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方法文章

通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

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DOI：

10.3791/59734

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2019年5月29日

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1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了对DNA中的损伤产物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）、1,N6-乙烷-2'-脱氧腺苷（1,N6-dAdo）和1,N2-乙烷-2'-脱氧鸟苷（1,N2-dGuo）进行高灵敏度和准确测定的方法。这些方法已应用于评估暴露于细颗粒物（PM2.5）的A/J小鼠组织（肺、肝和肾）中的损伤效应。

摘要

DNA加合物和氧化DNA碱基是DNA损伤的典型例子，可作为评估亲电性物质、经生物转化后产生活性亲电物的物质或诱导氧化应激的物质毒性的有用生物标志物。在氧化的核碱基中，研究最为广泛的是8-氧-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）或8-氧-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo），其为DNA中氧化性碱基损伤的生物标志物。脂质过氧化过程中产生的醛类和环氧醛类属于亲电性分子，能够形成致突变性的外环DNA加合物，例如乙烯加合物1,N2-乙烯-2'-脱氧鸟苷（1,N2-εdGuo）和1,N6-乙烯-2'-脱氧腺苷（1,N6-εdAdo），这些已被建议作为炎症病理生理过程中的潜在生物标志物。为了制定预防策略以减缓细胞突变率和慢性疾病（如癌症、神经退行性疾病）的发展，有必要建立针对这些物质在DNA中定量的选择性和高灵敏度方法。在可用于检测这些物质的高灵敏度方法中（如高效液相色谱联用电化学或串联质谱检测器、彗星试验、免疫分析法、32P-后标记法），基于高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）的方法具有最高的选择性。在分析复杂生物样品时，选择性是一项关键优势，HPLC-ESI-MS/MS已发展成为在DNA、尿液、血浆和唾液等生物基质中定量修饰核苷的金标准。使用同位素标记的内标可校正DNA水解及分析物富集过程中分子的损失，并校正不同样品间分析物离子化效率的差异，同时在存在多个色谱峰时有助于准确识别目标色谱峰。

本文介绍了经过验证的高灵敏度、准确且精密的高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）方法，已成功用于定量分析A/J小鼠肺、肝和肾DNA中的8-oxodGuo、1,N6-dAdo和1,N2-dGuo，以评估环境PM2.5暴露的影响。

引言

一些活性氧（ROS）能够氧化DNA碱基中的碳-碳双键以及脱氧核糖部分的某些碳原子，从而产生氧化碱基和DNA链断裂1。由于DNA是一种富含氮和氧原子的带负电荷分子，它也是亲电基团的作用靶点，这些亲电基团可与亲核位点（氮和氧）发生共价反应，生成称为DNA加合物的产物2。因此，DNA加合物和氧化DNA碱基是DNA损伤的典型例子，可作为评估具有亲电性、在生物转化过程中生成活性亲电体或诱导氧化应激的物质毒性的有用生物标志物1,2。尽管修饰后的DNA碱基可通过碱基切除修复（BER）或核苷酸切除修复（NER）从DNA中移除，但当DNA损伤的生成与清除之间出现失衡并倾向于前者时，会导致DNA中这些损伤水平随时间净增加3。其后果包括DNA突变率升高、基因表达降低以及蛋白质活性减弱2,4,5,6,7，这些效应与多种疾病的发生发展密切相关。DNA突变可能影响多种细胞功能，如细胞信号传导、细胞周期、基因组完整性、端粒稳定性、表观基因组、染色质结构、RNA剪接、蛋白质稳态、代谢、细胞凋亡以及细胞分化8,9。减缓细胞突变率和慢性疾病（如癌症、神经退行性疾病）发展的策略，依赖于对突变来源的认识，其中就包括DNA损伤及其成因。

由于暴露于污染物、持续性炎症、疾病病理生理状态（如糖尿病）等原因，体内过量产生的活性氧（ROS）是导致生物大分子损伤的重要原因，包括DNA和脂质损伤1。例如，由过渡金属离子（Fe2+、Cu+）还原H2O2生成的高活性羟基自由基（OH）能够以扩散控制速率氧化DNA碱基、DNA糖基部分以及多不饱和脂肪酸10。在目前已表征的80种氧化核碱基中3，研究最为广泛的是8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxoGua）或8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo，图1），该损伤可在哺乳动物细胞中诱发G→T颠换10,11。它由鸟嘌呤的单电子氧化，或DNA中鸟嘌呤受到羟基自由基或单线态氧攻击而形成1。多不饱和脂肪酸也是高活性氧化剂（如•OH）的重要靶标，可启动脂质过氧化过程1,12。该过程生成脂肪酸氢过氧化物，其可分解为亲电性醛类和环氧醛类物质，如丙二醛、4-羟基-2-壬烯醛、2,4-癸二烯醛、4,5-环氧-(2E)-癸烯醛、己烯醛、丙烯醛和巴豆醛，这些产物能够形成具有致突变性的环外DNA加合物，如丙二醛加合物、丙烷加合物或乙醛加合物1,12,13。乙醛加合物中的1,N2-乙醛-2'-脱氧鸟苷（1,N2-εdGuo，图1）和1,N6-乙醛-2'-脱氧腺苷（1,N6-εdAdo，图1）已被提出作为炎症病理生理过程中潜在的生物标志物14,15。

修饰核苷的化学结构；8-氧代-dG、1,N²-乙醛基-dG、1,N⁶-乙醛基-dA 示意图。
图1. 本研究中定量分析的DNA损伤的化学结构。 dR = 2´-脱氧核糖。该图改编自Oliveira等人的研究34。请点击此处查看此图的放大版本。

20世纪80年代初开展的研究实现了通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）对8-oxodGuo的高灵敏度检测。在多种经受氧化条件的生物体系中，利用HPLC-ECD对8-oxodGuo进行定量，促使人们将8-oxodGuo确认为DNA中氧化诱导碱基损伤的生物标志物1,16。尽管该方法稳定可靠，且可实现对低至fmol水平的8-oxodGuo进行定量17，但HPLC-ECD检测依赖于待测物保留时间的准确性以进行定性识别，并依赖色谱分离度以避免样品中其他组分的干扰。由于电化学检测需要在流动相中使用盐类（如磷酸钾、乙酸钠），因此维持适当的分析条件需要定期对色谱柱和设备进行清洗。

另一种方法是使用细菌DNA修复酶甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（formamidopyrimidine DNA glycosylase, FPG），随后使用人源8-氧代鸟嘌呤糖基化酶1（human 8-oxoguanine glycosylase 1, hOGG1），以检测并去除DNA中的8-氧代鸟嘌呤（8-oxoGua），从而诱导产生DNA碱不稳定位点。这些碱不稳定位点可转化为DNA链断裂，进而通过碱性单细胞凝胶电泳（“彗星实验”）实现对8-oxoGua的高度敏感的间接定量。该方法的主要优势在于其高灵敏度，且无需提取细胞DNA即可完成分析。该方法测得的DNA中8-oxoGua稳态水平最低，通常比基于高效液相色谱（HPLC）的生物分析方法所得结果低7至10倍。然而，该方法属于对8-oxoGua的间接测量，其局限性包括特异性不足，以及所用修复酶的切割效率未知1,16,18。

免疫测定法是用于检测8-oxoGua1和环外DNA加合物（如1,N6-dAdo和1,N2-dGuo）的另一类方法12。尽管灵敏度较高，但使用抗体检测DNA损伤的一个缺点是特异性不足，容易与生物样品中的其他成分发生交叉反应，包括正常的DNA碱基1,12。环外DNA加合物（包括1,N6-dAdo和1,N2-dGuo）也可通过高灵敏度的32P-后标记法进行检测和定量分析12。32P-后标记法的高灵敏度使得仅需极少量DNA（例如10 µg）即可检测到每1010个正常碱基中约1个加合物19。然而，该方法也存在一些缺点，如需使用放射性化学物质、化学特异性差以及准确性较低19,20。

上述方法的一个共同局限性是检测目标分子时选择性或特异性较低。在此背景下，高效液相色谱串联电喷雾电离质谱法（HPLC-ESI-MS/MS 和 HPLC-MS3）已成为在生物基质（如 DNA、尿液、血浆和唾液）中定量修饰核苷的金标准1,19,20。HPLC-ESI-MS/MS 方法的优点包括高灵敏度（通常在低飞摩尔范围内）以及由以下三方面提供的高特异性：i）色谱分离；ii）分子在质谱仪碰撞室内的特征性和已知的碎裂模式；iii）在多反应监测模式下对选定质荷比（m/z）的精确测定1,19。使用同位素标记的内标可进一步校正 DNA 水解和分析物富集过程中发生的分子损失，以及不同样品间分析物离子化效率的差异。此外，当存在多个色谱峰时，同位素内标还有助于准确识别目标色谱峰1,12,19,20。

已有多种基于HPLC-ESI-MS/MS的方法用于定量不同生物样品DNA中提取的8-oxodGuo、1,N6-dAdo和1,N2-dGuo12,15,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29。细颗粒物（PM2.5）携带多种有机和无机化学物质，如多环芳烃（PAHs）、硝基-PAHs、醛类、酮类、羧酸、喹啉、金属以及水溶性离子，这些物质可能引发炎症和氧化应激，从而促进生物大分子损伤及相关疾病的发生30,31,32,33。本文介绍了经过验证的HPLC-ESI-MS/MS方法，并已成功应用于A/J小鼠肺、肝和肾DNA中8-oxodGuo、1,N6-dAdo和1,N2-dGuo的定量，以评估环境PM2.5暴露的影响34。

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方案

四只四周龄雄性A/J小鼠，无特定病原体，购自巴西里约热内卢奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（FIOCRUZ）实验动物繁殖中心，并根据圣保罗大学医学院伦理委员会批准的实验方案（编号o 1310/09).

1. 小鼠组织的采集

  1. 使用赛拉嗪和氯胺酮对动物进行麻醉。对于体重为30 g的小鼠，腹腔注射不超过2 mL的溶液，其中包含2.63 mg氯胺酮和0.38 mg赛拉嗪。
  2. 采集血液（0.5 - 1.5 mL）用于补充性分析（例如抗氧化酶活性、丙二醛水平）。
  3. 从骨盆至剑突处剃除腹部毛发。在无毛区域沿中线做垂直切口，再沿两侧做水平切口，以暴露腹腔器官。
  4. 切断腹主动脉以促进放血并实施安乐死。
  5. 取出目标组织（本实验中为肝脏、肾脏和肺）。
    1. 切除下腔静脉和门静脉以取出肝脏。
    2. 切断肾动静脉以取出肾脏。
    3. 在膈肌末端及靠近胸壁的周围做切口，以暴露肺部。将剪刀插入胸腔内部撑开，折断锁骨。从剑突向气管方向切断胸骨外缘，以暴露肺和心脏。
      1. 用镊子夹住肺组织，切断气管及肺周围韧带。小心取出肺与心脏的整体组织块。若需将肺从组织块中分离，可用镊子固定心脏，并切断其基部的所有血管。
  6. 立即用冷生理盐水（0.9% NaCl）冲洗分离的组织，转移至冻存管中，并迅速将冻存管浸入液氮中。完成操作后，将冻存管保存于-80 °C。
    ​警告：液氮直接接触皮肤、黏膜或眼睛可导致冻伤。操作时应使用适当的个人防护装备以避免接触。应在通风良好的实验室中操作，防止因液氮蒸气导致窒息。

2. DNA 提取

注意：DNA 提取方法参考 Loureiro 等人（2009）35 进行了修改，以便对本研究中的病变组织进行分析。

  1. 将装有组织的离心管转移至干冰中。
  2. 将培养皿置于冰上作为操作基底，用解剖刀切割组织。称取1 g用于立即使用。剩余组织应保存在干冰上，直至返回-80 °C储存。80 °C.
    注意：为防止在需要重复分析时产生人为假象，必须避免剩余组织的解冻。
  3. 向装有1 g组织的50 mL带盖试管中加入10 mL含有0.5 mM去铁胺的商用细胞裂解液，并置于冰上保存。
    注意：将去铁胺加入溶液中立即使用。每100 mL溶液中加入0.0328 g甲磺酸去铁胺盐。
  4. 使用组织匀浆器匀浆组织，直至获得无组织碎片的均一溶液。匀浆过程中保持离心管低温（置于冰上），并采用低速操作以避免产热。
  5. 添加 150 µL 向每个匀浆样品中加入蛋白酶K溶液（20 mg/mL）。倒置振荡试管，并于室温下孵育过夜。
  6. 添加 40 µL 加入15 mg/mL的核糖核酸酶A溶液，倒置混匀，室温孵育2小时。
    注意：为避免沉淀，需将核糖核酸酶A溶液配制于10 mM、pH 5.2的乙酸钠缓冲液中。将溶液加热至 100 °C 使用前于15分钟内进行处理，以获得无脱氧核糖核酸酶的溶液。
  7. 加入5 mL商用蛋白质沉淀溶液，充分涡旋振荡，然后在2,000 x g, 4 °C，10 分钟。
  8. 将上清液转移至含有10 mL预冷异丙醇的50 mL带盖离心管中。轻轻倒置管子数次，直至观察到DNA沉淀。
    注意：此处可暂停实验流程，将离心管置于 -20 °C.
  9. 使用末端封闭的巴斯德移液管收集沉淀的DNA，转移至含有4 mL 10 mM Tris缓冲液（含1 mM去铁胺，pH 7.0）的离心管中。
  10. 待DNA完全溶解于上述溶液中后（切勿涡旋），加入4 mL含4%异戊醇的氯仿溶液。
  11. 将试管倒置10次以充分混匀，随后在2,000 x g, 4 °C，静置10分钟以分离两相，将上相转移至新管中。
  12. 重复步骤 2.10 和 2.11 两次。
  13. 加入8 mL无水乙醇和0.4 mL 5 M NaCl溶液以沉淀DNA。
  14. 再次收集沉淀的DNA，并转移至3 mL 70%乙醇中。重复此步骤一次。
  15. 小心弃去乙醇溶液，将含有沉淀DNA的离心管倒置于吸水纸上，以去除多余的液体。
  16. 添加 200 µL 加入0.1 mM去铁胺溶液以溶解DNA。将离心管置于 4 °C 直至DNA完全重悬（过夜）。
  17. 通过测量260 nm处的吸光度确定DNA浓度，并通过260/280 nm吸光度比值评估其纯度。
    注意：为测定DNA浓度，转移一份等量 aliquot 10 µL DNA 溶液的 990 µL 超纯水（100倍稀释）。将260 nm处的吸光度值（应低于1）乘以50（50 µg/mL 当1 cm光程长度的溶液在260 nm处的吸光度为1时，双链DNA的浓度以及所用稀释倍数（100倍）用于获得DNA浓度 µg/mL若260 nm处的吸光度高于1，则需进行进一步稀释。理想的DNA纯度应达到260/280 nm吸光度比值等于或高于1.8，但比值在1.6左右也可接受。

3. DNA 酶促水解

  1. 分析方案
    1. 1,N6-εdAdo 和 1,N2-εdGuo 分析：取含有 150 µg DNA 的等分试样，加入 7.5 µL 200 mM Tris/MgCl2 缓冲液（pH 7.4）、1.4 µL 内标溶液（含 250 fmol/µL [15N5]1,N6-εdAdo 和 [15N5]1,N2-εdGuo）以及 15 单位脱氧核糖核酸酶 I。用超纯水将终体积调至 200 µL，扣除步骤 3.2.1 中将使用的酶的体积。
    2. 8-oxodGuo 分析：取含有 80 µg DNA 的等分试样，加入 3.8 µL 200 mM Tris/MgCl2 缓冲液（pH 7.4）、2 µL 内标溶液（含 1,000 fmol/µL [15N5]8-oxodGuo）以及 8 单位脱氧核糖核酸酶 I。用超纯水将终体积调至 100 µL，扣除步骤 3.2.2 中将使用的酶的体积。
      ​注意：内标物 [15N5]1,N6-εdAdo、[15N5]1,N2-εdGuo 和 [15N5]8-oxodGuo 可按照文献35,36,37所述方法合成并表征。进样样品中内标的量应与校准曲线进样体积中的内标量相同。
  2. 将样品在 37 °C 下孵育 1 小时。
    1. 来自步骤 3.1 的样品：加入 0.006 单位来自 Crotalus atrox 的磷酸二酯酶 I 和 15 单位来自牛肠黏膜的碱性磷酸酶。
    2. 来自步骤 3.2 的样品：加入 0.0032 单位来自 Crotalus atrox 的磷酸二酯酶 I 和 8 单位来自牛肠黏膜的碱性磷酸酶。
  3. 将样品在 37 °C 下孵育 1 小时。
  4. 将样品在 14,000 x g 下离心 10 分钟。
  5. 来自步骤 3.2.1 的样品：取每份样品 10 µL 用于通过 HPLC/DAD（步骤 9）定量脱氧核苷（dAdo、dGuo）。将剩余体积用于固相萃取（步骤 4）。
  6. 来自步骤 3.2.2 的样品：将 80 µL 上清液转移至进样小瓶，用于 HPLC-ESI-MS/MS 系统进样 50 µL（含 1,000 fmol [15N5]8-oxodGuo）。保留剩余的 20 µL 用于通过 HPLC/DAD（步骤 9）定量 dGuo。

4. 1, N6-εdAdo 和 1, N2-εdGuo 分析的固相萃取

  1. 使用以下溶液序列依次对固相萃取柱（SPE-C18，30 mg/mL，33 µm，1 mL）进行上样：100% 甲醇、去离子水、水解后的DNA样品、去离子水、10% 甲醇、15% 甲醇和100% 甲醇（用于收集）。
    注意：在不同溶液之间操作时，不得让萃取柱完全干燥。前一种溶液完全进入柱体后，应立即加入下一种溶液。
  2. 将含有加合物的最后洗脱组分（100% 甲醇）进行真空干燥。
  3. 在进行HPLC-ESI-MS/MS分析前，立即用83.1 μL超纯水重悬干燥的样品，使每个样品中每50 µL含有200 fmol的各内标物。

5. 标准曲线的制备

  1. 在300至6,000 fmol的8-oxodGuo标准品范围内，制备至少五个点，每个点中加入固定量的1,000 fmol [15N5]8-oxodGuo。计算时应考虑注入体积中的实际含量。
  2. 在1至40 fmol的1,N6-εdAdo和1,N2-εdGuo范围内，制备至少五个点，每个点中加入固定量的200 fmol [15N5]1,N6-εdAdo和[15N5]1,N2-εdGuo。计算时应考虑注入体积中的实际含量。
  3. 在0.05至1 nmol的dGuo和dAdo范围内，制备至少五个点。计算时应考虑注入体积中的实际含量。

6. 方法验证用DNA样本的制备

  1. 1,N6-εdAdo 和 1,N2-εdGuo 分析：向 100 µg 小牛胸腺 DNA 中加入不同量的 1,N6-εdAdo 和 1,N2-εdGuo（例如 1.75、8.75、17.5 和 35 fmol）以及固定量的 [15N5]1,N6-εdAdo 和 [15N5]1,N2-εdGuo（350 fmol），然后按照步骤 3 所述进行酶解。在两天内分别对样品进行四次重复处理。使用这些样品评估方法的准确性和精密度。
    注意：DNA 酶解产物的最终体积为 200 µL（步骤 3），从中取 10 µL 用于 HPLC/DAD 法定量脱氧核苷（步骤 9）。剩余溶液（190 µL）进行固相萃取（步骤 4），干燥后的组分重悬于 83.1 µL 溶液中（步骤 4.3），从中取 50 µL 注入 HPLC-ESI-MS/MS 系统。进样时 1,N6-εdAdo 和 1,N2-εdGuo 的量分别为 1、5、10 和 20 fmol，每个样品中含有 200 fmol 的 [15N5]1,N6-εdAdo 和 [15N5]1,N2-εdGuo。
  2. 8-oxodGuo 分析：向 100 µg 小牛胸腺 DNA 中加入不同量的 8-oxodGuo（例如 734、1,468、2,938 和 4,408 fmol）以及固定量的 [15N5]8-oxodGuo（2,000 fmol），然后按照步骤 3 所述进行酶解。在两天内分别对样品进行四次重复处理。使用这些样品评估方法的准确性和精密度。
    注意：DNA 酶解产物的最终体积为 100 µL（步骤 3），从中取 50 µL 直接注入 HPLC-ESI-MS/MS 系统。进样时 8-oxodGuo 的量分别为 367、734、1,469 和 2,204 fmol，每个样品中含有 1,000 fmol 的 [15N5]8-oxodGuo。
  3. 向八份 100 µg 小牛胸腺 DNA 样品中分别加入 13.125 fmol 的 1,N6-εdAdo（使进样体积中含 7.5 fmol）和 35 fmol 的 1,N2-εdGuo（使进样体积中含 20 fmol）。
    1. 向其中四份样品中加入内标 [15N5]1,N6-εdAdo 和 [15N5]1,N2-εdGuo（各 200 fmol），然后对所有样品进行 DNA 酶解和固相萃取。
    2. 向另外四份样品中加入内标 [15N5]1,N6-εdAdo 和 [15N5]1,N2-εdGuo（各 200 fmol）。
    3. 使用这些样品计算加合物在固相萃取过程中的回收率。

7. 8-oxodGuo 的 HPLC-ESI-MS/MS 分析

  1. 将8-oxodGuo标准品注入仪器，设置电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）参数，通过多反应监测（MRM）模式优化其碎片图谱的检测条件： m/z 284 [M+H]+ → m/z 168 [M - 2'-脱氧核糖 + H]+.
    1. 使用相同的参数检测[15N58-oxodGuo m/z 289 [M+H]+m/z → 173 [M - 2'-脱氧核糖 + H]+.
      注意：请使用与本研究中所用设备相当或更优的设备（参见本研究中使用的设备） 材料列表）。ESI-MS/MS 参数设置如文中所述 表1.
  2. 过滤（使用 0.22 µm 多孔膜）并超声脱气所有基于水的高效液相色谱溶剂。
  3. 采用以下色谱条件进行分析，系统安装方式如图所示 图2.
    注意：色谱柱 A 连接到二元泵。其洗脱液在色谱运行的前 16 分钟以及 32 至 46 分钟期间被导向紫外检测器和废液，如图所示 图2A这是样品注入后立即进行洗脱的色谱柱。柱B连接等度泵和质谱仪。仅在16至32分钟区间内，当切换阀转至图示位置时，柱B才接收来自柱A的洗出液。 图2B阀门切换可实现两根色谱柱之间的连接，两根色谱柱由二元泵梯度进行洗脱。图中所示配置为 图2B 可实现进一步的峰分离和峰形变窄。此外，只有目标色谱组分进入质谱仪，从而提高检测的灵敏度和选择性。
    1. 洗脱一个50 x 2.0 mm内径的， 2.5 µm，C18色谱柱（A柱） 图2) 与C18保护柱（4.0 × 3.0 mm 内径）联用，采用含0.1%甲酸的水相（溶剂A）和含0.1%甲酸的甲醇（溶剂B）进行梯度洗脱，流速为 150 µL/min 和 25 °C.
      1. 使用以下二元泵梯度程序：0 至 25 分钟，0 - 15% 溶剂 B；25 至 28 分钟，15 - 80% 溶剂 B；28 至 31 分钟，80% 溶剂 B；31 至 33 分钟，80 - 0% 溶剂 B；33 至 46 分钟，0% 溶剂 B。
      2. 使用切换阀将前16分钟的洗脱液导入废液，将16至32分钟的组分导入第二根色谱柱（150 x 2.0 mm 内径， 3.0 µm，C18，B柱 图2) 连接到电喷雾离子源（ESI），并通过等度泵以含有 0.1% 甲酸的 15% 甲醇水溶液进行调节150 µL/min).
        注意：在使用步骤 7.3.1.2 的切换阀程序之前，需确认 8-oxodGuo 标准品是否在 16 分钟后从第一根色谱柱洗脱。在 32 分钟时关闭阀门至关重要，以便利用二元泵的梯度将 8-oxodGuo 从第二根色谱柱中洗脱，从而获得尖锐的色谱峰。损伤产物 8-oxodGuo 从第二根色谱柱的洗脱时间约为 36 分钟。分析物的保留时间可能因所用色谱柱和设备的不同而有所变化。必要时需对高效液相色谱（HPLC）的溶剂梯度程序进行调整。

用于化合物分析的HPLC装置示意图，配备API 4000 QTrap和等度/二元泵。
图2. 用于8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）分析的双柱系统。A) 色谱过程前16分钟及32至46分钟期间使用的配置；B) 16至32分钟区间内使用的配置，可在洗脱至质谱仪电喷雾电离（ESI）源之前，使组分在B柱中进一步分离并实现峰形变窄。该图已重印自Oliveira等人的研究34。请点击此处查看此图的放大版本。

8. 1, N 6 -εdAdo 和 1, N 2 -εdGuo 的 HPLC-ESI-MS/MS 分析

  1. 注入1,N6-εdAdo 和 1,N2- 将εdGuo标准品加入仪器，设置电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）参数，以通过多反应监测（MRM）模式最佳检测其碎片化图谱： m/z 276 [M+H]+ → m/z 160 [M 2'-脱氧核糖 + H]+ 用于检测1，N6-εdAdo 和 m/z 292 [M+H]+ → m/z 176 [M - 2'-脱氧核糖 + H]+ 用于检测1，N2-εdGuo
    1. 使用相同的参数检测[15N5]1,N6-εdAdo（m/z 281 [M+H]+ m/z → 165 [M - 2'-脱氧核糖 + H]+）和[15N5]1,N2-εdGuom/z 297 [M+H]+ → m/z 181 [M - 2'-脱氧核糖 + H]+）。按照所述设置 ESI-MS/MS 参数 表1.
ESI-MS/MS 参数8-oxodGuo乙烯加合物
帘气20 psi20 psi
雾化气体5550
离子源气体50 psi40 psi
碰撞诱导解离气体中等中等
电喷雾电压50004500
ESI 探针温度450450
去簇电位31 V, 8-oxodGuo41 V, 1,N6-εdAdo
31 V, [15N5]8-oxodGuo41 V, [15N5]1,N6-εdAdo
45 V, 1,N2-εdGuo
45V, [15N5]1,N2-εdGuo
碰撞能量23 eV, 8-oxodGuo25 eV, 1,N6-εdAdo
23 eV, [15N5]8-oxodGuo25 eV, [15N5]1,N6-εdAdo
27 eV, 1,N2-εdGuo
27 eV, [15N5]1,N2-εdGuo
碰撞池出口电位16 V, 8-oxodGuo,8 V, 1,N6-εdAdo
16 V, [15N5]8-oxodGuo8 V, [15N5]1,N6-εdAdo
16 V, 1,N2-εdGuo
16 V, [15N5]1,N2-εdGuo
入口电位10 V10 V

表1. 用于检测DNA损伤的ESI-MS/MS仪器参数。 本表格经Oliveira等34修改。

  1. 使用 0.22 µm 孔径的滤膜过滤所有基于水的 HPLC 溶剂，并使用超声波仪脱气。
  2. 采用以下色谱条件进行分析。
    1. 采用 150 x 2.0 mm 内径、3.0 µm 粒径的 C18 色谱柱，连接一个 C18 保护柱（4.0 x 3.0 mm 内径），以 5 mM 乙酸铵（pH 6.6，溶剂 A）和乙腈（溶剂 B）进行梯度洗脱，流速为 130 µL/min，柱温为 25 °C。
      1. 二元泵的梯度程序如下：0 至 10 分钟，0% 溶剂 B；10 至 39 分钟，0 至 20% 溶剂 B；39 至 41 分钟，20 至 75% 溶剂 B；41 至 46 分钟，75% 溶剂 B；46 至 47 分钟，75 至 0% 溶剂 B；47 至 60 分钟，0% 溶剂 B。
      2. 使用切换阀将前 35 分钟的洗脱液导入废液，将 35 至 42 分钟的组分导入 ESI 源。确保加合物标准品在设定的时间区间（35 至 42 分钟）内从色谱柱中洗脱出来。如有必要，进行相应调整。

9. 采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）定量正常2'-脱氧核糖核苷

  1. 使用与本研究中所用设备类似的仪器（参见材料表）。
  2. 采用0.1%甲酸与甲醇的梯度洗脱，对连接有C18保护柱（4.0 × 3.0 mm内径）的250 mm × 4.6 mm内径、5 µm、C18色谱柱进行洗脱。
    1. 使用以下梯度程序：0至25分钟，甲醇浓度从0升至18%；25至27分钟，甲醇浓度从18%降至0%；27至37分钟，保持0%甲醇；流速为1 mL/min，柱温30 °C。
    2. 进样5 µL用于2'-脱氧核苷定量的各样品。
    3. 将DAD检测器设定在260 nm，用于dGuo和dAdo峰的积分。

10. DNA损伤的定量分析

  1. 从HPLC-ESI-MS/MS分析中积分8-oxodGuo、[15N5]8-oxodGuo、1,N6-εdAdo、[15N5]1,N6-εdAdo、1,N2-εdGuo和[15N5]1,N2-εdGuo的峰。
    1. 计算校准曲线和样品中8-oxodGuo/[15N5]8-oxodGuo、1,N6-εdAdo/[15N5]1,N6-εdAdo以及1,N2-εdGuo/[15N5]1,N2-εdGuo的峰面积比值。
    2. 以第10.1.1步获得的面积比值作为y轴，各点中分析物的含量作为x轴，绘制校准曲线。
    3. 利用第10.1.1步计算的比值和第10.1.2步得到的校准曲线，计算每个进样样品中损伤产物的含量（fmol）。
  2. 从HPLC-UV分析中积分dGuo和dAdo的峰。
    1. 以第10.2步获得的峰面积作为y轴，各点中分析物的含量作为x轴，绘制校准曲线。
    2. 利用第10.2步获得的峰面积和第10.2.1步的校准曲线，计算每个进样样品中dGuo和dAdo的含量（nmol）。
  3. 计算注入HPLC-ESI-MS/MS系统的每个样品中dGuo和dAdo的含量（nmol），注意第10.2.2步计算出的含量对应的是5 µL样品体积，而实际注入HPLC-ESI-MS/MS系统的体积为50 µL。
    注：为计算用于8-oxodGuo分析的样品中dGuo的含量，只需将第10.2.2步获得的含量（nmol/µL）乘以50。为计算用于1,N6-εdAdo和1,N2-εdGuo分析的样品中dAdo和dGuo的含量，需考虑固相萃取后的浓缩步骤。注入HPLC-ESI-MS/MS系统的50 µL样品相当于原始样品的114.32 µL。因此，第10.2.2步获得的含量（nmol/µL）应乘以114.32，以获得正确数值。
  4. 计算摩尔分数8-oxodGuo/dGuo、1,N6-εdAdo/dAdo、1,N2-εdGuo/dGuo。该比值（fmol损伤产物/nmol正常脱氧核苷）表示每106个正常dGuo或dAdo中的损伤数量。

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结果

从小鼠肝脏（约 1 g 组织）、肺脏（约 0.2 g 组织）和肾脏（约 0.4 g 组织）中提取的 DNA 平均浓度（± 标准差）分别为 5,068 ± 2,615、4,369 ± 1,021 和 3,223 ± 723 µg/mL，最终体积为 200 µL。通过高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）分析纯化后的 DNA 所得的代表性色谱图见图 3。色谱图中显示出四种 2'-脱氧核苷，且未检测到在相应 2'-脱氧核苷之前洗脱的 RNA 核糖核苷，表明所提取 DNA 纯度较高。

用于8-oxodGuo定量分析的HPLC-ESI-MS/MS代表性色谱图, 1,N6-εdAdo 和 1,N2小鼠组织DNA样本中的-εdGuo如图所示 图4至图6. 采用紫外检测获得的色谱图 <...

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讨论

一个常见的主要问题 在采用HPLC方法进行8-oxodGuo分析时，一个主要问题是DNA提取、DNA水解及DNA水解物浓缩等前处理过程中可能诱导其形成22,38为尽量减少8-oxodGuo人为形成的问题，建议在所有DNA提取、储存和水解溶液中添加去铁胺，采用碘化钠变性法提取DNA并避免使用苯酚，同时在水解过程中使用接近100 µg的DNA量，以最大限度降低虚假氧化对最终结果的干扰。39我们考虑了上述引用的建议，但未采用碘化钠变性法提取DNA。为简便起见，我们使用了市售的DNA提取试剂溶液，并在使用前向其中添加去铁胺。此外，将获得的DNA水解产物直接注入HPLC-ESI-MS/MS系统的首根色谱柱，以实现8-oxodGuo与正常核苷的初步分离。在8-oxodGuo洗脱前，通过切换阀将第一根色谱柱的洗脱液转移至第二根色谱柱，以实现进一步分离并缩小峰宽。该方法使8-oxodGuo的定量具有足够的灵敏度，且不受干扰物影响。迄今为止，最相似的DNA中8-oxodGuo定量方...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

圣保罗州研究资助基金会（FAPESP，项目编号：2012/22190-3 和 2012/08616-8）、国家科学技术发展委员会（CNPq，项目编号：454214/2014-6 和 429184/2016-6）、高等教育人员提升协调办公室（CAPES）、圣保罗大学研究副校长办公室（PRPUSP）、国家科学和技术研究所 INAIRA（INCT INAIRA，MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP；项目编号：573813/2008-6）、国家科学和技术研究所 Redoxoma（INCT Redoxoma，FAPESP/CNPq/CAPES；项目编号：573530/2008-4）、Redoxoma 多学科研究计划（NAP Redoxoma，PRPUSP；项目编号：2011.1.9352.1.8）以及 Redoxoma 研究中心（CEPID Redoxoma，FAPESP；项目编号：2013/07937-8）。T. F. Oliveira 和 A. A. F. Oliveira 获得了 FAPESP（项目编号：2012/21636-8、2011/09891-0、2012/08617-4）和 CAPES（高等教育人员提升协调办公室）的奖学金资助。M. H. G. Medeiros、P. Di Mascio、P. H. N. Saldiva 和 A. P. M. Loureiro 获得了 CNPq 的研究员资助。

本文中的一些图和表最初发表于 Oliveira A.A.F. 等人的研究：暴露于巴西圣保罗市浓缩环境细颗粒物（PM2.5）的小鼠的遗传毒性和表观遗传毒性效应。Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018)。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
[15N5]-2’-脱氧腺苷剑桥同位素实验室NLM-3895-25
[15N5]-2’-脱氧鸟苷剑桥同位素实验室NLM-3899-CA-10
乙腈Carlo Erba 试剂412413000
牛肠黏膜碱性磷酸酶SigmaP5521
乙酸铵默克101116
小牛胸腺DNASigmaD1501
细胞裂解液QIAGEN158908
氯仿Carlo Erba 试剂412653
去铁胺SigmaD9533
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)Bio Basic IncDD0649
乙醇Carlo Erba 试剂414542
甲酸Sigma-AldrichF0507
HPLC-ESI-MS/MS 系统高效液相色谱：Agilent 1200 系列            ESI-MS/MS：Applied Biosystems/MDS Sciex 仪器高效液相色谱仪：双元泵（G1312B）、等度泵（G1310A）、带柱切换阀的柱温箱（G1316B）、二极管阵列检测器（G1315C）、自动进样器（G1367C）。                                                            ESI-MS/MS：线性四极杆离子阱质谱仪，型号 4000 QTRAP。
HPLC/DAD 系统岛津两台泵（LC-20AT）、光电二极管阵列检测器（DAD-20AV）、自动进样器（Proeminence SIL-20AC）、柱温箱（CTO-10AS/VP）
HPLC色谱柱（50 × 2.0 mm 内径，2.5 µm，C18Phenomenex00B-4446-B0
HPLC色谱柱（150 × 2.0 mm 内径，3.0 µm，C18Phenomenex00F-4251-B0
高效液相色谱柱（250 × 4.6 mm 内径，5.0 µm，C18Phenomenex00G-4252-E0
HPLC C18 保护柱（4.0 × 3.0 mm 内径）PhenomenexAJO-4287
异戊醇Sigma-AldrichM32658
异丙醇（异丙醇）Carlo Erba 试剂A412790010
氯胺酮Ceva商品名：Dopalen
氯化镁Carlo Erba 试剂349377
氯化镁SigmaM2393
甲醇Carlo Erba 试剂L022909K7
来自磷酸二酯酶 I Crotalus atroxSigmaP4506
蛋白沉淀溶液QIAGEN158912
蛋白酶KSigma-AldrichP2308
核糖核酸酶ASigmaR5000
氯化钠Sigma-AldrichS9625
SPE-C18（Strata-X）Phenomenex8B-S100-TAK
三(羟甲基)氨基甲烷Carlo Erba 试剂489983
赛拉嗪Syntec 巴西商品名：Xilazin

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通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估
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