一种低成本的气味-奖赏关联任务，用于学习与记忆测试

摘要

采用气味-奖赏关联学习任务，研究生理操作对长期记忆和短期记忆的不同影响。

摘要

稳健且简单的趋近性关联记忆行为范式，对于研究记忆的细胞与分子机制的科研人员至关重要。本文介绍了一种高效且低成本的小鼠行为学实验方案，用于检测生理干预（如药理学试剂的灌注）对气味-奖赏记忆学习速率及记忆持续时间的影响。文中提供了代表性实验结果，该研究探讨了酪氨酸激酶受体活性在短期记忆（STM）与长期记忆（LTM）中的不同作用。雄性小鼠被训练以将奖赏（糖颗粒）与两种气味中的一种建立关联，并在训练后2小时或48小时测试其对该关联的记忆。在训练开始前立即向嗅球（OB）内灌注酪氨酸激酶（Trk）受体抑制剂或对照溶剂。尽管灌注对学习速率无显著影响，但在嗅球内阻断Trk受体选择性地损害了长期记忆（LTM；48小时），而未影响短期记忆（STM；2小时）。这种长期记忆的损害归因于气味选择性的降低，表现为挖掘时间的延长。本实验结果综合表明，嗅球内Trk受体的激活是嗅觉记忆巩固的关键环节。

引言

关联记忆形成的机制此前主要基于单次恐惧条件反射研究进行探讨。然而，许多日常任务通常具有更复杂的习得模式，并依赖于反复接触。本实验方案的目的是提供一种经济高效的啮齿类动物行为范式 ，用于研究多次尝试性奖赏学习与记忆的细胞和分子机制。

依赖主嗅球（OB）的嗅觉学习为多试次奖赏性记忆的研究提供了若干优势。首先，依赖OB的记忆具有不同的持续时间（短期记忆、长期记忆和中间期记忆¹），并依赖于与大脑其他区域相同的分子^2，3和结构机制，包括神经调制⁴、长时程增强⁵以及成年神经发生^6，7，8。其次，与海马等高级脑区相比，依赖OB的记忆使得研究者能够更直接地观察感知环境的人为操控与负责学习的神经环路变化之间的对应关系^{8，9，10，11}。本文详细描述了一种可用于研究普遍性分子和结构机制的依赖OB的联想学习与记忆范式。该范式旨在使研究者能够利用嗅觉学习的优势，深入探究记忆的细胞与分子机制。

在我们最近的出版物³中，采用本方案证明了趋近性气味学习的巩固依赖于嗅球内 Trk 受体的激活。在下述方案中，还讨论了可根据不同实验需求调整行为范式的相关环节。

本研究共使用了27只8周龄（插管时年龄）的成年雄性CD-1小鼠。有关具体的分组分布和气味集的使用情况，请参见我们先前发表文章的方法部分³。选择雄性小鼠是为了避免雌激素水平的大幅波动，因为先前的研究¹²表明，嗅觉记忆会随着雌激素水平的升高而增强。这些小鼠始终维持在12小时光照/12小时黑暗的反向光暗循环条件下，并可自由获取饮水。在行为实验期间，小鼠的饮食 受到限制，以维持其自由进食体重的约90%。饮食限制从行为实验开始前3天起实施。如下文所述，同一批小鼠会被呈现不同的气味集，以便在尽量减少动物使用数量的同时达到适当的统计功效。统计分析部分将说明如何校正由此可能引入的随机变异。

方案

以下方案遵循厄尔汉姆学院动物护理与使用委员会（IACUC）的动物护理指南。

1. 嗅球套管植入

注意：这些手术不需要无菌技术，因为它们不需要做大切口。然而，各个机构的要求可能有所不同。如果实验人员在免疫缺陷小鼠品系上进行此类手术，可能需要额外考虑。总之，建议实验人员在使用本方案前与兽医和动物护理团队进行讨论，并在每次手术之间清洁和消毒所有工具。

1. 在准备过程中，将套管和螺钉浸泡在含有32%氯己定的小烧杯或培养皿中，以保持其消毒状态。
2. 使用纯氧中含4%异氟烷的气体麻醉小鼠，并将其固定于立体定位仪中。 手术期间，通过鼻罩持续供给1.5–2%异氟烷以维持麻醉状态。全程监测呼吸情况，并使用眼膏防止麻醉期间眼睛干涩。
3. 当小鼠被固定且对后肢足部施加有力夹捏无反应时，用32%氯己定擦拭头部顶部，清洁切口区域。
4. 随后，沿头侧至尾侧方向用利多卡因（局部镇痛剂）擦拭头部表面。
5. 用力压紧，使用洁净的手术刀片沿中线做一单一切口。
6. 使用连接于立体定位仪的钻头，在嗅球上方钻两个孔，用于植入引导套管（26 G），定位坐标为相对于前囟AP +5.0 mm，ML ±0.75 mm。
7. 在小脑结构上方钻两个孔。
   注意：这些螺钉的位置无需精确，但应确保沿中线对称分布。
8. 将螺钉插入小脑结构上方的两个孔中，并使用组织粘合剂将螺钉固定于颅骨上。
9. 利用立体定位仪将引导套管（26 G）插入步骤1.6中钻好的嗅球上方孔洞中，将套管下降DV 1.0 mm。
10. 在培养皿中混合牙科水泥，用小金属铲缓慢将牙科水泥堆砌在套管周围，静置5秒使其初步干燥。然后小心移除立体定位仪的夹持臂，注意避免拉出引导套管。继续将牙科水泥覆盖整个切口区域，直至形成一个小帽状结构（见图1A）。
11. 此时将假插塞插入引导套管中，以防堵塞。
12. 手术后立即注射酮洛芬（0.2 mg/kg）和生理盐水（200 µL）以减轻疼痛并补充水分。术后为小鼠提供软化食物或水凝胶。在小鼠恢复意识并能维持胸卧位之前，不得无人看护。
    注意：此后小鼠应单独饲养。
13. 手术后连续两天每天注射一次生理盐水（200 µL）和酮洛芬（0.2 mg/kg）。
14. 术后2至5天内（视需要）每日称量小鼠体重并监测其变化。若体重在两到三天内未能恢复至术前水平，应咨询兽医以确定合适的喂养方法。
15. 在开始行为训练前，至少让小鼠恢复7天。

2. 联合辨别任务

1. 输注
   1. 向小鼠给予针对嗅球的特异性灌注，灌注物为酪氨酸激酶受体抑制剂 K252a（50 μM；5% DMSO 生理盐水溶液）或对照溶剂（5% DMSO 生理盐水溶液），操作步骤如下。
      1. 将输注液双侧注入小鼠的嗅球。使用双通道注射泵，每侧嗅球输注终体积为2.0 µL，输注速率为0.2 µL/min，总输注时间为10 min。
         注意：操作时间可根据正在进行的行为学研究类型进行调整。灌注的具体步骤因注射泵型号而异，详见制造商提供的使用手册。
      2. 注射完成后，需将注射器在套管内保留约5分钟，以防止回流并促进药物扩散。（即每次输注总时长应规划为15分钟）。
2. 气味集合。
   1. 用基于蒸气压预先计算的比例，将所有气味物质用轻质矿物油稀释至分压为1.0 Pa表1).
   2. 使用5组不同的气味对 表1 （表中数值表示在50 mL矿物油中混合以达到1.0 Pa黏度所需的体积，单位为µL）。
   3. 为准备行为学步骤（第2.3和3节）中使用的加香沙子，将第2.2.2步中制备的1.0 Pa气味剂每400 µL与100 g儿童玩沙混合。
3. 塑形
   注意：小鼠应按照下述方法进行为期10天的训练。
   1. 将小鼠带入操作室，在术后恢复的前两天内，每天抓取并处理10分钟。
   2. 第3天，将一个装有含(+)-柠檬烯气味的沙子的培养皿放入小鼠的饲养笼中，并在其中放入约10粒蔗糖颗粒，每粒质量为5 mg。
      注意：使用1.0 Pa的(+)-柠檬烯（将102 µL溶于50 mL矿物油中）作为奖励性气味，以纯矿物油（测试气味的稀释剂）作为非奖励性气味。建议选用单分子气味剂，因其对小鼠而言最可能具有新颖性。
   3. 第4天补充沙子和颗粒。
   4. 在第5天和第6天，将小鼠放入自制的行为学装置中，使其适应环境，允许其探索装置空间。图1B，C）。使用标准的饲养笼，以及聚甲基丙烯酸甲酯制作两个盖子和一个黑色中央隔板。确保盖子和中央隔板均比饲养笼大1-2 cm。
   5. 准备一个含有柠檬烯香味沙子的培养皿和另一个含有矿物油沙子的培养皿。在第5天和第6天适应后，将两皿沙子均放入测试箱中，并将10粒蔗糖颗粒混入含有柠檬烯香味的沙子皿中作为奖励物。将每只小鼠放入测试箱中10分钟，使其自由探索并摄取奖励颗粒。
   6. 第7天，将含有柠檬烯气味和矿物油气味沙子的培养皿放入行为学装置中，向小鼠介绍最终测试程序的简化版本。此次实验需加入中央隔板。
      1. 将单个奖励物放在带有柠檬烯气味的沙子上方，并将小鼠放入休息室。
      2. 将小鼠放入休息室后，提起中央隔板，使小鼠进入测试室，以探索并挖掘盛有沙子的培养皿。在小鼠取回奖励颗粒后，或5分钟时间结束后，将其放回休息室。
      3. 对每只小鼠重复此过程，共进行10次试验。使用随机数生成器平衡奖励碟片在左侧或右侧的位置。试验之间不设置休息间隔。
   7. 第8天，重复第7天的实验操作，但需逐渐将颗粒埋入沙中更深的位置。
      注意：大多数小鼠在第10天时应已开始挖掘寻找隐藏的奖励颗粒^th 第8天的试验。
   8. 第9天，将每只小鼠的实验次数增加至20次，每次实验将蔗糖颗粒完全埋入垫料中，并让小鼠在测试箱中适应1分钟。每次试验中允许小鼠在两个培养皿中挖掘以获取奖励。
   9. 第10天，对每只小鼠重复进行20次试验，但如果小鼠在进入有奖励的培养皿前挖掘了无奖励的培养皿，则立即开始下一次试验。对于首先挖掘有奖励（柠檬烯气味）培养皿的小鼠，允许其取出奖励颗粒后再将其送回休息室。

3. 训练与测试

注意：一旦小鼠开始稳定地挖掘寻找那些不可见但有气味线索提示的奖赏颗粒，即可开始实验。

1. 培训
   注意：训练阶段在完成塑形后两天开始，每只小鼠进行20次试验。训练开始前, 立即进行颅内给药/溶剂输注（输注细节参见第2.1节），并在输注后立即开始训练。
   1. 将一只小鼠放入静息室。
   2. 在测试室中放置两个装有掺入新气味对的沙子的培养皿，其中一个培养皿中埋藏有食物奖励颗粒。
   3. 测试室准备就绪后，抬起不透明隔板，将小鼠放入测试室中。若小鼠首先在无奖励的食盘中挖掘，应立即将其放回休息室（将此类试验记录为一次 "0"）。如果小鼠首先挖掘有奖励性气味的区域，允许其取出食丸并返回休息室。将此类试验记录为 "如果试验持续1分钟且小鼠未取回奖励，则将小鼠送回休息室。
   4. 清洗并重新装填培养皿，开始下一次试验。重复上述步骤共20次。
2. 测试
   注意：记忆测试的时间可根据研究者的兴趣进行调整。在本实验中，基于对 K252a 对短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）差异性影响的关注，分别在训练后 2 h（STM）和 48 h（LTM）对两组不同的小鼠进行测试。
   1. 使用与训练阶段所述相同的气味和程序进行测试（第3.1节）。
      注意：根据研究问题的不同，研究人员可能需要设置对照组。例如，在之前发表的实验中，研究了Trk受体阻断对记忆巩固的影响³因此，在48小时测试前，对照组预先灌注K252a，以证明观察到的效应并非由干扰记忆提取所致。
3. 统计分析
   注意：每一步的 SPSS 22.0 语句均作为 补充文件 例如。
   1. 使用线性混合效应分析进行统计分析。 与方差分析（ANOVA）不同，线性混合效应模型能更有效地处理随机效应和重复测量。
   2. 计算因变量： "正确率。” 回顾 3.1.3 节中的内容， "1”被分配给小鼠首先挖掘奖励性气味的试验，而一个 "如果小鼠首先在无奖励气味处挖掘，则记为0分。每五次试验取平均值，形成四个试验区块（TB；例如，试验区块1或TB1为第1-5次试验的平均值，试验区块2或TB2为第6-10次试验的平均值，依此类推）。
   3. 将自变量或固定效应设置为药物组（K252a 或 Vehicle；见 2.1.1 节）和试验区块（来自 3.3.1）。在下文的代表性结果中，已明确说明每次分析所使用的变量。
   4. 包括个体小鼠以及嵌套于小鼠内的气味集合 "随机效应，以校正小鼠固有的行为差异以及使用多组气味带来的任何影响。
   5. 对正确率进行logit变换。
      注意：正确率并非连续且无界的因变量，因此违反了线性模型的两个假设。为此，需进行logit变换。
   6. 使用估计边际均值对全模型识别出的显著交互作用进行事后检验；事后检验中的多次两两比较必须进行校正，通常采用Bonferroni或Šidák法。

结果

如上所述，本方案使研究人员能够评估某种干预对学习、短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）的影响。此处展示了 Tong 等人 2018³ 的示例结果。结果支持以下假设：Trk 受体阻断可选择性抑制长期记忆（LTM），但不影响学习或短期记忆（STM）。

图 2A 展示了训练、短期记忆（STM）测试和长期记忆（LTM）测试的示意图。首先，结果显示 K252a 灌注并不影响气味-奖励关联的学习速率。图 2B（第 3.1 节）展示了 K252a 组和溶剂对照组在训练阶段的学习速率。采用线性混合模型进行统计分析，固定效应包括药物组别和试验区块（TB）；小鼠个体以及嵌套于小鼠内的气味集合作为随机效应。测试阶段的数据（第 3.2 节）未纳入该分析。结果显示试验区块存在显著的主效应（F(3, 183.692) = 43.735，p < 0.001），但药物组别无显著效应（F(1, 85.685) = 0.132，p = 0.717），且无显著交互作用（F(3, 183.692) = 0.111，p = 0.954）。事后检验采用 Šidák 校正，证实 K252a 组与溶剂对照组在训练期间各试验区块之间均无差异（所有比较的 p > 0.05）。TB2、TB3 和 TB4 均显著高于 TB1（所有情况下的 p ≤ 0.001），表明两组均在 20 次训练试验结束时成功学会了气味-奖励关联。

接下来，为了检验灌注对短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）的影响，进行了相同的分析，并纳入了测试阶段的数据（第3.2节）。结果显示药物组与试验区块之间存在显著的交互作用（F(2, 77.558) = 4.043，p = 0.021），但药物组（F(1, 55.629) = 1.438，p = 0.236）和试验区块（F(2, 69.979) = 1.360，p = 0.263）的主效应均不显著。为了专门考察记忆表现，采用Šidák校正进行事后成对比较，分析训练最后一阶段（第3.1节）与测试第一阶段（第3.2节）之间的差异，后者分别在训练后2小时（STM）或48小时（LTM）进行。对于灌注溶剂的小鼠，比较结果显示在训练后2小时和48小时均保留了关联性记忆（所有与训练表现相比的比较中，p > 0.05）。对于灌注K252a的小鼠，训练后2小时测试的第一试验区块（STM）与训练的最后一个试验区块相比无显著差异（p > 0.05）；然而，其在48小时后的记忆表现显著降低（p = 0.018）。此外，48小时测试时的记忆表现显著低于2小时测试时的表现（p = 0.009），也显著低于溶剂组在48小时测试时的表现（p = 0.006）。灌注溶剂小鼠与灌注K252a小鼠之间的短期记忆无显著差异（p = 0.356）。综上所述，结果表明在嗅球中通过K252a抑制Trk受体选择性地破坏了长期气味记忆，但不影响短期记忆（图3）。

气味组	气味 1	气味 2
1	pentanoic acid	butanoic acid
	225.1	63.6
2	hexanal	heptanal
	11.1	35.3
3	propyl acetate	butyl acetate
	3.1	10.9
4	2-octanone	2-heptanone
	87.4	28.7
5	pentanol	hexanol
	37.2	127.3

表1：气味组合的混合体积。 每一行显示可作为行为实验步骤中成对使用的两种气味。例如，要使用第一组“气味组合”，需配制戊酸和丁酸的混合物。表中的数值表示为达到每种气味1.0 Pa浓度，需在50 mL矿物油中加入的体积（µL）。在训练和测试过程中，一个培养皿用戊酸加香，另一个用丁酸加香。

图 1：套管植入位置及行为实验装置。（A）显示套管、牙科水泥帽和螺钉相对于小鼠头部的相对位置。注意，套管的针头插入两个嗅球内，套管基座本身嵌入牙科水泥帽中。螺钉固定于小脑区域颅骨上钻出的两个孔中。螺钉不接触脑组织本身，但可作为牙科水泥帽的尾端锚定点。图中所示尺寸用于制作水泥帽。（B）显示组装完成的行为实验装置。主体为标准的小鼠饲养笼。笼盖由聚甲基丙烯酸甲酯（亚克力）制成，上面打孔以通风。中央隔板也由黑色亚克力材料制成。笼盖应使用足够厚重的亚克力板，以便在实验过程中作为轨道，使中央隔板能够被提起和放下。（C）显示行为实验装置的一侧。注意中央隔板略高于笼体，便于操作。培养皿盛装的沙子可沿边缘放置。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：研究设计与学习结果。（A）显示研究设计的示意图。请注意，STM 和 LTM 组是相互独立的（即不同组的小鼠）。区块起始处的符号表示给药灌注的时间点。（B）显示训练期间第 1–20 次试验的正确率。结果表明，K252a 组与对照溶剂组的学习速率（曲线斜率）无显著差异。误差条表示平均值的标准误（SEM）。星号表示与 TB1 相比，对照溶剂组和 K252a 组的正确率均显著提高（所有比较的 p ≤ 0.001）。本图经许可改编自 Tong 等人 2018 年的研究³。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：Trk受体阻断对短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）的不同影响。显示训练阶段第4个试验组块（Trial Block 4）以及短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）测试第1个试验组块的正确率。即采用线性混合模型，比较训练阶段最后一个试验组块（图2；Training-TB4）与短期记忆（2小时测试）和长期记忆（48小时测试）测试第一个试验组块（Testing-TB1）期间的正确率。该线性混合模型包含两个固定效应：药物组别和试验组块（Training-TB4、STM-TB1、LTM-TB1），随机效应为小鼠个体以及嵌套于小鼠内的气味组合。事后比较发现，K252a处理小鼠的长期记忆显著受损（与训练阶段TB4比较；p = 0.018），但短期记忆未受影响（p > 0.05）。注入K252a的小鼠在长期记忆测试中的表现也显著低于其自身的短期记忆表现（p = 0.009），且显著低于对照溶剂（vehicle）小鼠的长期记忆表现（p = 0.006）。误差线表示标准误（SEM）。本图经许可改编自Tong等，2018³。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件：用于统计分析的语法。 请点击此处下载该文件。

讨论

一次性恐惧条件反射是一种研究记忆分子和细胞动态的强有力行为范式，但许多自然学习过程是渐进式的，最好通过上述范式进行建模。我们课题组先前的研究表明³，在嗅球（OB）中抑制 Trk 受体可阻断多试次奖赏性学习范式中的嗅觉记忆巩固。该发现为研究神经营养因子等分子机制在奖赏性与厌恶性学习中不同的作用时间点开辟了新的研究途径。

本实验包含两个关键部分：（1）插管手术和（2）关联性辨别任务（进一步分为塑造期、训练期和测试期）。实验人员可根据具体的研究问题调整本方案。例如，我们的研究主要关注嗅球（OB），而该已建立的方案可轻松应用于其他嗅球相关研究。对于关注其他脑区的研究人员，应在预实验中验证给药部位。此外，实验人员还需考虑所注射物质的扩散速率、空间渗透范围以及生物活性持续时间。

本方案中所述的训练步骤已被本方案作者广泛使用。严格遵循所述步骤，似乎对于使小鼠及时学会任务至关重要。若采用其他时间安排，作者观察到小鼠对任务的熟悉程度存在更大差异，这意味着需要额外的训练，才能使所有小鼠达到使用实验气味进行测试的标准。在训练和测试过程中，研究人员可根据自身研究兴趣，灵活调整试验次数、实验气味的浓度以及气味之间的相似性。我们建议在可能的情况下使用多组气味，如我们所述，以减少实验所需的动物数量。有关如何在最终分析中考虑使用多组气味的指导，请参见统计分析部分。原则上，可通过改变气味对的相似性来调节辨别难度。在我们课题组先前发表的研究³中，气味对由属于相同官能团但碳链长度相差一个碳原子的两种气味分子组成。此类辨别任务比碳链长度相差两个或以上碳原子的气味对更难，但比对映异构体（例如，(+)-柠檬烯和(-)-柠檬烯）更容易。不同官能团的气味分子在感知上差异显著。Cleland 等人¹³进一步讨论了更多刺激变量及其对特定学习参数的影响。

该方案的一个主要局限性在于，与可并行测试多只动物的自动化关联学习任务相比，执行所需时间要长得多。对于单次测试，一名研究人员至少需要20分钟才能完成一只小鼠的20次试验。然而，正是由于缺乏自动化，使得该方案在经费上更具可及性，这对许多机构而言是一个优先考虑的因素。重要的是，在本实验中发现，该方案在培训对行为神经科学感兴趣的学生研究人员方面具有很高的可操作性和有效性。特别是，这些学生在获得科研参与通常带来的益处之外，还能发展出扎实的动物操作技能。

对采用该范式感兴趣的研究人员可以调整多个参数。最明显的是，对机制的药理学操控具有多样性，该行为学方案可与化学遗传学技术或多种其他调控分子与细胞通路的方法（例如光遗传学）结合使用。该范式本身也可进行调整，以改变所测试的学习与记忆类型。例如，研究人员可以调节所呈现两种气味之间的相似性，以控制学习速率。在我们的研究³中，气味对由同一官能团的两种气味分子组成，彼此之间仅相差一个碳原子长度。这类辨别任务比相差两个或更多碳原子长度的气味对更困难，但比对映异构体（例如 (+)-柠檬烯和 (-)-柠檬烯）更容易。来自不同官能团的气味分子在感知上差异显著。Cleland 等人¹³进一步讨论了更多刺激变量及其对特定学习参数的影响，结论是气味越相似，越难以区分，因此需要更长时间才能学会¹⁴。这些操控也会影响记忆的强度。在此基础上，研究人员可能希望在学习后的不同时间点测试记忆表现。例如，两项研究^15,16探讨了BDNF在单次试次厌恶学习任务中长时记忆（LTM）维持中的作用。BDNF是TrkB的配体。研究发现，在学习后12小时向海马体灌注抗BDNF反义寡核苷酸，可阻断7天后的长时记忆，但不影响2天后的记忆。该研究表明，初始学习后分子机制的时间尺度在长时记忆中发挥着有趣但尚未被充分理解的作用。本文所描述的行为学方案可用于探究这些时间尺度。未来应用中其他值得关注的参数包括所使用的小鼠模型。例如，在未来的研究中，可以用雌性小鼠替代雄性小鼠（雄性小鼠的神经生物学特性已被更广泛地研究）¹⁷，以考察学习速率、短时记忆（STM）和长时记忆（LTM）的性别差异，因为雌性哺乳动物对气味的敏感性和分辨能力高于雄性哺乳动物¹⁸。当然，该方案也可有效应用于各类疾病相关的啮齿类动物模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双导管套管	PlasticsOne	C235GS-5-1.5/SPC	定制订单
(-)-柠檬烯	Sigma-Aldrich	218367-50G
(+)-柠檬烯	Sigma-Aldrich	183164-100ML
2-丁酮	Sigma-Aldrich	537683
2-辛酮	Sigma-Aldrich	O4709
5mg 蔗糖颗粒	测试饮食	1811560	自定义尺寸。用于奖励
丁酸	Sigma-Aldrich	B103500
乙酸丁酯	Sigma-Aldrich	402842
牙科水泥粉（珊瑚）	A-M Systems	525000
牙科水泥溶剂	A-M Systems	526000
双连接器组件	PlasticsOne	C232C
双假性套管针	PlasticsOne	C235DCS-5/SPC 假体双联	定制订单
双注射器	PlasticsOne	C235IS-5/SPC	定制订单
钻孔	Kopf Instruments	Model 1474 高速立体定位钻机	此操作需要额外的 "适配器" 通过用实验室胶带包裹钻头以增加其周长，从而使其适配特定的钻头夹具。对于需要无菌操作的手术，此方法可能不适用。
眼膏			从当地药店购买
图1 插图软件	BioRender
庚醛	Sigma-Aldrich	W254002
己醛	Sigma-Aldrich	115606
己醇	Sigma-Aldrich	H13303
输液泵型号 11	哈佛仪器公司	4169D	可通过美国仪器交易所获取二手泵
异氟烷	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx	订购需提供兽医处方
K252a	Sigma-Aldrich	K2015	混合至 DMSO（5%）中，终浓度为 50 μM
酮洛芬	Allivet	25920	订购需提供兽医处方
利多卡因	Aspercreme		购自亚马逊
安装螺钉	PlasticsOne	00-96 X 3/32
小鼠麻醉面罩	Kopf Instruments	Model 907 小鼠麻醉面罩	与立体定位仪联用，可在小鼠处于立体定位状态下提供氧气和麻醉气体
小鼠鼻部适配器	Kopf Instruments	Model 926 小鼠适配器	与立体定位仪配合使用，以固定小鼠头部。
诺瓦尔桑	Jeffers	41375
戊酸	Sigma-Aldrich	240370
戊醇	Sigma-Aldrich	138975
玻璃底培养皿	VWR	10754-804
聚碳酸酯笼盒é 底部	Ancare	N10PCSEC	使用普通饲养笼，并在笼子中部定制安装一条轨道，用于固定不透明的亚克力隔板
丙酸丙酯	Sigma-Aldrich	537438
Quikrete 优质儿童沙			从当地五金店购买
生理盐水	洞察针	N/A	用于药物配制的无菌生理盐水
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 902 小动物脑立体定位仪
测试室	Ancare	N10PCSEC	我们的测试舱是利用常规的小鼠饲养笼进行改造的。文稿中详细描述了具体操作过程。
Vetbond 组织粘合剂	3M		购自亚马逊