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线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

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DOI：

10.3791/59750

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2019年7月20日

 , 
1Neural Circuits Research Group, Korea Brain Research Institute

本文内容

摘要

我们提出了一种研究线粒体和内质网在基因改造后于全细胞中分布的方案，该方案结合了相关光镜与三维电子显微镜技术，包括抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色、在同一切片中对含有或不含目标基因的细胞进行连续切片，以及通过电子显微镜进行连续成像。

摘要

线粒体和内质网（ER）等细胞器可形成网络以执行多种功能。这些高度弯曲的结构会折叠成各种形态，根据细胞状态形成动态网络。已有研究尝试利用超分辨率荧光成像和光学显微镜对线粒体与内质网之间的网络进行可视化观察；然而，受限于分辨率，难以详细观察线粒体与内质网之间的膜结构。透射电子显微镜可提供良好的膜对比度和纳米级分辨率，适用于细胞器的观察；但在评估高度弯曲细胞器的三维（3D）结构时，该方法极为耗时。因此，我们采用增强型抗坏血酸过氧化物酶2和辣根过氧化物酶染色，结合相关光电子显微镜（CLEM）和体积电子显微镜技术，观察线粒体和内质网的形态。通过原位染色法、超薄连续切片（阵列断层成像）及体积电子显微镜技术，实现对三维结构的观察。本方案建议将CLEM与三维电子显微镜技术相结合，以开展对线粒体和内质网的精细结构研究。

引言

线粒体和内质网（ER）是具有膜结构的细胞器。它们之间的连接对其功能至关重要，已有研究描述了与它们网络相关的蛋白质1。通过光学显微镜观察，线粒体与内质网之间的距离约为100 nm2；然而，近期的超分辨率显微镜3和电子显微镜（EM）4研究表明，该距离实际上要小得多，约为10–25 nm。超分辨率显微镜的分辨率仍低于电子显微镜，且需要进行特异性标记。电子显微镜是一种适用于获得足够高分辨率对比度的技术，可用于研究线粒体与内质网之间连接的结构。然而，其缺点在于z轴信息有限，因为传统透射电子显微镜（TEM）所需的超薄切片必须约为60 nm或更薄。为了实现充分的电子显微镜z轴成像，可采用三维电子显微镜（3DEM）技术5。但这需要制备数百个完整细胞的连续超薄切片，是一项极为复杂的工作，仅有少数技术熟练的人员能够掌握。这些超薄切片通常收集在涂有脆弱甲醛膜的一孔TEM载网上。如果某一载网上的膜破裂，则无法进行连续成像和体积重建。连续块面扫描电子显微镜（SBEM）是一种常用的3DEM技术，它在扫描电子显微镜（SEM）真空腔内通过金刚石刀（Dik-SBEM）或聚焦离子束（FIB-SEM）对样品块进行破坏性连续切片6。然而，由于这些技术并非在所有实验场所都具备，我们建议采用基于连续切片和扫描电子显微镜的阵列断层成像技术（array tomography）7。在阵列断层成像中，使用超薄切片机切割的连续切片被转移至玻璃盖玻片而非TEM载网上，并通过光学显微镜和扫描电子显微镜进行观察8。为了增强背散射电子（BSE）成像的信号，我们采用了一种整体染色电镜染色方案，即使用四氧化锇（OsO4）固定细胞并结合嗜锇性硫代碳酰肼（TCH）9，从而使我们能够在无需包埋后双重染色的情况下获得图像。

此外，使用线粒体标记物 SCO1（细胞色素 c 氧化酶组装蛋白 1）–抗坏血酸过氧化物酶 2（APEX2）10 分子标签在电镜水平下可视化线粒体。APEX2 分子量约为 28 kDa，来源于大豆抗坏血酸过氧化物酶11。该标签的开发旨在以类似于绿色荧光蛋白标记蛋白在光学显微镜中应用的方式，展示特定蛋白在电镜水平下的精确定位。APEX2 在辅因子过氧化氢（H2O2）存在的情况下，可将 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）转化为不溶性嗜锇聚合物，该反应发生在标签所在位点。APEX2 可作为传统抗体标记在电镜中的替代方法，实现蛋白在整个细胞深度范围内的定位。换言之，APEX2 标记的蛋白可在超低温切片后，无需免疫金标记和透化处理，通过特异性锇化11直接可视化。辣根过氧化物酶（HRP）也是一种敏感的标签，可催化 H2O2 依赖的 DAB 聚合反应，形成局部沉淀物，在经 OsO4 处理后提供电镜对比度。内质网靶向肽序列 HRP-KDEL（lys-asp-glu-leu）12 被用于在完整细胞内可视化内质网。为了评估我们结合遗传标签与还原锇和硫代碳酰肼（rOTO 法）进行整体染色的方案，同时利用其锇化效应，我们比较了在 rOTO 整体染色中使用与不使用每种遗传标签时的膜对比度。 尽管阵列断层成像结合三维电镜（3DEM）以及 APEX 和 HRP 介导的 DAB 染色已分别被用于其他研究目的，但我们的方案具有独特性，因为我们整合了用于 3DEM 的阵列断层成像技术与用于线粒体和内质网标记的 DAB 染色。具体而言，我们在同一切片中展示了五个带有和不带有 APEX 标记基因的细胞，有助于研究基因修饰对细胞的影响。

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方案

1. 使用带有图案化网格的培养皿进行细胞培养，以及使用 SCO1-APEX2 和 HRP-KDEL 质粒载体进行细胞转染

  1. 在37 °C、含5% CO2的湿润环境中，将1 × 105个HEK293T细胞接种至35 mm玻璃网格底培养皿中，培养基为添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
  2. 接种细胞后的第二天，当细胞生长至50%–60%融合度时，按照制造商说明书，使用转染试剂将SCO1-APEX210和HRP-KDEL12质粒导入细胞（每3 µL转染试剂加入SCO1-APEX2 cDNA 0.5 µg + HRP-KDEL质粒DNA 0.5 µg）。

2. 在图案化培养皿上生长的细胞的光学显微镜观察以及针对 APEX2 和 HRP 的 DAB 染色

  1. 转染后16-24小时，吸除全部培养基，立即通过轻柔吹打加入250 µL预热（30-37 °C）的固定液（表1）。随即吸除固定液，并替换为1.5 mL新鲜固定液。冰上孵育60分钟，然后用1 mL冰冻的0.1 M卡考基酸钠缓冲液（表1）洗涤三次，每次10分钟。
    注意：醛类蒸气具有极高毒性。所有操作均须在通风良好的通风橱内进行。
  2. 加入1 mL冷（0-4 °C）的20 mM甘氨酸溶液，冰上孵育10分钟，随后用1 mL冷的0.1 M卡考基酸钠缓冲液洗涤三次，每次5分钟。
  3. 配制新鲜的1x DAB溶液（3.33 mL 0.3 M卡考基酸钠溶液 + 10 µL 30% H2O2 + 5.67 mL冷蒸馏水 + 1 mL 10x DAB溶液）。
  4. 加入500 µL新配制的1x DAB溶液（步骤2.3），冰上孵育约5-45分钟，直至在倒置光学显微镜下可见浅棕色染色（图1A）。
  5. 轻柔吸除DAB溶液，用1 mL冷的0.1 M卡考基酸钠缓冲液冲洗三次，每次10分钟。
  6. 使用相差倒置显微镜（或明场光学显微镜）在100倍或更高放大倍数下观察DAB染色情况。使用记号笔在玻璃底部标记出感兴趣区域（ROI）的位置（图1B,C）。

3. 电镜包埋样品的制备

  1. 按照步骤 2.1-2.6 所述进行细胞培养和 DAB 染色。
  2. 在 4 °C 条件下，用 1 mL 2% 还原性 OsO4 对样品后固定 1 小时。
    注意：OsO4 蒸气具有高毒性。所有操作均应在通风良好的通风橱中进行。
  3. 在步骤 3.2 期间配制新的 TCH 溶液（表 1），并通过 0.22-µm 滤膜过滤。
    注意：TCH 蒸气具有高毒性。所有操作均应在通风良好的通风橱中进行。
  4. 去除固定液，并在室温（RT）下用 1 mL 蒸馏水洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 将细胞置于 1 mL 前期配制并过滤的 TCH 溶液中，在室温下孵育 20 分钟。
  6. 在室温下用 1 mL 蒸馏水洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  7. 在室温下，将细胞再次暴露于 1 mL 2% 四氧化锇水溶液中，孵育 30 分钟。
  8. 去除固定液，并在室温下用 1 mL 蒸馏水洗涤三次，每次 5 分钟。加入 1 mL 1% 醋酸铀（水溶液），于 4 °C 避光过夜。
  9. 在室温下用 1 mL 蒸馏水洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  10. 将 Walton 铅天冬氨酸溶液（表 1）在 60 °C 烤箱中预热 30 分钟。
  11. 加入 1 mL 预热的铅天冬氨酸溶液对细胞进行染色，然后置于 60 °C 烤箱中孵育 30 分钟。
  12. 在室温下用 1 mL 蒸馏水洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  13. 在室温下依次用 2 mL 梯度乙醇溶液（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%）孵育，每步 20 分钟。
  14. 倾去乙醇，加入 1 mL 3:1 乙醇：低黏度包埋混合介质，在室温下孵育 30 分钟。
  15. 去除介质，加入 1 mL 1:1 乙醇：低黏度包埋混合介质，在室温下孵育 30 分钟。
  16. 去除介质，加入 1 mL 1:3 乙醇：低黏度包埋混合介质，在室温下孵育 30 分钟。
  17. 去除介质，加入 1 mL 100% 低黏度包埋介质，过夜孵育。
  18. 将样品包埋于 100% 低黏度包埋混合介质中，在 60 °C 孵育 24 小时。
  19. 使用超薄切片机制备 90 nm 厚的切片。
  20. 在透射电子显微镜（TEM）下以 200 kV 观察载网。

4. 用于扫描电镜成像的连续切片及在镀有氧化铟锡的盖玻片上的贴片

  1. 基底制备
    1. 将镀有氧化铟锡（ITO）的玻璃盖玻片（22 mm × 22 mm）在异丙醇中轻轻振荡清洗30–60秒。
    2. 取出盖玻片，沥干多余的异丙醇，并置于无尘环境中自然晾干。
    3. 使用等离子镀膜仪对镀ITO的玻璃盖玻片进行辉光放电处理1分钟。
      注意：等离子活化可使基底表面具有亲水性，从而在基底表面形成一层极薄的水膜，防止切片贴附于基底时产生皱褶。
    4. 将镀ITO的玻璃盖玻片插入基底支架中，并放入刀槽内。
  2. 样品块修整与连续切片
    1. 将样品块插入超薄切片机的样品夹中，并固定于修块位置。
    2. 使用剃须刀片将目标区域（见步骤2.6，图1D–G）周围的多余树脂切除，修整后的块面应呈梯形或矩形，前缘与后缘必须完全平行（图1H,I）。
    3. 将样品夹安装至超薄切片机的臂上，并将金刚石刀装入刀架。将ITO玻璃盖玻片插入带状收集器中，用把手夹紧收集器（图1J）。将收集器放入刀槽，并向刀槽中加入过滤后的蒸馏水（图1K）。
    4. 通过小心推动支架把手，调节收集器位置，使ITO玻璃边缘靠近刀刃（图1L）。
    5. 完成切片后，停止切片过程，缓慢打开管上的夹紧螺钉，排空刀槽中的水（流速控制为每秒一滴）。
    6. 完成带状切片收集后，使用夹紧装置的把手取下基底，并将切片带干燥（图1M）。

5. 扫描电镜成像及扫描电镜图像堆栈的对齐

  1. 使用导电胶带将镀有 ITO 的盖玻片固定在铝制样品台上。用导电胶带密封玻璃表面以及样品台上的表面，然后镀上一层 10 nm 厚的碳膜（图 1N）。
  2. 在场发射扫描电子显微镜（SEM）中以 5 kV 的低加速电压和适合背散射电子（BSE）高效收集的工作距离观察镀 ITO 的盖玻片。
  3. 使用虚拟堆栈选项将序列图像导入 Image J 软件（Fiji）13。新建一个 TrakEM14 项目，并将图像堆栈导入 TrakEM。单击鼠标右键，选择 align 菜单。
  4. 然后选择图像范围（从第一幅图像到最后一幅图像）。完成自动对齐后，保存对齐后的数据集，并选择 export 选项，从选定的图像范围（从第一幅图像到最后一幅图像）生成一幅平面图像。最后，在 Image J 主菜单中将平面图像数据保存为 AVI 格式。
    注意：补充视频 1 和 补充视频 2 分别展示了 SEM 图像堆栈和裁剪后的图像堆栈。

6. 从连续图像中分割线粒体和内质网

  1. 启动 IMOD15 软件中的 3dmod 并打开图像文件。
  2. 在 ZaP 窗口中，使用鼠标中键绘制线粒体和内质网的轮廓。
  3. 为可视化分割后的体积，打开 Model View 窗口（补充视频 3）。

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结果

图1描述了本实验方案的时间安排和工作流程。该方案需要7天完成；然而，根据扫描电镜（SEM）成像所花费的时间，总时长可能会有所延长。在进行细胞转染时，应控制细胞的融合度，避免细胞完全覆盖网格培养板的底部（图1A）。过高的细胞密度可能会影响在光学显微镜和电镜观察中对目标细胞的识别。我们使用了带有遗传标签的质粒，表达APEX2和HRP，以便从培养皿中大量培养的细胞中高效筛选出成功转染的细胞。我们培养了HEK293T细胞，并在共转染细胞中验证了SCO1连接的APEX2（线粒体膜间隙[IMS]）和HRP偶联的KDEL（内质网）的表达。在光学显微镜下，转染了APEX2的细胞呈现棕褐色染色，而未转染的细胞则未被染色（图1A和图2）。这使得我们能够识别出转染的目标细胞，并进一步利用DAB染色对培养细胞群体进行相关光镜-电镜（CLEM）分析（图3D-F和图4B）。在玻璃底表面做标记（图1B,C）有助于在平面包埋步骤中快速...

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讨论

利用电子显微镜（EM）在纳米级分辨率下确定特定蛋白质的细胞定位，对于理解蛋白质的细胞功能至关重要。通常，通过电子显微镜研究目标蛋白定位的方法有两种：一种是免疫金标记技术，自1960年以来已广泛应用于电子显微镜；另一种则是利用近年来开发的可遗传编码的标签技术16。传统的免疫金标记技术采用抗体偶联的金颗粒或量子点来显示标记蛋白的位置。然而，由于该技术依赖高质量抗体，且抗体的渗透效率会受到树脂包埋和固定剂的影响，因此其应用受到显著限制17。特别是，由于免疫金标记主要局限于未进行整体金属染色和强锇酸固定的超薄切片表面，该技术难以直接应用于现代三维电子显微镜（3DEM）技术18。为了将包括SBEM和阵列断层成像在内的现代3DEM方法与蛋白质标记相结合，本实验方案中采用了可遗传编码的电子显微镜标签。这类可遗传编码的标签在固定前即可定位于目标位点，因此无需进行透化处理、技术要求较高的超低温切片以及对单个切片进行免疫染色。

在三维电子显微镜（3DEM）中，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由韩国科学技术信息通信部资助的韩国脑研究所基础研究项目（19-BR-01-08）以及韩国国家研究基金会（NRF）由韩国政府（MSIT）资助的项目（编号：2019R1A2C1010634）支持。SCO1-APEX2 和 HRP-KDEL 质粒由首尔国立大学Hyun-Woo Rhee惠赠。透射电子显微镜数据在韩国脑研究所脑研究核心设施获取。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
戊二醛EMS16200仅可在通风橱中使用
多聚甲醛EMS19210仅可在通风橱中使用
二甲胂酸钠EMS12300
四氧化锇 4% 水溶液EMS16320仅可在通风橱中使用
Epon 812EMS14120EMbed 812 - 20 ml / DDSA - 16 ml / NMA - 8 ml / DMP-30 - 0.8 ml
超薄切片机 Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
醋酸铀酰EMS22400危险化学品
柠檬酸铅EMS17900
35 mm 带网格盖玻片培养皿MattekP35G-1.5-14-CGRD
电晕放电器PelcoeasiGlow
Formvar 碳膜铜网Ted Pella01805-F
盐酸SIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
甘氨酸SIGMAG8898
3,3′ -二氨基联苯胺 (DAB)SIGMAD8001危险化学品
30% 过氧化氢溶液Merck107210
六氰合铁(II)酸钾三水合物SIGMAP3289
0.22 µm 注射器滤器Sartorius16534
硫羰基二肼SIGMA223220仅可在通风橱中使用
氢氧化钾Fluka10193426
L-天冬氨酸SIGMAA9256
乙醇Merck100983
透射电子显微镜FEITecnai G2
氧化铟锡 (ITO) 涂层玻璃盖玻片SPI06489-AB易碎玻璃
异丙醇Fisher BioreagentsBP2618-1
金刚石刀LeicaAT-4
倒置光学显微镜NikonECLipse TS100
扫描电子显微镜ZeissAuriga

参考文献

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