利用膜上消化技术评估蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

本文介绍一种用于质谱分析样品制备的膜上消化技术方案。该技术有助于便捷地分析蛋白质-蛋白质相互作用。

摘要

许多细胞内蛋白质会根据其细胞内和细胞外环境发生物理相互作用。事实上，细胞功能在很大程度上依赖于细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。因此，针对这些相互作用的研究对于深入理解生理过程至关重要。通过共沉淀相关蛋白质并结合质谱（MS）分析，能够鉴定出新的蛋白质相互作用。本研究详细介绍了免疫沉淀-液相色谱（LC）-MS/MS分析联合膜上消化技术这一新方法，用于蛋白质-蛋白质相互作用的分析。该技术适用于粗制免疫沉淀物，可提高蛋白质组学分析的通量。首先使用特异性抗体沉淀带有标签的重组蛋白，随后将免疫沉淀物转移至聚偏二氟乙烯膜片上并进行还原烷基化处理。经胰蛋白酶消化后，利用LC-MS/MS分析消化产生的蛋白质片段。应用该技术，我们成功鉴定出多个候选的相互作用蛋白质。因此，该方法在新型蛋白质-蛋白质相互作用的表征中具有良好的便捷性和实用性。

引言

尽管蛋白质在生物体中发挥着组成性作用，但它们在细胞内环境中持续地被合成、加工和降解。此外，细胞内蛋白质经常在物理和生化层面相互作用，从而影响一个或两个蛋白质的功能^1,2,3。例如，剪接体相关蛋白同源物CWC22与真核翻译起始因子4A3（eIF4A3）的直接结合，对于外显子连接复合物的组装至关重要⁴。与此一致的是，缺乏与CWC22亲和力的eIF4A3突变体无法促进由外显子连接复合物驱动的mRNA剪接⁴。因此，研究蛋白质相互作用对于精确理解生理调控机制以及细胞功能至关重要。

质谱技术（MS）的最新进展已应用于蛋白质-蛋白质相互作用的全面分析。例如，通过共沉淀内源性蛋白质或外源引入的带标签蛋白质及其相互作用蛋白，随后进行质谱分析，能够鉴定出新的蛋白质相互作用⁵。然而，MS/MS分析的一个主要瓶颈是蛋白质样品经胰蛋白酶消化后的回收率较低。在对细胞裂解液进行蛋白质组学分析时，通常采用凝胶内消化或膜上消化技术来制备MS/MS样品。我们此前曾比较了凝胶内消化与膜上消化两种方法⁶，结果表明后者具有更高的序列覆盖度。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜可能特别适用于此目的，因其具有良好的机械强度，并能耐受高浓度的有机溶剂^7,8，从而允许在含80%乙腈的条件下对固定化蛋白质进行酶解⁹。此外，蛋白质在膜上的固定可能诱导其构象变化，从而提高胰蛋白酶消化效率¹⁰。因此，本文描述了一种结合免疫沉淀、采用膜上消化技术进行LC/MS/MS分析蛋白质相互作用的方法。这一简单方法使得即使在非专业实验室中也能便捷地分析蛋白质-蛋白质相互作用。

方案

1. 免疫沉淀

注意：我们采用了非十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液和柠檬酸洗脱，具体方法如下文所述。然而，也可使用实验室自建的其他免疫沉淀技术来制备LC-MS/MS样品。

1. 用编码表位标签单独或融合蛋白的载体转染培养的细胞。为获得代表性数据，使用阳离子脂质体将 J774 细胞（1 × 10⁶）转染编码绿色荧光蛋白（GFP）单独或 GFP 融合 Capn6（calpain-6 基因）的载体。
2. 将抗体偶联至磁珠。
   1. 为此，取抗 GFP 抗体（2 μL/反应）与磁珠（25 μL/反应）在 1.5 mL 离心管中加入 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液（24.5 mM 柠檬酸，51.7 mM 磷酸氢二钠；pH 5.0）混合。
   2. 在室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。然后用含 0.1% 聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤 IgG 偶联磁珠三次。
3. 使用适当的裂解缓冲液裂解转染后的细胞。为获得代表性数据，在转染后 24 小时，于 1.5 mL 离心管中将转染细胞在冰上裂解 30 分钟，裂解液为 400 µL（含 50 mM Tris-HCl；pH 7.5，120 mM NaCl，0.5% 聚氧乙烯辛基苯基醚），并添加 40 μmol/L 苯甲基磺酰氟、50 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、50 μg/mL 抑肽酶、200 μmol/L 原钒酸钠和 1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）。
4. 将裂解液在 15,000 × g 离心 5 分钟以澄清，并收集上清液。
5. 预清除裂解液。在 1.5 mL 离心管中加入未标记的磁珠（25 μL/反应）。用 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤去除缓冲液后，将细胞裂解液加至磁珠上。使用旋转仪在室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 30 分钟。
6. 将离心管置于磁力架上 5 分钟以实现磁分离，并收集细胞裂解液。建议使用制造商指定的磁力架。
7. 使目标蛋白与偶联磁珠结合。将免疫球蛋白 G（IgG）偶联磁珠置于磁力架上 5 分钟进行磁分离，弃去柠檬酸磷酸盐缓冲液，然后将细胞裂解液加入分离后的磁珠中。
8. 在室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。
9. 将目标蛋白与游离的非目标蛋白分离。用含 0.1% 聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯的 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤后，加入 30 µL 柠檬酸缓冲液（pH 2–3），在室温下孵育 5 分钟以洗脱目标蛋白。
   注：如果免疫沉淀回收率不足，使用其他表位标签（如 FLAG 或 HIS）可能提高效率。如果洗脱效率不足，使用其他洗脱液（如基于 SDS 的溶液）可能提高效率。

2. 蛋白质的膜上消化

注意：必须使用无蛋白的材料和设备，以避免外源性蛋白质污染。此外，建议操作人员佩戴外科口罩和手套，以防止人体蛋白质污染。

1. 使用手术剪将PVDF膜裁剪成3 mm × 3 mm的小片，手术剪在使用前需用甲醇擦拭并立即干燥。
2. 在洁净的铝箔上的PVDF膜小片上加入2–5 µL乙醇。
3. 在乙醇完全干燥前，将洗脱液（每份2–5 µL，每个样品4–6片）加至亲水性PVDF膜上，然后空气干燥至膜表面呈哑光状。干燥后的膜可于4 °C保存。
4. 将所有膜转移至1.5 mL塑料离心管中，加入20–30 µL乙醇使膜恢复亲水性，随后用移液器吸除乙醇。
5. 在膜完全干燥前，加入200 µL含二硫苏糖醇（DTT）的反应溶液（80 mM NH₄HCO₃、10 mM DTT和20%乙腈），于56 °C孵育1小时。
6. 将反应溶液更换为300 µL碘乙酰胺溶液（80 mM NH₄HCO₃、55 mM碘乙酰胺和20%乙腈），避光室温孵育45分钟。
7. 用1 mL蒸馏水涡旋振荡洗涤膜两次，再用1 mL 2%乙腈涡旋振荡洗涤一次，每次振荡时间超过>10秒。
8. 将冻干的质谱级胰蛋白酶（材料表）直接溶解于反应溶液（含70%乙腈的30 mM NH₄HCO₃）中。向膜中加入含1 μg胰蛋白酶（材料表）的反应溶液100 µL（含70%乙腈的30 mM NH₄HCO₃），于37 °C过夜孵育。
9. 用移液器将含有胰蛋白酶消化产物的反应溶液转移至洁净的1.5 mL离心管中。
10. 向膜中加入100 µL洗涤液（70%乙腈/1%三氟乙酸），于60 °C孵育2小时。收集洗涤液并与反应溶液混合。再向膜中加入100 μL洗涤液，超声处理10分钟，随后收集洗涤液并与反应溶液混合。
11. 用实验室封口膜覆盖离心管，并用针扎几个小孔。使用真空浓缩仪将溶液干燥。
12. 将残余物溶解于10 µL 0.2%甲酸中。离心（12,000 × g，室温3分钟）后，将上清液转移至样品管中。
    注意：洗涤步骤是本部分的关键。在膜上蛋白质消化过程中，还原和烷基化后，使用蒸馏水对固定有蛋白质的膜进行洗涤，随后用2%乙腈洗涤，每次振荡超过10秒，对于去除试剂至关重要。

3. 液相色谱-电喷雾电离（ESI）-串联质谱分析

1. 启动与纳米液相色谱（nano-LC HPLC）系统（材料表）联用的电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）仪器（材料表），连接预柱（材料表）和分析柱（材料表）。
2. 在分析前，使用溶于0.2%甲酸中的牛血清白蛋白胰蛋白酶消化产物对质谱仪进行校准，以提供标准肽段。
3. 采用正离子模式对样品进行分析，质荷比（m/z）范围为400–1,250；随后在80分钟内以300 nL/min的流速，使用2%–80%乙腈和0.2%甲酸的线性梯度，采集最多10张二级质谱（MS/MS）图谱（每张100 ms），质荷比范围为100–1,600 m/z。
4. 使用蛋白质鉴定软件（材料表）分析输出数据，以鉴定候选相互作用蛋白。为实现候选蛋白的可靠鉴定，需至少检测到一个高保真度的肽段碎片（> 95%保真度）。
5. 从候选蛋白列表中剔除在表达GFP的裂解液（仅转染表达GFP标签的空载体）中同样被沉淀的蛋白。
   注意：如果数据库分析中鉴定出的蛋白质数量较少，可调整MS/MS采集条件（例如将每张图谱的采集时间从100 ms改为50 ms），以增加鉴定出的蛋白数量。

结果

通过上述方法，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对免疫沉淀物进行了分析（图1）。在排除外源性蛋白（来自其他物种的蛋白和IgG）后，在钙蛋白酶-6相关免疫沉淀物中鉴定出17种蛋白（表1），在GFP相关免疫沉淀物中鉴定出15种蛋白（表2）。在钙蛋白酶-6和GFP相关蛋白中，有11种蛋白在两种免疫沉淀物中均被鉴定出（图2）。在排除这些共有蛋白以及钙蛋白酶-6本身后，剩余5种候选的钙蛋白酶-6相关蛋白：补体C1q亚组分亚基C、II型角蛋白细胞骨架8、IgE结合蛋白、ADP/ATP转位酶1和泛素。

讨论

我们此前已描述了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）结合膜上消化技术，对氧化型低密度脂蛋白中载脂蛋白B-100的氧化修饰进行分析的方法⁶。在本研究中，我们将该技术与免疫沉淀法相结合，鉴定出多种与钙蛋白酶-6（calpain-6）相关的蛋白质。这一新技术为筛选候选相互作用蛋白提供了一种便捷的方法。钙蛋白酶-6是钙蛋白酶蛋白水解家族中一种无蛋白水解活性的成员¹¹，据报道称可通过蛋白质-蛋白质相互作用调节细胞功能^12,13。我们此前曾利用不同的质谱配置，通过膜上消化技术鉴定了其他与钙蛋白酶-6相互作用的蛋白质¹²。因此，我们建议测试多种质谱条件，以最大化鉴定出的候选蛋白数量。出于相同原因，评估免疫沉淀条件（如表位标签类型、去垢剂和洗脱溶液的选择）对于获得最佳实验结果至关重要。

在本研究中，我们在钙蛋白酶-6和GFP相关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Wako	014-00386
柠檬酸	Wako	030-05525
DiNA	KYA Tech Co.		纳米流高效液相色谱系统
DiNa AI	KYA Tech Co.		配备自动进样器的纳米流高效液相色谱系统
DTT	Nacalai tesque	14112-94
Dynabeads protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D
甲酸	Wako	066-00461
HiQ Sil C18W-3	KYA Tech Co.	E03-100-100	0.10 mm内径 × 100 mm长度
碘乙酰胺	Wako	095-02151
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000008
Living Colors A.v. 单克隆抗体 (JL-8)	Clontech	632380
NaCl	Wako	191-01665
NH4HCO3	Wako	018-21742
Nonidet P-40	Sigma	N6507	聚氧乙烯辛基苯基醚 (n=9)
肽标准品	KYA Tech Co.	tBSA-04	牛血清白蛋白的胰蛋白酶消化产物
PP 小瓶	KYA Tech Co.	03100S	塑料样品管
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8465
ProteinPilot 软件	Sciex	5034057	用于蛋白质鉴定的软件
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5111	胰蛋白酶
正钒酸钠	Sigma	S6508
磷酸氢二钠二水合物	Sigma	71643
TFA	Wako	206-10731
捕获柱	KYA Tech Co.	A03-05-001	0.5 mm内径 × 1 mm长度
TripleTOF 5600 系统	Sciex	4466015	混合型四极杆-飞行时间串联质谱仪
Tris	Wako	207-06275
Tween-20	Wako	160-21211