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方法文章

免疫标记肌肉活检中的肌纤维变性

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DOI：

10.3791/59754

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2019年12月5日

 ,  ,  , 
1Inserm, Institut Mondor de Recherche Biomédicale, 2The Dubowitz Neuromuscular Centre, Molecular Neurosciences Section, Developmental Neurosciences Program, UCL Great Ormond Street Institute of Child Health

本文内容

摘要

本文介绍了一种对肌肉冷冻切片中坏死肌纤维进行直接免疫标记的实验方案。坏死细胞对血清蛋白具有通透性，包括免疫球蛋白G（IgG）。通过显示肌纤维对IgG的摄取，可识别并定量发生坏死的肌纤维，且不受肌肉状态的影响。

摘要

肌纤维坏死（肌坏死）在包括肌营养不良症在内的多种肌肉疾病发病机制中起着核心作用。针对肌营养不良症发病原因的治疗手段有望减轻肌肉退行性病变。因此，亟需一种能够检测并量化肌肉活检组织中细胞死亡程度的方法。传统原位观察肌纤维退变的方法要么定量能力较差，要么依赖于活体染料的注射。本文介绍了一种免疫荧光实验方案，通过检测肌纤维对免疫球蛋白G（IgG）的摄取来标记坏死的肌纤维。IgG摄取法基于坏死性细胞死亡的特征性细胞学变化，包括：1）细胞膜完整性丧失，导致损伤相关分子模式释放；2）血浆蛋白被肌纤维摄取。在小鼠肌肉横切面中，对肌纤维、细胞外基质蛋白和小鼠IgG进行共免疫标记，可清晰、简便地识别出处于坏死状态的肌纤维。该方法操作简单，适用于定量分析，可应用于包括人类样本在内的所有物种，且无需注射活体染料。此外，利用IgG摄取标记坏死肌纤维的方法还可与其他共免疫标记技术联合使用。

引言

横纹骨骼肌主要由肌纤维（myofiber）构成，这些肌纤维负责实现特征性的自主收缩功能。这些细胞是多核的、终末分化的结构，能够承受收缩过程中产生的机械应力。肌纤维膜（肌膜）及其细胞外基质的结构稳定性对于组织稳态至关重要。卫星细胞是成熟骨骼肌中主要的肌肉前体细胞群体，在健康肌肉中处于静息状态。当肌纤维死亡后，卫星细胞通过激活肌源性程序支持肌肉再生，该程序包括卫星细胞的活化、增殖、分化以及最终融合形成新的多核肌纤维。

肌纤维死亡可发生于多种肌肉疾病中，包括机械性创伤、缺血-再灌注损伤或肌营养不良症，并与死亡细胞的坏死形态相关1,2。坏死性死亡的特征是细胞膜通透性迅速增加，导致细胞内容物释放到细胞外环境3。其发生机制既可以是不依赖特定细胞信号通路的非调控过程（即意外性坏死），也可以是由细胞内信号通路介导的程序性过程（即调控性坏死）。在肌纤维中，调控性4和非调控性5机制均可导致坏死。肌坏死的典型后果是释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而激活强烈的炎症反应6。损伤后约48小时和72小时可观察到巨噬细胞的出现7。除了清除坏死碎片的作用外，巨噬细胞在肌肉再生过程中也发挥重要作用8,9。

肌营养不良症（MDs）是一组异质性病理疾病，通常由肌膜结构缺陷引起。杜氏肌营养不良症（DMD）是一种儿童期发病的X连锁疾病，全球范围内大约每3,500例男性新生儿中就有1例患病10，其病因是肌膜上缺乏抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达。DMD患儿的肌肉组织持续发生退变，导致严重的肌肉无力和早年死亡。由坏死性细胞死亡引发的炎症会加剧细胞毒性，并促进肌肉纤维化及肌肉功能丧失11,12。目前正处于临床试验阶段、针对肌肉退行性疾病根本病因的治疗方法（如基因治疗）有望减轻肌细胞坏死。因此，亟需简单且能准确量化肌肉退变程度的技术。

目前有多种常规方法用于体内监测肌纤维的丢失。通过检测血液中肌酸激酶（CK）的酶活性，可对肌肉和心肌组织中持续发生的坏死进行可靠定量。在组织原位，苏木精-伊红（H&E）染色是当前诊断中评估变性-再生重塑过程最常用的方法。然而，H&E染色标记死亡细胞的分子基础仍不明确。此外，H&E染色中提示肌纤维死亡的颜色变化相对细微，难以实现可靠且可重复的定量分析。诸如末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）等显示DNA片段化的方法，对坏死性死亡的标记并不完善3，且难以适用于多核细胞（如肌纤维）死亡的监测。注射活体染料（如伊文思蓝染料，EBD）是一种评估肌膜完整性丧失肌纤维的有效替代方法，但在某些实验方案中可能并不便利。例如，血液样本中EBD的存在可能干扰CK活性测定（一种比色法）的结果；此外，EBD的细胞内摄取也使共免疫标记变得困难。因此，开发一种能够直接标记正在发生坏死的肌纤维的新方法具有重要意义。

活性染料的作用机制依赖于坏死肌纤维细胞质膜完整性的丧失以及注射染料的被动摄取。类似地，坏死肌纤维会摄取血液中的蛋白质，例如白蛋白（EBD 对其具有强亲和力13,14）、免疫球蛋白 G（IgG）和 IgM15。因此，肌纤维内异常出现血液蛋白可作为原位肌坏死的便捷标志物。对这些蛋白进行染色可作为使用活性染料的替代方法。

通过使用IgG摄取作为原位肌坏死的标志物，本方案用于评估肌营养不良症（mdx）小鼠胫骨前肌（TA）中的肌肉变性情况。该方法相较于其他技术具有显著优势：1）操作简便且可重复性高；2）在肌肉取材前无需对动物进行任何预处理，例如注射循环性活体染料；3）与常规免疫标记一样，可兼容共标记实验。

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方案

实验按照法国及欧洲共同体相关法律法规进行（许可证编号：11-00010）。

1. 驴胶紫草胶的制备

  1. 在玻璃烧杯中，将 6 g 阿拉伯胶粉溶于 100 mL 去离子水中。用铝箔覆盖，静置至少 3 小时。由于混合物会迅速变得黏稠，需偶尔用金属刮刀手动搅拌。
  2. 将阿拉伯胶混合物置于水浴或烘箱中，在 60 °C 下过夜。小心密封烧杯以防止干燥。分装前至少搅拌一次。
  3. 分装后于 4 °C 保存，可稳定存放长达 2 周。

2. 肌肉组织采集

注意：本实验中，采用颈椎脱位法处死一只4周龄的雄性mdx小鼠。该操作无需麻醉，且符合当地法规规定的安乐死方法。

  1. 胫骨前肌（TA）的解剖
    1. 剃除小鼠腿部毛发后，将小鼠仰卧放置，并用针将其足部固定在软木板上。使用精细剪刀（或手术刀）和镊子，从足部向上至膝盖处剥离腿部皮肤，以充分暴露胫骨和胫骨前肌（TA）的全长。
    2. 用剪刀在胫骨与TA之间做一剪口，以便将TA从骨面分离，并便于抓握肌外膜。使用精细镊子小心地从TA表面去除肌外膜层。
      注意：从此步骤开始，TA更容易干燥，应避免干燥。
    3. 在踝部区域，用镊子将TA的肌腱与其他肌腱分离。轻轻上提TA肌腱，使其与胫骨及周围肌肉分离。
    4. 当TA肌腹完全游离后，提起肌腱，使仅TA肌肉的近端仍连接于膝部。尽可能靠近膝关节骨处，轻轻切断近端肌腱。
    5. 将TA置于用生理盐水轻微润湿的纱布中，防止在冷冻前发生干燥。
  2. 将70−100 mL异戊烷倒入塑料或聚四氟乙烯烧杯中，并通过部分浸入液氮进行预冷。持续冷却直至烧杯底部的异戊烷变为白色固体。
  3. 取一块圆形软木（20 mm × 11 mm × 8 mm），在其表面放置约0.5 mL的西黄芪胶。小心预先标记软木的另一侧，以便在冷冻后能准确识别组织样本。
  4. 用镊子将TA嵌入胶中，远端肌腱朝上。为获得合适的肌肉横切面，应使肌肉长轴垂直于软木表面。若组织样本未完全埋入胶中，冷冻切片的质量会更佳。确保至少有TA的一半（肌腱侧）不被胶覆盖。
  5. 迅速将带有嵌入肌肉的软木浸入未冻结的冷异戊烷液层中。注意软木会漂浮在液态异戊烷上。应将样本倒置，以便肌肉浸入异戊烷中。将样本在异戊烷中停留约2分钟，以确保完全冻结。
    注意：从此步骤起，TA必须始终保持冷冻状态直至进行冷冻切片。在长期储存于-80 °C冰箱前，应先将肌肉保存在干冰中。

3. 冷冻切片

  1. 将冷冻切片机温度设置为 -25 °C，保持样本温度约为 -20 °C。使用最佳切割温度（OCT）包埋剂将样本固定在冷冻切片机中。修片至肌腹部位后，切取 7−10 µm 的切片。
    注意：样本温度稳定至少需要 10 分钟。
  2. 用于收集冷冻切片的载玻片应保持在室温（RT）。每张载玻片上至少收集两个切片。肌肉切片接触温热的载玻片后会自动贴附并解冻。取出载玻片后，继续在室温下保存。
  3. 将切片置于通风环境中，在室温下干燥至少 20 分钟。
  4. 将载玻片上的冷冻切片于 -80 °C 保存，直至使用。

4. 免疫标记

  1. 在通风环境中室温下解冻载玻片，至少放置15分钟。
  2. 使用疏水性笔标记组织区域。待疏水屏障完全干燥。
  3. 在湿盒中用2%多聚甲醛固定组织10分钟。
  4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织切片，每次5分钟，共洗2次。
  5. 在湿盒中，用含10%山羊血清的PBS溶液封闭肌肉切片，室温孵育1小时。
  6. 在湿盒中，加入用5%山羊血清稀释的一抗溶液，室温孵育2小时（或4 °C过夜）。若仅需对肌纤维进行简单的IgG摄取标记，则仅使用兔抗小鼠广谱层粘连蛋白抗体孵育切片。
    注意：只要能够清晰标记肌纤维周围的细胞外基质，其他细胞外基质抗原也可作为靶标。只要所用抗体非小鼠来源，肌肉再生、炎症或其他参数的标记物可联合使用。用于分析的显微镜应具备额外的荧光颜色通道。
  7. 用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
  8. 在湿盒中，加入红色荧光标记的山羊抗兔IgG（H&L）多克隆二抗和绿色荧光标记的山羊抗小鼠IgG（H&L）多克隆二抗，室温孵育45分钟。
  9. 用PBS洗涤3次，每次10分钟。
  10. 用含100 ng/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的荧光封片剂封片，并加盖盖玻片。
  11. 4 °C避光过夜干燥后进行成像。

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结果

肌纤维周围环绕着含层粘连蛋白的细胞外基质。红色染色标记肌纤维的边缘，便于识别肌纤维。IgG 以绿色显示。细胞核经 DAPI 染色后在显微镜下呈蓝色，但此处显示为白色。图1）。在细胞外间隙中可观察到微弱的IgG免疫反应性，炎症情况下该反应性可能增强。肌纤维内的绿色染色提示IgG的存在。

Mdx小鼠的胫骨前肌（TA）在3周龄时表现为急性肌坏死的短暂阶段，随后出现不同步的变性-再生过程。因此，4周龄mdx小鼠的TA在同一横截面中常表现出异质性特征，包括受累轻微区域以及变性和再生区域共存的现象（图1a）。未受累或轻度受累的肌肉区域含有大小较大且均一的肌纤维，细胞核密度较低，主要位于肌纤维周边或肌纤维之间（图1b）。在...

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讨论

肌纤维坏死是正常肌肉在遭受创伤性运动后的常见后果。这种损伤通常可通过局部肌肉前体细胞强大的再生能力得到良好代偿。然而，在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中，由于慢性肌纤维坏死和过度纤维化，卫星细胞的再生能力受到损害。近期研究发现，肌纤维可通过坏死性凋亡（necroptosis）——一种受调控的坏死形式——发生死亡。更具体而言，抑制坏死性凋亡可能成为杜氏肌营养不良症（DMD）治疗的一种新策略4。研究肌肉变性疾病中的细胞死亡通路，需要可靠的肌肉细胞死亡定量方法。本实验方案描述了一种免疫荧光技术，即通过检测免疫球蛋白G（IgG）摄入来标记发生坏死的肌纤维。

以细胞膜完整性丧失为特征的坏死会导致损伤相关分子模式的释放以及血浆蛋白（如白蛋白、IgG 和 IgM）的摄入15。IgG 摄入标记方法的作用机制与伊文思蓝等活体染料相似。坏死的肌纤维通透性增加，可截留血液蛋白或注射的活体染料，而活细胞则不能。该技术的概念验证已由 Kevin Campbell 团队在肌营养不良症（MDs）中得到验证

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 Association Française contre les Myopathies 通过 Translamuscle 项目资助。作者感谢 Perla Reyes-Fernandez 博士和 Matthew Borok 博士对稿件的仔细审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
圆形软木片Pyramid InnovationR30001-E请务必清楚标记软木片，以便在冷冻后仍能确定样本编号
冷冻切片机LeicaCM3050 sn34肌肉冷冻切片应在 -20 至 -25°C 之间进行。厚度：7–10 微米。
DakopenDakoS2002在肌肉切片周围形成疏水屏障，防止孵育过程中介质扩散
镊子FST91117-10/
山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体，Alexa Fluor Plus 488ThermoFischer ScientificA-11029稀释比例：1/500
山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体，Alexa Fluor Plus 594ThermoFischer ScientificA32740稀释比例：1/500
山羊血清Jackson ImmunoResearch005-000-121封闭步骤中使用 PBS 配制的 10% 稀释液；抗体孵育时使用 PBS 配制的 5% 稀释液
异戊烷Sigma Aldrich78-78-4冷冻介质。应将盛有异戊烷的烧杯置于液氮中冷却
mdx 小鼠Jackson LaboratoryC57BL/10ScSn-Dmdmdx/Jmdx 小鼠的抗肌萎缩蛋白基因发生突变。自三周龄起，其肌肉即表现出慢性变性特征
显微镜ZeissImager.D1/
OCT 包埋剂CellpathKMA-0100-00A包埋基质
多聚甲醛（PFA）ThermoFischer Scientific28908用于冷冻切片的固定（可使用 2% 或 4% 的 PFA）
PBSEurobioCS3PBS00-01免疫标记的稀释介质
精密剪刀FSTfst 14001-12 和 fst 14001-14用于肌肉组织取材
兔抗小鼠广谱层粘连蛋白抗体Sigma AldrichL9393稀释比例：1/1000
刺梧桐胶Sigma AldrichG1128分装保存于 +4°C

参考文献

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