使用微米级X射线计算机断层扫描结合磷钨酸染色技术可视化人纤维肌性组织

摘要

微型X射线计算机断层扫描技术在获取无损人体标本的三维信息方面具有显著效果，但在观察软组织时存在局限性。使用磷钨酸作为对比剂可解决这一问题。我们采用该对比剂对人体精细的纤维肌肉组织（眼轮匝肌支持韧带）进行了观察研究。

摘要

手动解剖和组织学观察是研究人体组织的常用方法。然而，手动解剖在处理过程中可能损伤精细结构 ，而组织学观察仅能通过横截面成像提供有限的信息。微型X射线计算机断层扫描（microCT）是一种在不破坏样本的前提下获取三维信息的有效工具。但该方法在区分软组织部分时效率有限。使用如磷钨酸（PTA）等增强对比度的试剂，可通过提高软组织对比度来解决这一问题。我们采用结合PTA的microCT技术来研究人眼轮匝肌支持韧带（ORL），该结构位于眼眶区域，极为精细。本方法中，获取的样本先用福尔马林固定，再经梯度乙醇溶液脱水，并用PTA溶液染色。染色后进行microCT扫描、三维重建与分析。利用此方法可清晰显示皮肤、韧带和肌肉。样本尺寸和染色时间是该方法的关键因素。适宜的样本厚度约为5–7 mm，过厚会导致处理速度减慢；最佳染色时间为5–7天，时间不足时中心区域偶尔会出现空洞。为在切割过程中保持小组织块的位置和方向，建议在各部分的相同区域进行缝合标记。此外，需进行初步的解剖结构分析，以准确识别每一块组织。可使用Parafilm膜防止样本干燥，但需注意避免造成样本变形。我们的多方向观察结果显示，ORL由连续板状结构组成的多层网状结构构成，而非先前报道的线状纤维。这些结果表明，结合PTA的microCT扫描有助于研究人体组织复杂结构中的特定区域。该方法可能对癌症组织、神经组织以及心脏、肝脏等各类器官的分析具有重要帮助。

引言

手动解剖和组织学观察通常用于检查人体组织，例如肌肉和结缔组织。然而，手动解剖容易损伤精细结构，而组织学观察仅能提供关于平面横截面的有限信息^1,2。因此，需要更优的方法以更精确、高效地检测组织。

常规计算机断层扫描（CT）在临床上普遍使用，但其难以区分微小结构^2,3。微型X射线CT（microCT）是一种有效获取样本中微小结构三维（3D）信息的工具，且不会破坏样本。然而，microCT的应用受到限制，因为只有致密组织能够被清晰成像，而无法用于区分软组织。为克服这一局限，可使用染色剂。对比增强剂（如磷钨酸（PTA）、磷钼酸和卢戈氏碘液）可在扫描过程中提高软组织的对比度^4,5。多项比较这些染色剂的研究表明，PTA表现出良好的成像效果且易于操作^6,7,8。

眼轮匝肌支持韧带（ORL）是眼眶周围的一种精细结构，在传统观察过程中容易受到损伤⁹。我们采用PTA作为对比剂，结合显微CT技术，对这一结构进行了观察，并成功获取了其三维信息。通过适当改进，该方法可应用于其他人体组织（如心脏和肝脏）的研究^10,11,12。

方案

本研究中使用的所有尸体均依法捐赠至延世大学医学院外科解剖教育中心。

1. 获取样品

1. 使用彩色铅笔在尸体上绘制切口线，以标示取材区域的切割范围。确保所画切口线内侧延伸至内眦，外侧至外眦，上方至下眼睑的上缘，下方则至眶缘连线以下1 cm处。
   注意：应根据显微CT设备的最大扫描尺寸来考虑样本大小（本研究所用设备可扫描的最大物体尺寸为7 × 7 cm）。此处从眼眶下缘区域（ORL）获取的样本大小约为宽1 cm、长3 cm、重1.25 g。
2. 沿所绘切口线用刀片切开面部组织。确保切口足够深，使刀尖触及骨面。所取样本必须包含皮肤、皮下组织、肌肉、脂肪以及骨膜。
3. 立即将样本置于10%福尔马林溶液中固定，并在室温下保存5至7天（图1A）。
   注意：本研究可使用经防腐处理的或新鲜尸体。然而，尸体所用固定液可能与生物学实验中常规使用的固定液略有不同。因此，即使样本来源于已防腐固定的尸体，仍建议再次使用10%福尔马林对样本进行固定。

2. 染色前准备

1. 固定后，将样品切成3块（厚度为5–7 mm）。在此过程中，切勿弄丢每块样品的位置和方向。
   注意：我们使用的微计算机断层扫描仪（microCT）最大可容纳7 cm³的样品，但如果样品过厚，磷钨酸（PTA）溶液将无法有效渗透。
2. 使用针和黑色缝合线缝合每块样品的上外侧，以便后续确认样品的方向。
3. 将样品依次置于30%、50%和70%的乙醇溶液中各1天，进行脱水处理。
4. 将样品置于70%乙醇中，直至染色前保存。

3. PTA 的制备

1. 在计划进行显微CT扫描的前一周开始PTA染色过程。
2. 准备210 mL 70%乙醇溶液，并加入2.1 g PTA粉末，使用摇床以55–60 rpm速度充分混匀。
   注意：PTA溶液在乙醇中的浓度应为1%。
3. 为每个切片准备三个 70 mL塑料容器 ，将容器中装满PTA溶液。将样本浸入容器中，并置于摇床上以促进有效渗透。浸泡5–7天（图1B）。
4. 染色完成后，将样本保存在70%乙醇中以备扫描。
   注意：染色后的样本可保存数月，但建议尽快扫描，以确保染色充分。

4. 显微CT扫描

1. 用封口膜包裹样品以防止干燥。不要包裹过紧，以免导致样品变形。
2. 打开扫描仪，将样品放置在载物盘上（图2）。
3. 设置扫描参数如下：源电压（kV）= 70，源电流（μA）= 114，铝滤光片 = 0.5 mm，图像像素尺寸（μm²）= 20，像素 = 2240 × 2240，曝光时间（ms）= 500，旋转步进（度）= 0.3。
   注意：可根据所用样品和/或扫描仪的不同对参数进行调整。
4. 开始扫描。
   注意：扫描时间约为30至60分钟，具体时长取决于目标分辨率和扫描仪速度。

5. 数据的重建与优化

1. 运行重建软件。在 操作 菜单中选择 打开数据集 以加载扫描文件。
2. 在 重建 窗口中选择 设置 选项卡。将参数设置如下：环形伪影减少 = 7，束硬化校正 (%) = 40。
   注意：可根据样品情况调整参数。
3. 在 开始 选项卡中选择 开始 以启动重建。 最终数据将存储在指定文件夹中。
4. 运行文件重设软件。选择 源数据集 以加载重建后的文件。
5. 在 目标数据集 选项卡中选择 jpg。
6. 选择 重设大小 选项 1/2，并选择 质量 选项为 无插值（快速）。
7. 在 图像压缩 选项卡中将滑动条调整至 100（最高），然后开始转换。
   注意：重设大小选项可避免三维渲染时计算机速度变慢；但若过度缩小，可能导致分辨率降低。建议缩小至一半，以在可接受的分辨率和操作效率之间取得平衡。

6. 三维重建

1. 运行三维体渲染软件。
2. 选择 操作 > 加载体数据 以打开数据集。
3. 在 传递函数编辑器 选项卡的直方图中，通过调整形状传递函数来修改亮度和对比度。
4. 选择 选项 > 光照。
5. 选中 阴影 和 表面光照 图标。这些效果可提供更逼真的模型质感。
6. 通过移动（单击并拖动）、旋转（右键单击并拖动）以及放大或缩小（滚动）模型，找到最佳视角。
7. 按住 Shift 键并朝内方向单击拖动切面平面（Shift + 单击并拖动），以显示断层图像（图 3）。
8. 打开 光照 图标，调节光照指示条，找到最佳观察光照效果，然后关闭该图标并关闭 光照 选项卡。
9. 选择 选项 > 显示 > 裁剪框，以隐藏最终图像中的框体。
10. 选择 操作 > 保存图像 以存储图像。

结果

通过PTA处理的显微CT实现了对眶韧带（ORL）的详细重建（图4）。在真皮层与骨膜之间斜向延伸的韧带状纤维肌性结构被清晰观察到（图4A）。在冠状面观（图4B）中，纤维的数量和复杂性向外侧逐渐增加。在水平面观（图4C）中，可见复杂的网状结构，呈树枝状分布。我们观察到的结构形态表现为连续的板状结构，而非此前报道的线状纤维。在矢状面观（图4D）中，ORL纤维的厚度自上而下逐渐减小。总体而言，这种多方位的观察证实，ORL由多层连续的板状结构组成的网状体系构成，其纤维数量和厚度随位置不同而有所变化。

讨论

我们采用PTA染色结合显微CT技术对人软组织进行检测。简言之，取材后的标本先用福尔马林固定数天，随后经梯度乙醇溶液脱水。若在福尔马林固定后直接将样本放入PTA溶液，可能因脱水过快而导致部分组织开裂，因此在PTA染色前需进行梯度脱水处理。接着，样本在PTA溶液中染色约一周时间。之后可进行显微CT扫描、三维重建与分析。本研究旨在利用该方法观察耳鼻喉（ORL）区域及其邻近结构。我们成功构建了组织的三维模型，皮肤、韧带和肌肉均得到清晰显示（图5）。

处理样本时应考虑多个因素，其中样本的尺寸和染色时间是主要关注点。经过多次预实验，我们发现样本的适宜厚度约为 5–7 mm，适宜染色时间约为 5–7 天。在此条件下，磷钨酸（PTA）溶液对样本的渗透速率约为 1 mm/天。若样本厚度超过 7 mm，处理时间将相应延长。当染色时间相对于样本体积不足时，最终图像中可能在样本中心区域出现空洞。这种情况常发生在皮肤层面，去除不必要的皮肤可提高染色效率。若染色时间过长，整个样本将过度染色，导致难以分辨各个结构区域。针对较大样本的最佳染色时间仍需进一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12-水合钨(VI)磷酸盐 磷钨酸	Junsei	84220-0410	PTA 粉末
CTvox	Bruker	ver 2.7	三维重建软件
Nrecon	Bruker	ver 1.7.0.4	重建软件
Skyscan	Bruker	1173	显微CT扫描仪
Tconv	Bruker	ver 2.0	文件缩放软件