA基因高通量测序和主坐标分析（PCoA）进行群落组成分析，以研究Bif EPS对人类肠道菌群的影响。在PCoA分析中，VI_Bif组与VI_Starch组的样本彼此分离聚类（图3A），表明EPS和淀粉的...
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讨论
在过去十年中，人们对人类肠道微生物群的组成和功能的理解取得了显著进展。这些研究催生了全生物体（holobiont）概念，该概念描述了宿主与其相关微生物群落之间的相互作用，例如人类与其肠道微生物群之间的关系19,20。此外，人类甚至现在被视为超级生物体21，其中肠道微生物群已被认为是人类体内一种功能性器官22,23。人体内寄居着一个复杂的微生物生态系统，包含约1013个微生物细胞24。此外，肠道微生物群的基因组被视为人类的辅助基因组，编码大量与代谢相关的基因，从而扩展了宿主的代谢能力4。然而，异源物质（包括治疗性药物和饮食来源的生物活性化合物）可能改变肠道微生物组的群落结构及其相关功能5。越来越多...
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披露
作者声明不存在利益冲突。图示引用自Yin等.11。
致谢
本研究由国家自然科学基金（编号：31741109）、湖南省自然科学基金（编号：2018JJ3200）以及湖南科技学院应用特色学科建设项目的资助。在本论文撰写过程中，我们感谢 LetPub（www.letpub.com）提供的语言协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 膜过滤器 | Millipore | SLGP033RB | 用于样品过滤 |
| 0.4 mm 筛网 | Thermo Fischer | 308080-99-1 | 用于制备人粪便样品 |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基 β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal） | Solarbio | X1010 | 用于制备显色平板 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 71251 | 短链脂肪酸（SCFA）的标准品 |
| 琼脂 | Solarbio | YZ-1012214 | 培养基组分 |
| 厌氧培养箱 | Electrotek | AW 400SG | 用于细菌培养与发酵 |
| 高压灭菌器 | SANYO | MLS-3750 | 用于高压灭菌 |
| 大豆蛋白胨 | Sigma-Aldrich | 70178 | 培养基组分 |
| 烘箱 | 上海一恒科学仪器有限公司 | DHG-9240A | 用于加热与烘烤 |
| 牛肉浸膏 | Solarbio | G8270 | 培养基组分 |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | 细菌 |
| 胆盐 | Solarbio | YZ-1071304 | 培养基组分 |
| 丁酸 | Sigma-Aldrich | 19215 | 短链脂肪酸（SCFA）的标准品 |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | 培养基盐溶液 |
| 毛细管色谱柱 | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | 用于短链脂肪酸（SCFA）检测 |
| 酪蛋白胨 | Sigma-Aldrich | 39396 | 培养基组分 |
| 离心机 | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | 用于离心操作 |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | 培养基组分 |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | 培养基组分 |
| 半胱氨酸盐酸盐 | Solarbio | L1550 | 培养基组分 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 用于制备维生素 K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | 培养基组分 |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | 399388 | 用于薄层色谱（TLC） |
| 气相色谱仪 | 岛津公司 | GC-2010 Plus | 用于短链脂肪酸（SCFA）检测 |
| 玻璃烧杯 | Fisher Scientific | FB10050 | 用于制备悬浊液 |
| 葡萄糖 | Solarbio | G8760 | 培养基组分 |
| 血红素 | Solarbio | H8130 | 培养基组分 |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | 用于调节缓冲液 pH 的基础溶液 |
| 异丁酸 | Sigma-Aldrich | 46935-U | 短链脂肪酸（SCFA）的标准品 |
| 异戊酸 | Sigma-Aldrich | 129542 | 短链脂肪酸（SCFA）的标准品 |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | 培养基盐溶液 |
| KCl | Solarbio | P9921 | 培养基组分 |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | 培养基盐溶液 |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | 用于制备显色平板 |
| 肉浸膏 | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | 培养基组分 |
| 偏磷酸 | Sigma-Aldrich | B7350 | 短链脂肪酸（SCFA）的标准品 |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | 培养基组分 |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | 培养基盐溶液 |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE 系统 | 用于 DNA 测序 |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | 培养基盐溶液 |
| 莫匹罗星 | Solarbio | YZ-1448901 | 抗生素 |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | 培养基盐溶液 |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | 培养基盐溶液 |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | 测定 DNA 浓度 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | 用于调节缓冲液 pH 的基础溶液 |
| 正丁醇 | ChemSpider | 71-36-3 | 用于薄层色谱（TLC） |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | 培养基组分 |
| 地衣酚 | Sigma-Aldrich | 447420 | 用于制备地衣酚试剂 |
| 丙酸 | Sigma-Aldrich | 94425 | 短链脂肪酸（SCFA）的标准品 |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | 用于提取细菌基因组 DNA |
| 即用型 PBS 粉末 | 上海生工生物工程有限公司 | A610100-0001 | 用于制备脂质悬浮液 |
| 刃天青 | Solarbio | R8150 | 厌氧设备指示剂 |
| 真空离心浓缩仪 | LABCONCO | CentriVap | 用于制备胞外多糖（EPSs） |
| 淀粉 | Solarbio | YZ-140602 | 作为碳源使用 |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 150692 | 用于制备地衣酚试剂 |
| T100 PCR 仪 | BIO-RAD | 1861096 | 用于 PCR 扩增 |
| 薄层色谱铝板 | MerckMillipore | 116835 | 用于薄层色谱（TLC） |
| 胰蛋白胨 | Sigma-Aldrich | Z699209 | 培养基组分 |
| 胰胨 | Sigma-Aldrich | T7293 | 培养基组分 |
| 吐温 80 | Solarbio | T8360 | 培养基盐溶液 |
| 戊酸 | Sigma-Aldrich | 75054 | 短链脂肪酸（SCFA）的标准品 |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | 培养基组分 |
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | 用于涡旋混合 |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | Y1625 | 培养基组分 |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | 培养基组分 |
参考文献
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