本文描述了对DNA中的损伤产物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）、1,N6-乙烷-2'-脱氧腺苷（1,N6-dAdo）和1,N2-乙烷-2'-脱氧鸟苷（1,N2-dGuo）进行高灵敏度和准确测定的方法。这些方法已应用于评估暴露于细颗粒物（PM2.5）的A/J小鼠组织（肺、肝和肾）中的损伤效应。
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方法文章
通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
DNA加合物和氧化DNA碱基是DNA损伤的典型例子，可作为评估亲电性物质、经生物转化后产生活性亲电物的物质或诱导氧化应激的物质毒性的有用生物标志物。在氧化的核碱基中，研究最为广泛的是8-氧-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）或8-氧-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo），其为DNA中氧化性碱基损伤的生物标志物。脂质过氧化过程中产生的醛类和环氧醛类属于亲电性分子，能够形成致突变性的外环DNA加合物，例如乙烯加合物1,N2-乙烯-2'-脱氧鸟苷（1,N2-εdGuo）和1,N6-乙烯-2'-脱氧腺苷（1,N6-εdAdo），这些已被建议作为炎症病理生理过程中的潜在生物标志物。为了制定预防策略以减缓细胞突变率和慢性疾病（如癌症、神经退行性疾病）的发展，有必要建立针对这些物质在DNA中定量的选择性和高灵敏度方法。在可用于检测这些物质的高灵敏度方法中（如高效液相色谱联用电化学或串联质谱检测器、彗星试验、免疫分析法、32P-后标记法），基于高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）的方法具有最高的选择性。在分析复杂生物样品时，选择性是一项关键优势，HPLC-ESI-MS/MS已发展成为在DNA、尿液、血浆和唾液等生物基质中定量修饰核苷的金标准。使用同位素标记的内标可校正DNA水解及分析物富集过程中分子的损失，并校正不同样品间分析物离子化效率的差异，同时在存在多个色谱峰时有助于准确识别目标色谱峰。
本文介绍了经过验证的高灵敏度、准确且精密的高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）方法，已成功用于定量分析A/J小鼠肺、肝和肾DNA中的8-oxodGuo、1,N6-dAdo和1,N2-dGuo，以评估环境PM2.5暴露的影响。
引言
一些活性氧（ROS）能够氧化DNA碱基中的碳-碳双键以及脱氧核糖部分的某些碳原子，从而产生氧化碱基和DNA链断裂1。由于DNA是一种富含氮和氧原子的带负电荷分子，它也是亲电基团的作用靶点，这些亲电基团可与亲核位点（氮和氧）发生共价反应，生成称为DNA加合物的产物2。因此，DNA加合物和氧化DNA碱基是DNA损伤的典型例子，可作为评估具有亲电性、在生物转化过程中生成活性亲电体或诱导氧化应激的物质毒性的有用生物标志物1,2。尽管修饰后的DNA碱基可通过碱基切除修复（BER）或核苷酸切除修复（NER）从DNA中移除，但当DNA损伤的生成与清除之间出现失衡并倾向于前者时，会导致DNA中这些损伤水平随时间净增加3。其后果包括DNA突变率升高、基因表达降低以及蛋白质活性减弱2,4,5,6,7，这些效应与多种疾病的发生发展密切相关。DNA突变可能影响多种细胞功能，如....
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方案
四只四周龄雄性A/J小鼠，无特定病原体，购自巴西里约热内卢奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（FIOCRUZ）实验动物繁殖中心，并根据圣保罗大学医学院伦理委员会批准的实验方案（编号o 1310/09).
1. 小鼠组织的采集
- 使用赛拉嗪和氯胺酮对动物进行麻醉。对于体重为30 g的小鼠，腹腔注射不超过2 mL的溶液，其中包含2.63 mg氯胺酮和0.38 mg赛拉嗪。
- 采集血液（0.5 - 1.5 mL）用于补充性分析（例如抗氧化酶活性、丙二醛水平）。
- 从骨盆至剑突处剃除腹部毛发。在无毛区域沿中线做垂直切口，再沿两侧做水平切口，以暴露腹腔器官。
- 切断腹主动脉以促进放血并实施安乐死。
- 取出目标组织（本实验中为肝脏、肾脏和肺）。
- 切除下腔静脉和门静脉以取出肝脏。
- 切断肾动静脉以取出肾脏。
- 在膈肌末端及靠近胸壁的周围做切口，以暴露肺部。将剪刀插入胸腔内部撑开，折断锁骨。从剑突向气管方向切断胸骨外缘，以暴露肺和心脏。
- 用镊子夹住肺组织，切断气管及肺周围韧带。小心取出肺与心脏的整体组织块。若需将肺从组织块中分离，可用镊子固定心脏，并切断其基部的所有血管。
- 立即用冷生理盐水（0.9% NaCl）冲洗分离....
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结果
从小鼠肝脏（约 1 g 组织）、肺脏（约 0.2 g 组织）和肾脏（约 0.4 g 组织）中提取的 DNA 平均浓度（± 标准差）分别为 5,068 ± 2,615、4,369 ± 1,021 和 3,223 ± 723 µg/mL，最终体积为 200 µL。通过高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）分析纯化后的 DNA 所得的代表性色谱图见图 3。色谱图中显示出四种 2'-脱氧核苷，且未检测到在相应 2'-脱氧核苷之前洗脱的 RNA 核糖核苷，表明所提取 DNA 纯度较高。
用于8-oxodGuo定量分析的HPLC-ESI-MS/MS代表性色谱图, 1,N6-εdAdo 和 1,N2小鼠组织DNA样本中的-εdGuo如图所示 图4至图6. 采用紫外检测获得的色谱图 <.......
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讨论
一个常见的主要问题 在采用HPLC方法进行8-oxodGuo分析时，一个主要问题是DNA提取、DNA水解及DNA水解物浓缩等前处理过程中可能诱导其形成22,38为尽量减少8-oxodGuo人为形成的问题，建议在所有DNA提取、储存和水解溶液中添加去铁胺，采用碘化钠变性法提取DNA并避免使用苯酚，同时在水解过程中使用接近100 µg的DNA量，以最大限度降低虚假氧化对最终结果的干扰。39我们考虑了上述引用的建议，但未采用碘化钠变性法提取DNA。为简便起见，我们使用了市售的DNA提取试剂溶液，并在使用前向其中添加去铁胺。此外，将获得的DNA水解产物直接注入HPLC-ESI-MS/MS系统的首根色谱柱，以实现8-oxodGuo与正常核苷的初步分离。在8-oxodGuo洗脱前，通过切换阀将第一根色谱柱的洗脱液转移至第二根色谱柱，以实现进一步分离并缩小峰宽。该方法使8-oxodGuo的定量具有足够的灵敏度，且不受干扰物影响。迄今为止，最相似的DNA中8-oxodGuo定量方.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
圣保罗州研究资助基金会（FAPESP，项目编号：2012/22190-3 和 2012/08616-8）、国家科学技术发展委员会（CNPq，项目编号：454214/2014-6 和 429184/2016-6）、高等教育人员提升协调办公室（CAPES）、圣保罗大学研究副校长办公室（PRPUSP）、国家科学和技术研究所 INAIRA（INCT INAIRA，MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP；项目编号：573813/2008-6）、国家科学和技术研究所 Redoxoma（INCT Redoxoma，FAPESP/CNPq/CAPES；项目编号：573530/2008-4）、Redoxoma 多学科研究计划（NAP Redoxoma，PRPUSP；项目编号：2011.1.9352.1.8）以及 Redoxoma 研究中心（CEPID Redoxoma，FAPESP；项目编号：2013/07937-8）。T. F. Oliveira 和 A. A. F. Oliveira 获得了 FAPESP（项目编号：2012/21636-8、2011/09891-0、2012/08617-4）和 CAPES（高等教育人员提升协调办公室）的奖学金资助。M. H. G. Medeiros、P. Di Mascio、P. H. N. Saldiva 和 A. P. M. Loureiro 获得了 CNPq 的研究员资助。
本文中的一些图和表最初发表于....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| [15N5]-2’-脱氧腺苷 | 剑桥同位素实验室 | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2’-脱氧鸟苷 | 剑桥同位素实验室 | NLM-3899-CA-10 | |
| 乙腈 | Carlo Erba 试剂 | 412413000 | |
| 牛肠黏膜碱性磷酸酶 | Sigma | P5521 | |
| 乙酸铵 | 默克 | 101116 | |
| 小牛胸腺DNA | Sigma | D1501 | |
| 细胞裂解液 | QIAGEN | 158908 | |
| 氯仿 | Carlo Erba 试剂 | 412653 | |
| 去铁胺 | Sigma | D9533 | |
| 脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| 乙醇 | Carlo Erba 试剂 | 414542 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| HPLC-ESI-MS/MS 系统 | 高效液相色谱：Agilent 1200 系列 ESI-MS/MS：Applied Biosystems/MDS Sciex 仪器 | 高效液相色谱仪：双元泵（G1312B）、等度泵（G1310A）、带柱切换阀的柱温箱（G1316B）、二极管阵列检测器（G1315C）、自动进样器（G1367C）。 ESI-MS/MS：线性四极杆离子阱质谱仪，型号 4000 QTRAP。 | |
| HPLC/DAD 系统 | 岛津 | 两台泵（LC-20AT）、光电二极管阵列检测器（DAD-20AV）、自动进样器（Proeminence SIL-20AC）、柱温箱（CTO-10AS/VP） | |
| HPLC色谱柱（50 × 2.0 mm 内径，2.5 µm，C18 | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| HPLC色谱柱（150 × 2.0 mm 内径，3.0 µm，C18 | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| 高效液相色谱柱（250 × 4.6 mm 内径，5.0 µm，C18 | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| HPLC C18 保护柱（4.0 × 3.0 mm 内径） | Phenomenex | AJO-4287 | |
| 异戊醇 | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| 异丙醇（异丙醇） | Carlo Erba 试剂 | A412790010 | |
| 氯胺酮 | Ceva | 商品名：Dopalen | |
| 氯化镁 | Carlo Erba 试剂 | 349377 | |
| 氯化镁 | Sigma | M2393 | |
| 甲醇 | Carlo Erba 试剂 | L022909K7 | |
| 来自磷酸二酯酶 I Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| 蛋白沉淀溶液 | QIAGEN | 158912 | |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| 核糖核酸酶A | Sigma | R5000 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18（Strata-X） | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Carlo Erba 试剂 | 489983 | |
| 赛拉嗪 | Syntec 巴西 | 商品名：Xilazin |
参考文献
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens a....
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重印与许可
