方法文章

利用膜上消化技术评估蛋白质-蛋白质相互作用

DOI：

10.3791/59733

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2019年7月19日

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1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍一种用于质谱分析样品制备的膜上消化技术方案。该技术有助于便捷地分析蛋白质-蛋白质相互作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

许多细胞内蛋白质会根据其细胞内和细胞外环境发生物理相互作用。事实上，细胞功能在很大程度上依赖于细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。因此，针对这些相互作用的研究对于深入理解生理过程至关重要。通过共沉淀相关蛋白质并结合质谱（MS）分析，能够鉴定出新的蛋白质相互作用。本研究详细介绍了免疫沉淀-液相色谱（LC）-MS/MS分析联合膜上消化技术这一新方法，用于蛋白质-蛋白质相互作用的分析。该技术适用于粗制免疫沉淀物，可提高蛋白质组学分析的通量。首先使用特异性抗体沉淀带有标签的重组蛋白，随后将免疫沉淀物转移至聚偏二氟乙烯膜片上并进行还原烷基化处理。经胰蛋白酶消化后，利用LC-MS/MS分析消化产生的蛋白质片段。应用该技术，我们成功鉴定出多个候选的相互作用蛋白质。因此，该方法在新型蛋白质-蛋白质相互作用的表征中具有良好的便捷性和实用性。

引言

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尽管蛋白质在生物体中发挥着组成性作用，但它们在细胞内环境中持续地被合成、加工和降解。此外，细胞内蛋白质经常在物理和生化层面相互作用，从而影响一个或两个蛋白质的功能1,2,3。例如，剪接体相关蛋白同源物CWC22与真核翻译起始因子4A3（eIF4A3）的直接结合，对于外显子连接复合物的组装至关重要4。与此一致的是，缺乏与CWC22亲和力的eIF4A3突变体无法促进由外显子连接复合物驱动的mRNA剪接4。因此，研究蛋白质相互作用对于精确理解生理调控机制以及细胞功能至关重要。

质谱技术（MS）的最新进展已应用于蛋白质-蛋白质相互作用的全面分析。例如，通过共沉淀内源性蛋白质或外源引入的带标签蛋白质及其相互作用蛋白，随后进行质谱分析，能够鉴定出新的蛋白质相互作用5。然而，MS/MS分析的一个主要瓶颈是蛋白质样品经胰蛋白酶消化后的回收率较低。在对细胞裂解液进行蛋白质组学分析时，通常采用凝胶内消化或膜上消化技术来制备MS/MS样品。我们此前曾比较了凝胶内消化与膜上消化两种方法6，结果表明后者具有更高的序列覆盖度。聚偏....

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方案

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1. 免疫沉淀

注意：我们采用了非十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液和柠檬酸洗脱，具体方法如下文所述。然而，也可使用实验室自建的其他免疫沉淀技术来制备LC-MS/MS样品。

  1. 用编码表位标签单独或融合蛋白的载体转染培养的细胞。为获得代表性数据，使用阳离子脂质体将 J774 细胞（1 × 106）转染编码绿色荧光蛋白（GFP）单独或 GFP 融合 Capn6（calpain-6 基因）的载体。
  2. 将抗体偶联至磁珠。
    1. 为此，取抗 GFP 抗体（2 μL/反应）与磁珠（25 μL/反应）在 1.5 mL 离心管中加入 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液（24.5 mM 柠檬酸，51.7 mM 磷酸氢二钠；pH 5.0）混合。
    2. 在室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。然后用含 0.1% 聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤 IgG 偶联磁珠三次。
  3. 使用适当的裂解缓冲液裂解转染后的细胞。为获得代表性数据，在转染后 24 小时，于 1.5 mL 离心管中将转染细胞在冰上裂解 30 分钟，裂解液为 400 µL（含 50 mM Tris-HCl；pH 7.5，120 mM NaCl，0.5% 聚氧乙烯辛基苯基醚），并添加 40 μmol/L 苯甲基磺酰氟、50 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、50 μg/mL 抑....

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结果

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通过上述方法，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对免疫沉淀物进行了分析（图1）。在排除外源性蛋白（来自其他物种的蛋白和IgG）后，在钙蛋白酶-6相关免疫沉淀物中鉴定出17种蛋白（表1），在GFP相关免疫沉淀物中鉴定出15种蛋白（表2）。在钙蛋白酶-6和GFP相关蛋白中，有11种蛋白在两种免疫沉淀物中均被鉴定出（图2）。在排除这些共有蛋白以及钙蛋白酶-6本身后，剩余5种候选的钙蛋白酶-6相关蛋白：补体C1q亚组分亚基C、II型角蛋白细胞骨架8、IgE结合蛋白、ADP/ATP转位酶1和泛素。

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讨论

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我们此前已描述了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）结合膜上消化技术，对氧化型低密度脂蛋白中载脂蛋白B-100的氧化修饰进行分析的方法6。在本研究中，我们将该技术与免疫沉淀法相结合，鉴定出多种与钙蛋白酶-6（calpain-6）相关的蛋白质。这一新技术为筛选候选相互作用蛋白提供了一种便捷的方法。钙蛋白酶-6是钙蛋白酶蛋白水解家族中一种无蛋白水解活性的成员11，据报道称可通过蛋白质-蛋白质相互作用调节细胞功能12,13。我们此前曾利用不同的质谱配置，通过膜上消化技术鉴定了其他与钙蛋白酶-6相互作用的蛋白质12。因此，我们建议测试多种质谱条件，以最大化鉴定出的候选蛋白数量。出于相同原因，评估免疫沉淀条件（如表位标签类型、去垢剂和洗脱溶液的选择）对于获得最佳实验结果至关重要。

在本研究中，我们在钙蛋白酶-6和GFP相关.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究部分由日本科学促进会KAKENHI资助项目17K09869（资助AM）、日本科学促进会KAKENHI资助项目15K09418（资助TM）、金原一郎医学科学基金会研究基金以及铃木纪念基金会研究基金（以上均资助TM）支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Wako014-00386
柠檬酸Wako030-05525
DiNAKYA Tech Co.纳米流高效液相色谱系统
DiNa AIKYA Tech Co.配备自动进样器的纳米流高效液相色谱系统
DTTNacalai tesque14112-94
Dynabeads protein GThermo Fisher Scientific10003D
甲酸Wako066-00461
HiQ Sil C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000.10 mm内径 × 100 mm长度
碘乙酰胺Wako095-02151
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Living Colors A.v. 单克隆抗体 (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH4HCO3Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507聚氧乙烯辛基苯基醚 (n=9)
肽标准品KYA Tech Co.tBSA-04牛血清白蛋白的胰蛋白酶消化产物
PP 小瓶KYA Tech Co.03100S塑料样品管
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8465
ProteinPilot 软件Sciex5034057用于蛋白质鉴定的软件
测序级修饰胰蛋白酶PromegaV5111胰蛋白酶
正钒酸钠SigmaS6508
磷酸氢二钠二水合物Sigma71643
TFAWako206-10731
捕获柱KYA Tech Co.A03-05-0010.5 mm内径 × 1 mm长度
TripleTOF 5600 系统Sciex4466015混合型四极杆-飞行时间串联质谱仪
TrisWako207-06275
Tween-20Wako160-21211

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular infl....

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重印与许可

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