利用高通量引物酶谱分析技术研究DNA引物酶对DNA序列的识别

摘要

蛋白质结合微阵列（PBM）实验结合生化分析，可关联DNA引物酶（一种在模板DNA上合成RNA引物的酶）的结合特性与催化特性。该方法被称为高通量引物酶分析（HTPP），可用于揭示多种酶的DNA结合模式。

摘要

DNA引发酶合成短RNA引物，以启动DNA聚合酶在DNA复制过程中对滞后链上冈崎片段的DNA合成。原核生物DnaG样引发酶与DNA的结合发生在特定的三核苷酸识别序列处，这是冈崎片段形成的关键步骤。传统用于确定DNA引发酶DNA识别序列的生物化学工具所提供的信息十分有限。通过采用高通量微阵列结合的结合实验及后续一系列生物化学分析表明：1）特定的结合环境（识别位点侧翼序列）会影响DNA引发酶与其模板DNA的结合强度；2）引发酶与DNA结合越强，产生的RNA引物越长，表明该酶具有更高的持续合成能力。该方法结合了PBM与引发酶活性检测，被称为高通量引发酶谱型分析（HTPP），能够在前所未有的时间效率和可扩展性下实现对DNA引发酶特异性序列识别的表征。 

引言

HTPP 利用 DNA 结合微阵列技术结合生化分析（图 1），可统计学识别影响 DNA 引物酶酶活性的 DNA 模板特定特征。因此，HTPP 提供了一个技术平台，有助于推动该领域的知识飞跃。用于确定引物酶识别位点的经典工具无法获得大量数据，而 HTPP 能够实现这一目标。

PBM 是一种常规用于确定转录因子与 DNA 结合偏好的技术^1,2；然而，该方法不适用于检测蛋白质与 DNA 之间弱结合或瞬时结合。与提供所有可能八碱基对序列中蛋白质平均结合特异性的通用 PBM 不同，HTPP 基于包含独特序列元件的单链 DNA 模板文库。这些 DNA 序列元件包括数万个较短（数十个碱基对）的基因组序列，以及通过计算设计、富含基因组中特定重复 DNA 序列元件的 DNA 序列，这些序列具有不同的平均 GC 含量。这种高通量方法能够以系统性、定量且基于假设的方式，确定对引物酶结合及其酶活性重要的序列相关特性³。特别是，针对该酶系统，已发现引物酶-DNA 结合偏好性（受特定三核苷酸结合位点侧翼 DNA 序列调控）与引物酶持续合成能力之间存在重要关联⁴。

即使对于已被广泛....

方案

1. 芯片设计

注意：DNA 探针代表定制的 36 核苷酸序列，其包含位于两个可变侧翼区域之间的 T7 DNA 引物酶识别位点（GTC），后接一段固定的 24 核苷酸序列，该序列连接于玻璃载片上³。我们采用 4 × 180,000 微阵列格式，可在载片上随机分布地每个 DNA 序列点样六次重复。

1. 已知识别序列的引物酶DNA文库设计
   1. 确保每条序列由60个核苷酸组成。前24个核苷酸保持恒定（用于连接至玻片）。可变区域应具有如下通用结构：(N)₁₆GTC(N)₁₇；其中N代表任意所需的核苷酸。
   2. 设计侧翼区域以解决特定科学问题（后续文本中提供了设计示例）。侧翼区域可被设计为包含特定特征，例如重复元件或特定对称性。
      注：我们创建了八类不同的侧翼序列，每类由两种或三种特定核苷酸组成：T和G（第1组）；T和C（第2组）；C和A（第3组）；A和G（第4组）；G、C和T（第5组）；C、T和A（第6组）；G、A和T（第7组）；G、A和C（第8组）。每组设计了2,000条不同的序列。每组包含具有不同类型和不同数量序列重复的子组。
   3. 包含一组阴性对照序列（缺乏特异性结合位点）⁴。此类序列的存在可用于验证实验中特异性结合的发生....

结果

这一用于绘制引物酶结合位点的技术进步，使得研究人员能够获得利用传统工具难以甚至无法观察到的DNA结合特性。更重要的是，HTPP技术促使人们重新审视对引物酶结合位点的传统认知。具体而言，HTPP揭示了除已知的5'-GTC-3'识别序列之外的结合特异性，从而导致T7 DNA引物酶功能活性的变化。即，研究鉴定了两类序列：一类是侧翼含有T/G的强结合DNA序列，另一类是侧翼含有A/G的弱结合序列（所有强结合模板中的胸腺嘧啶均被腺嘌呤取代）。未检测到引物酶与序列中缺乏5'-GTC-3'的DNA模板发生结合。

含有特定特征（如富含T/G的侧翼序列）的引物酶DNA识别位点可使引物酶与DNA的结合能力提高达10倍，并且出人意料地还增加了新合成RNA引物的长度（最多达3倍）（见先前发表文章中的图2³）。重要的是，高通量引物分析技术（HTPP）使我们能够观察并量化.......

讨论

PBM 方法已广泛用于研究转录因子的结合特性，也可应用于与 DNA 亲和力较低的 DNA 加工酶（如 DNA 引物酶）。然而，需要对实验步骤进行某些修改。微阵列实验包含多个步骤：DNA 文库的设计、芯片的制备、靶蛋白的结合、荧光标记以及扫描。洗涤步骤需温和进行，因为使用含去污剂溶液的长时间洗涤会导致蛋白因结合较弱或瞬时性而从 DNA 模板上解离。其他关键步骤包括结合条件（如缓冲液组成、辅因子）和孵育时间，这些参数需针对每种特定酶进行优化。

微阵列实验获得的结果需要通过生化实验进行验证。生化实验还能揭示DNA加工酶的一些有趣特性，例如DNA结合亲和力与酶活性/持续性之间的相关性。高通量引物分析（HTPP）使我们能够观察DNA结合对T7 DNA引物酶功能特性的影响。例如，已有研究发现，如果引物酶对DNA模板具有更高的结合亲和力，则其催化的RNA引物长度更长（持续性增强）。

总体而言，本文介绍的方法快速、可靠，能够以假设驱动的方式，在单次实验中同时检测数万个不同DNA序列的结合特性。向反应体系中添加其他蛋白质或金属辅因子，可快速、高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺（19:1）溶液	Merck	1006401000
95% 甲酰胺	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488 标记的抗 His 抗体	Qiagen	35310
过硫酸铵（APS）	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
硼酸，颗粒状	Glentham Life Sciences	GE4425
牛血清白蛋白（BSA）	Roche	10735094001
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126-25G
柯普林染色缸（Coplin jar）
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA 微阵列	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
乙二胺四乙酸（EDTA）	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 磷光成像仪	FUJIFILM Life Science
玻璃载片染色架	Thermo Scientific	12869995	若使用多个载片
实验室旋转摇床（Lab rotator）	Thermo Scientific	88880025
氯化镁	Sigma-Aldrich	63064-500G
微阵列杂交室（Microarray Hybridization Chamber）	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
微阵列扫描仪（GenePix 4400A）	Molecular Devices
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
谷氨酸钾	Alfa Aesar	A172232
核糖核苷酸溶液混合物（rNTPs）	New England BioLabs	N0466S
鲑鱼精 DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
脱脂奶粉	Sigma-Aldrich	70166-500G
染色皿（Staining dish）	Thermo Scientific	12657696
四甲基乙二胺（TEMED）	Bio-Rad	1610800
Tris 碱（2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇）	Sigma-Aldrich	93362-500G
吐温 X-100（Triton X-100）	Sigma-Aldrich	X100-500ML
吐温-20（Tween-20）	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
尿素	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
二甲苯青	Alfa Aesar	B21530