蛋白质结合微阵列(PBM)实验结合生化分析,可关联DNA引物酶(一种在模板DNA上合成RNA引物的酶)的结合特性与催化特性。该方法被称为高通量引物酶分析(HTPP),可用于揭示多种酶的DNA结合模式。
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蛋白质结合微阵列(PBM)实验结合生化分析,可关联DNA引物酶(一种在模板DNA上合成RNA引物的酶)的结合特性与催化特性。该方法被称为高通量引物酶分析(HTPP),可用于揭示多种酶的DNA结合模式。
DNA引发酶合成短RNA引物,以启动DNA聚合酶在DNA复制过程中对滞后链上冈崎片段的DNA合成。原核生物DnaG样引发酶与DNA的结合发生在特定的三核苷酸识别序列处,这是冈崎片段形成的关键步骤。传统用于确定DNA引发酶DNA识别序列的生物化学工具所提供的信息十分有限。通过采用高通量微阵列结合的结合实验及后续一系列生物化学分析表明:1)特定的结合环境(识别位点侧翼序列)会影响DNA引发酶与其模板DNA的结合强度;2)引发酶与DNA结合越强,产生的RNA引物越长,表明该酶具有更高的持续合成能力。该方法结合了PBM与引发酶活性检测,被称为高通量引发酶谱型分析(HTPP),能够在前所未有的时间效率和可扩展性下实现对DNA引发酶特异性序列识别的表征。
HTPP 利用 DNA 结合微阵列技术结合生化分析(图 1),可统计学识别影响 DNA 引物酶酶活性的 DNA 模板特定特征。因此,HTPP 提供了一个技术平台,有助于推动该领域的知识飞跃。用于确定引物酶识别位点的经典工具无法获得大量数据,而 HTPP 能够实现这一目标。
PBM 是一种常规用于确定转录因子与 DNA 结合偏好的技术1,2;然而,该方法不适用于检测蛋白质与 DNA 之间弱结合或瞬时结合。与提供所有可能八碱基对序列中蛋白质平均结合特异性的通用 PBM 不同,HTPP 基于包含独特序列元件的单链 DNA 模板文库。这些 DNA 序列元件包括数万个较短(数十个碱基对)的基因组序列,以及通过计算设计、富含基因组中特定重复 DNA 序列元件的 DNA 序列,这些序列具有不同的平均 GC 含量。这种高通量方法能够以系统性、定量且基于假设的方式,确定对引物酶结合及其酶活性重要的序列相关特性3。特别是,针对该酶系统,已发现引物酶-DNA 结合偏好性(受特定三核苷酸结合位点侧翼 DNA 序列调控)与引物酶持续合成能力之间存在重要关联4。
即使对于已被广泛研究的T7 DNA引物酶,该新技术也被应用于重新审视我们对引物酶识别位点的理解5。具体而言,利用蛋白质-DNA结合微阵列(PBM)重新检验一些经典概念,例如T7 DNA引物酶的DNA识别位点(这些位点在近四十年前被确定6),从而前所未有地揭示了这些识别位点侧翼序列特征的相关信息3。人们原本预期T7 DNA引物酶三核苷酸识别位点(5'-GTC-3')的侧翼序列是随机的。然而,我们发现富含TG的侧翼序列会增加T7 DNA引物酶合成较长RNA引物的可能性,表明其持续合成能力有所提高。
可用于体外研究蛋白质DNA结合特性的其他方法包括电泳迁移率变动分析(EMSA)7、DNase I 足迹法8、表面等离子共振(SPR)9以及西南印迹法10。然而,这些方法通量较低,仅适用于分析少量DNA序列。此外,其中一些技术(例如EMSA)的精确度和灵敏度较低。另一方面,体外筛选11是一种与PBM类似的技术,可用于鉴定大量结合序列。但在大多数体外筛选应用中,低亲和力序列通常会被排除,因此该方法不适合获取所有可用序列的比较性结合数据。通用PBM1,2主要用于表征原核生物和真核生物转录因子的结合特异性,以及可能影响这种相互作用的特定因素(例如某些配体、辅因子等)12。
HTPP 将 PBM 技术的应用扩展到 DNA 处理酶领域,通过结合前所未有的高通量统计能力与高精度,提供有关结合序列背景的信息。由于前述其他现有技术的技术局限性,目前尚未获得引发酶及相关酶(这些酶与 DNA 的结合较弱或具有瞬时性)的此类数据。
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1. 芯片设计
注意:DNA 探针代表定制的 36 核苷酸序列,其包含位于两个可变侧翼区域之间的 T7 DNA 引物酶识别位点(GTC),后接一段固定的 24 核苷酸序列,该序列连接于玻璃载片上3。我们采用 4 × 180,000 微阵列格式,可在载片上随机分布地每个 DNA 序列点样六次重复。
2. 引物酶DNA结合实验
注意:在光生物调节治疗(PBM)前一天(或至少提前2小时)配制封闭液[磷酸盐缓冲液(PBS)中含2% w/v脱脂奶粉],并在磁力搅拌器上搅拌。使用前,用0.45 µM滤膜过滤该溶液。为检测引物酶与DNA链的结合,需按以下顺序执行多个步骤。
3. 芯片数据分析
注意:所有数据处理均使用 MATLAB 中编写的自定义脚本完成。
4. T7 DNA 引物酶催化的模板指导RNA合成
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这一用于绘制引物酶结合位点的技术进步,使得研究人员能够获得利用传统工具难以甚至无法观察到的DNA结合特性。更重要的是,HTPP技术促使人们重新审视对引物酶结合位点的传统认知。具体而言,HTPP揭示了除已知的5'-GTC-3'识别序列之外的结合特异性,从而导致T7 DNA引物酶功能活性的变化。即,研究鉴定了两类序列:一类是侧翼含有T/G的强结合DNA序列,另一类是侧翼含有A/G的弱结合序列(所有强结合模板中的胸腺嘧啶均被腺嘌呤取代)。未检测到引物酶与序列中缺乏5'-GTC-3'的DNA模板发生结合。
含有特定特征(如富含T/G的侧翼序列)的引物酶DNA识别位点可使引物酶与DNA的结合能力提高达10倍,并且出人意料地还增加了新合成RNA引物的长度(最多达3倍)(见先前发表文章中的图23)。重要的是,高通量引物分析技术(HTPP)使我们能够观察并量化...
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PBM 方法已广泛用于研究转录因子的结合特性,也可应用于与 DNA 亲和力较低的 DNA 加工酶(如 DNA 引物酶)。然而,需要对实验步骤进行某些修改。微阵列实验包含多个步骤:DNA 文库的设计、芯片的制备、靶蛋白的结合、荧光标记以及扫描。洗涤步骤需温和进行,因为使用含去污剂溶液的长时间洗涤会导致蛋白因结合较弱或瞬时性而从 DNA 模板上解离。其他关键步骤包括结合条件(如缓冲液组成、辅因子)和孵育时间,这些参数需针对每种特定酶进行优化。
微阵列实验获得的结果需要通过生化实验进行验证。生化实验还能揭示DNA加工酶的一些有趣特性,例如DNA结合亲和力与酶活性/持续性之间的相关性。高通量引物分析(HTPP)使我们能够观察DNA结合对T7 DNA引物酶功能特性的影响。例如,已有研究发现,如果引物酶对DNA模板具有更高的结合亲和力,则其催化的RNA引物长度更长(持续性增强)。
总体而言,本文介绍的方法快速、可靠,能够以假设驱动的方式,在单次实验中同时检测数万个不同DNA序列的结合特性。向反应体系中添加其他蛋白质或金属辅因子,可快速、高...
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作者声明无利益冲突。
本研究由以色列科学基金会(资助号:1023/18)资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺(19:1)溶液 | Merck | 1006401000 | |
| 95% 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488 标记的抗 His 抗体 | Qiagen | 35310 | |
| 过硫酸铵(APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| 硼酸,颗粒状 | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| 牛血清白蛋白(BSA) | Roche | 10735094001 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| 柯普林染色缸(Coplin jar) | |||
| 二硫苏糖醇(DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA 微阵列 | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com | |
| 乙二胺四乙酸(EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 磷光成像仪 | FUJIFILM Life Science | ||
| 玻璃载片染色架 | Thermo Scientific | 12869995 | 若使用多个载片 |
| 实验室旋转摇床(Lab rotator) | Thermo Scientific | 88880025 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| 微阵列杂交室(Microarray Hybridization Chamber) | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| 微阵列扫描仪(GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| 磷酸盐缓冲液(PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| 谷氨酸钾 | Alfa Aesar | A172232 | |
| 核糖核苷酸溶液混合物(rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| 鲑鱼精 DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| 脱脂奶粉 | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| 染色皿(Staining dish) | Thermo Scientific | 12657696 | |
| 四甲基乙二胺(TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris 碱(2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| 吐温 X-100(Triton X-100) | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| 吐温-20(Tween-20) | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| 二甲苯青 | Alfa Aesar | B21530 |
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